Взаимодействие чумного микроба и его антигенов с клетками крови человека in vitro

Актуальность проблемы. Чума по-прежнему представляет реальную угрозу для мирового сообщества, о чем свидетельствуют эпидемические осложнения, связанные с активацией ее возбудителя в природных очагах Индии, Мадагаскара и ряда других стран в конце XX — начале XXI веков, а также данные о возможном использовании чумного микроба биотеррористами в качестве ПБА [Онищенко Г. Г., 2003; Кутырев В. В., Куличенко А. Н., 2004; Грижебовский Г. М., 2006; Weir Е., 2005; Calhoun L.N. et al., 2006; Zhou D. et al., 2006; Richard J.L., Grimes D.E., 2008; Smiley S.T., 2008]. Опасность распространения чумы на территории России, а также граничащих с Россией государств, требует решения актуальной проблемы совершенствования средств ее специфической профилактики и лечения.

Создание новых эффективных противочумных вакцин и снижение смертности среди заболевших чумой людей связывают с дальнейшим изучением молекулярных механизмов взаимодействия возбудителя чумы и его антигенов с клетками врожденного иммунитета организма хозяина. На модели чумного сепсиса у мышей, а также в опытах in vitro с лейкоцитами крови лабораторных животных, установлена способность чумного микроба к избирательному подавлению ключевых функций этих клеток (секреция цитокинов, фагоцитоз, ранний апоптоз и другое), лежащих в основе первой линии клеточной антибактериальной защиты, развития местной защитной воспалительной реакции и последующего формирования в организме адаптивного иммунитета [Titball R.W. et al., 2003, DeLeo F.R., Hinnebusch B.J., 2005; Bosio C.M. et al., 2005].

Анализ литературы за последнее десятилетие свидетельствует, что исход взаимодействия чумного микроба с клетками врожденного иммунитета организма хозяина уже не может рассматриваться лишь с позиций определения показателей завершенности или незавершенности лейкоцитарного фагоцитоза. Необходимо изучение повреждающего эффекта на клетки периферической крови чумных микробов, обладающих устойчивостью при температуре 37 °C к поглощению и киллингу полиморфноядерными лейкоцитами и моноцитами. Взаимодействуя с поверхностью клеток крови организма хозяина, внеклеточно размножающиеся бактерии секретируют в цитоплазму фагоцитов и лимфоцитов цитотоксические белки (Yersinia outer proteins), кодируемые плазмидой вирулентности, что запускает массовую гибель лейкоцитов по типу апоптоза и лейкоцитолиз на стадии генерализации чумного инфекционного процесса. Однако, цитотоксические свойства устойчивых к фагоцитозу чумных микробов недостаточно изучены. Существенные различия в клеточных системах естественной иммунологической защиты у людей и мышей заставляют исследователей задуматься о необходимости изучения антифагоцитарных и цитотоксических свойств чумного микроба на моделях его взаимодействия с лейкоцитами крови человека [Cornells G.R., 2002; Titball R.W. et al., 2003; DeLeo F.R., Hinnebusch B.J., 2005].

Процессы массивной секреторной дегрануляции и гибели лейкоцитов, запускаемые в крови пациентов токсинами устойчивых к фагоцитозу бактерий, играют решающую роль в генерализации воспаления и в развитии характерных для сепсиса инфекционных осложнений [Маянский А.Н. с соавт., 1999; Козинец Г. И. с соавт., 2002; Casey Н., 2004], особенно при легочных бактериальных инфекциях [Simpson A.J. et al., 2001; Kawabata К. et al., 2002]. Существует гипотеза о ключевой роли этих процессов в развитии тромбогеморрагического синдрома и эндотоксического шока при чуме, основанная на результатах морфологической детекции в ядерном хроматине и цитоплазматических гранулах лейкоцитов крови пациентов интенсивных дегенеративных изменений, предшествующих летальному исходу заболевания в клинических условиях [Исин Ж.М., 1990]. Для подтверждения или опровержения данной гипотезы необходима информация о характере развития процессов секреторной дегрануляции и апоптотической гибели лейкоцитов в цельной крови человека под влиянием чумных микробов с различными биологическими свойствами. Получение такой информации в условиях in vitro является новой, актуальной задачей, решение которой может иметь большое теоретическое и практическое значение.

Клеточная природа иммунитета при чуме не вызывает сомнения [Покровская М.П., Каганова Л. С., 1947; Коробкова Е. И., 1955; Самойлова Л. В., 1963; Самойлова Л. В. с соавт., 1970; Сагимбеков У. А. с соавт., 1986; Васильева Г. И., 1990; Дубровина В. И., 2004; Cowan С. et al., 2005], и все известные на сегодняшний день методы определения in vitro специфической сенсибилизации организма к инфекционному агенту основаны на учете реакций повреждения лейкоцитов крови антигеном [Фрадкин В.А., 1985; Гюлазян Н. М. с соавт., 2006].

Способность вакцинации (специфических антител к V-антигену) предотвращать апоптоз лейкоцитов периферической крови при экспериментальной чуме и в условиях in vitro лежит в основе современного способа оценки напряженности приобретенного противочумного иммунитета у привитых против чумы лабораторных животных [Bashaw J. et al., 2007].

Для определения in vitro уровня напряженности противочумного иммунитета у человека необходимо изучение особенностей взаимодействия чумного микроба и его антигенов с лейкоцитами крови привитых и не привитых против чумы людей с использованием современных методов цитологического анализа, способных адекватно оценивать исход взаимодействия патогенных бактерий с клетками иммунной системы организма хозяина [Кравцов А.Л., 1997].

При изучении фагоцитоза, дегрануляции и апоптоза в последние годы начинают внедряться экспериментальные системы, исключающие влияние на данные процессы неспецифической активации клеток и различных факторов, связанных с выделением популяций лейкоцитов из периферической крови пациентов. Это достигается путем непосредственного введения инфекционного агента или его антигенов в цельную кровь, культивирования образцов крови в оптимальных условиях и использования метода проточной цитофлуориметрии для быстрого определения в микрообъемах культивируемой крови показателей • фагоцитоза, реактивности бактерицидных систем активных фагоцитов и индуцированного апоптоза [Козинец Г. И. с соавт., 2002; Гюлазян Н. М. с соавт., 2006; Abrams W.R. et al., 1983; Bassoe K-F et al., 1984; Cinco M. et al., 1994; Raybourne R.B., Bunnind К J, 1994; Alvarez-Barrientos A. et al., 2000; Kravtsov A.L. et al., 2001;2002].

Эффективность использования метода проточной цитометрии для изучения взаимодействия чумных микробов с организмом хозяина установлена в опытах in vitro с перитонеальными макрофагами [Кравцов А.Л. с соавт., 1994; Кравцов А. Л., 1997], а также с клетками, выделенными из легких и бронхоальвеолярной жидкости лабораторных животных [Bosio С.М. et al., 2005]. Для изучения в условиях in vitro взаимодействия возбудителя чумы и его антигенов с лейкоцитами цельной крови человека этот современный метод оценки взаимодействия патогенных бактерий с клетками иммунной системы организма хозяина не применялся.

Цель диссертационной работы — разработка экспериментальной системы для изучения взаимодействия чумного микроба с лейкоцитами цельной крови человека и оценки клеточного противочумного иммунитета у лиц, привитых живой чумной вакциной.

Основные задачи исследования.

1. Изучить влияние условий культивирования на синтез в клетках Yersinia pestis ДНК, белка и специфических поверхностных антигенов. Определить характер распределении отдельных бактерий по клеточному циклу (по содержанию ДНК на клетку) в культурах вирулентного, вакцинного и авирулентного штаммов чумного микроба, выращенных при температурах 28 0 и 37 °C.

2. Изучить антифагоцитарные и цитотоксические свойства клеток Y. pestis EV НИИЭГ, выращенных при температурах 28 0 и 37 °C, в экспериментальной системе их взаимодействия in vitro с лейкоцитами цельной крови человека, а также динамику размножения чумных микробов с различными антифагоцитарными свойствами в крови с температурой 37 °C.

3. Оценить эффективность опсонизации живых клеток Y. pestis EV НИИЭГ, выращенных при температурах, 28 0 и 37 °C, термолабильным комплементом и термоггабильными Ig G сыворотки крови по изменению показателей фагоцитарной активности, секреторной дегрануляции и раннего апоптоза клеток врожденного иммунитета человека.

4. Выявить различия в цитотоксическом эффекте клеток вакцинного EV НИИЭГ (Pgm" - pFra± pCad± pPst+), вирулентного 231 (Pgm± pFra± pCad± pPst+) и авирулентного KM 260 (12) (Pgm± pFra" - pCad" - pPst") штаммов Y. pestis на лейкоциты крови человека.

5. Изучить убитые чумные микробы' и их отдельные антигены как индукторы развития процессов дегрануляции и гибели лейкоцитов в крови привитых и не привитых против чумы людей.

Научная новизна. Впервые разработана экспериментальная система, позволяющая исследовать процесс фагоцитоза, а также процессы секреторной дегрануляции и апоптоза лейкоцитов при непосредственном введении чумного микроба или его очищенных антигенов в образцы цельной крови человека, основанная на измерении методом проточной цитофлуориметрии относительного содержания ДНК и лизосомальных гранул в отдельных лейкоцитах. Показано, что применение разработанной системы позволяет идентифицировать и дифференцировать в крови человека клетки врожденного иммунитета (моноциты и гранулоциты) по внутриклеточному содержанию бактерицидных веществ, локализованных в первичных (азурофильных) гранулах, регистрировать поглощение бактерий (бактериальной ДНК) активными фагоцитами, оценивать функциональную активацию в фагоцитах протеолитических и бактерицидных систем (дегрануляцию), а также определять характер индуцируемой бактериями гибели (фрагментации ДНК) лейкоцитов в экспериментальных условиях, исключающих влияние различных факторов, связанных с выделением клеточных популяций и неспецифической клеточной активацией.

С использованием разработанной системы впервые изучено взаимодействие с лейкоцитами цельной крови человека чумных микробов, выращенных при температурах 28 0 и 37 °C. Получены новые данные о влиянии условий, культивирования на степень устойчивости опсонизированных клеток К реБИя к лейкоцитарному фагоцитозу, о способности размножающихся в крови чумных микробов подавлять, в отличие от золотистого стафилококка, секреторную • дегрануляцию фагоцитов и их гибель по типу апоптоза на ранней стадии (в течение первых 6−8 ч) взаимодействия с клетками иммунной системы организма хозяина.

Впервые с использованием метода проточной цитометрии исследован эффект сывороточных опсонинов на исход взаимодействия чумного микроба с клетками врожденного иммунитета человека. Установлено, что развитие в моноцитах и гранулоцитах крови лиц, не привитых чумной вакциной, процессов секреторной дегрануляции и раннего апоптоза зависит от опсонизации живых чумных микробов, выращенных при температуре 28 °C, сывороточным комплементом и не зависит от термостабильных сывороточных опсонинов (^ О). Получена информация об устойчивости живых клеток У. резИя, выращенных при температуре 37 °C, к опсонизации комплементом, подтверждающая на модели клеток крови человека способность факторов вирулентности чумного микроба инактивировагь белки сывороточного комплемента.

Впервые изучена динамика гибели лейкоцитов при размножении в крови человека чумных микробов с различными биологическими свойствами, зависимость интенсивности этого процесса от длительности срока инкубации и исходной микробной концентрации. Установлено, что устойчивые к фагоцитозу чумные микробы вызывают гибель лейкоцитов крови с длительной задержкой по времени (в интервале от 24 до 48 ч инкубации), характерной для генерализации воспалительного процесса (сепсиса). В отличие от бактерий, выращенных при температуре 28 °C, они не могут вызвать гибели фагоцитов на ранней стадии взаимодействия с клетками крови человека (в течение первых 6−8 ч инкубации).

Новой является информация о различном характере реакции in vitro лизосомального аппарата и ядерного хроматина клеток врожденного иммунитета лиц, привитых и не привитых живой чумной вакциной, на контакт с убитыми клетками, липополисахаридом и капсульным антигеном чумного микроба. Впервые показано, что противочумная вакцинация активирует секреторную функцию клеток врожденного иммунитета, осуществляющих распознавание специфических антигенов Y. pestis в периферической крови человека, и оказывает модулирующее воздействие на характер гибели клеток иммунной системы по типу индуцированного апоптоза.

Практическая значимость работы заключается в создании экспериментальной основы для изучения антифагоцитарных и цитотоксических свойств чумного микроба с использованием современного метода цитологического анализа, учитывающего функциональные параметры большого числа индивидуальных клеток в гетерогенных популяциях. Методические приемы, разработанные в процессе выполнения диссертации, нашли применение в научных исследованиях сотрудников РосНИПЧИ «Микроб» и Саратовского Государственного медицинского университета: для сравнительной оценки устойчивости бактерий к лейкоцитарному фагоцитозу и киллингу полиморфноядерными лейкоцитами крови человекадля изучения факторов, влияющих на развитие апоптоза лейкоцитов в крови человека и лабораторных животныхдля прогнозирования осложнений у инфицированных новорожденных в клинических условиях по показателям интенсивности дегрануляции лейкоцитов периферической крови и лейкоцитарного апоптоза.

Полученные в работе экспериментальные данные могут служить основой для дальнейших исследований, направленных на дифференцирование штаммов Y. pestis по степени их патогенности и эпидемической опасности для человека, а также на разработку эффективного теста оценки in vitro напряженности приобретенного клеточного иммунитета у лиц, привитых чумной вакциной.

По ма1ериалам диссертационной работы составлены:

1) методические рекомендации «Экспресс — метод выделения лейкоцитов из цельной крови человека и экспериментальных животных», одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб», протокол № 9 от 01.10.99 г. и утверждены директором института «Микроб»;

2) методические рекомендации «Оценка уровня азурофильной дегрануляции нейтрофилов в цельной крови человека с использованием проточной цитометрии», одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб», протокол № 6 от 06.07.01 г. и утверждены директором института «Микроб»;

3) методические рекомендации «Организация работы и обеззараживание материала, содержащего возбудителя чумы при проведении исследований методом проточной цитофлуориметрии», одобрены Ученым советом ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора, протокол № 6 от 12.12.08 г. и утверждены директором института «Микроб».

Материалы диссертации используются при чтении лекций на курсах специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования врачей и биологов при РосНИПЧИ «Микроб».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Информация об антифагоцитарных и цитотоксических свойствах чумного микроба может быть получена в экспериментальной системе, основанной на введении живых бактерий в цельную кровь человека и использовании проточной цитофлуориметрии для измерения в отдельных лейкоцитах культивируемой крови относительного содержания ДНК и бактерицидных (азурофильных) гранул.

2. Взаимодействие чумных микробов с лейкоцитами крови лиц, не привитых чумной вакциной, носит характер незавершенного фагоцитоза: с низкой эффективностью распознавания и поглощения бактерий фагоцитамис подавлением развития в фагоцитах процесса секреторной дегрануляциис нарушением защитного механизма быстрой гибели нейтрофилов по типу раннего апоптоза.

3. Интенсивность подавления защитной реакции клеток врожденного иммунитета человека факторами вирулентности Y. pestis и, как следствие, скорость размножения бактерий в крови с температурой 37 °C зависят от условий выращивания исходной бактериальной культуры (температура 28 ° или 37 °С), от степени неоднородности клеток микробной популяции по содержанию ДНК, белка и специфических поверхностных антигенов.

4. Устойчивые к фагоцитозу чумные микробы индуцируют гибель лейкоцитов в цельной крови человека по типу позднего апоптоза — с длительной отсрочкой по времени, типичной для генерализации воспалительного процесса (сепсиса). Штаммы Y. pestis EV НИИЭГ, 231 и КМ 260(12), относящиеся к различным группам патогенности (опасности), отличаются по способности и характеру индукции в крови позднего цитотоксического эффекта.

5. Противочумная вакцинация активирует секреторную функцию клеток врожденного иммунитета, осуществляющих распознавание антигенов чумного микроба в крови человека, и оказывает модулирующее воздействие на характер развигия индуцированного бактериями апоптоза.

Апробация работы. Исследования проведены в рамках плановых НИР, в которых автор являлся соисполнителем: НИР 019−3-03 «Изучение взаимодействия чумного микроба с клетками крови в модельных системах in vitro» на 2003;2007 годыНИР «Изучение роли биомолекул возбудителей особо опасных инфекционных заболеваний (чумы и холеры) в контроле апоптоза (запрограммированной гибели) эукариотических клеток» как раздела ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002;2006 годы.

Результаты экспериментальной работы были доложены на: второй Всероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (май 1998 г., Саратов) — юбилейной научной конференции «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология и ветеринария», посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ (ноябрь 1998 г., Киров) — международной научной конференции учреждений по борьбе и изучению природно-очаговых инфекций Министерства Здоровья и Социальной Защиты (Улан-Батор, Монголия, 1999) — юбилейной научной конференции «Проблемы медицинской и экологической биотехнологии», посвященной 25-ю ГНЦ прикладной микробиологии (декабрь 1999 г., Оболенск) — VI Российско-Итальянской научной конференции «Инфекционные болезни: диагностика, лечение, профилактика» (декабрь 2000 г., Санкт-Петербург) — международной конференции Saratov Fall Meeting 2000:0ptical Technologies in Biophysics and Medicine II (october 2000, Saratov, Russia) — международной конференции Saratov Fall Meeting 2001: Optical Technologies in Biophysics and Medicine III (october 2001, Saratov, Russia) — научной конференции «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», посвященной 75-летию Нижегородского НИИЭМ (октябрь 2004 г., Н. Новгород) — Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология — XXI век» (сентябрь 2004, Саратов) — IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007) — VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (сентябрь 2007, Саратов) — IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (сентябрь-октябрь 2008, Волгоград) — научнопрактических конференциях РосНИПЧИ «Микроб»: «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2000, 2003, 2005;2008 гг.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, в том числе 8 статей, из которых 2 — в рекомендованных ВАК изданиях.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 91 отечественный и 173 зарубежных источников. Текст иллюстрирован 23 рисунками и 7 таблицами. Общий объем диссертации составляет 157 страниц.

выводы.

1. Разработана экспериментальная система для получения информации об антифагоцитарных и цитотоксических свойствах чумного микроба, основанная на введении живых бактерий в цельную кровь человека и использовании проточной цитофлуориметрии для измерения в отдельных лейкоцитах культивируемой крови относительного содержания ДНК и бактерицидных гранул.

2. В двухсуточных культурах вирулентного штамма У. резШ 231, выращенных на жидкой питательной среде с температурой 37 °C, доля бактерий с относительно низким содержанием ДНК на клетку на 40% выше, чем в культурах авирулентного штамма КМ 260(12), и на 20% выше, чем в культурах вакцинного штамма ЕУ НИИЭГ. Это свидетельствует о более быстром делении клеток вирулентного штамма в растущей гетерогенной микробной популяции и сопровождается наиболее интенсивным цитотоксическим эффектом этого штамма на лейкоциты крови человека.

3. Способность вакцинного штамма ЕУ чумного микроба к размножению в образцах цельной крови человека зависит от температурного режима, стадии роста исходной бактериальной культуры и исходной микробной концентрации. При низкой микробной нагрузке 104 м.к./мл в крови погибают к 8-и ч инкубации клетки стационарной двухсуточной культуры этого штамма, выращенной при температуре 28 °C, и интенсивно размножаются клетки экспоненциальной (18-и часовой) бактериальной культуры, выращенной на жидкой питательной среде с температурой 37 °C.

4. Из-за отсутствия специфических антител (активных термостабильных опсонинов) в крови не привитых против чумы людей, фагоцитарная активность гранулоцитов по отношению к чумным микробам, выращенным при температуре 28 °C, вдвое ниже, чем по отношению к золотистому стафилококку. Цитотоксический эффект таких чумных микробов развивается в два этапа — сначала по типу связанного с фагоцитозом раннего апоптоза (через 6 ч инкубации), а затем по типу позднего апоптоза (в интервале времени от 24 до 48 ч).

5. Устойчивая к фагоцитозу популяция клеток чумного микроба может быть получена путем высева клеток двухсуточной культуры У. резИя ЕУ.

НИИЭГ, выращенных при температуре 28 °C, на жидкую питательную среду с температурой 37 °C, где бактерии размножаются при аэрации от 6 до 18 ч. Микробная популяция приобретает устойчивость к поглощению фагоцитами крови, утрачивает способность к активации клеток врожденного иммунитета и быстрому повреждению лейкоцитов крови человека, когда становится высоко неоднородной с точки зрения содержания ДНК, белка и специфических поверхностных антигенов на клетку.

6. Устойчивые к фагоцитозу чумные микробы вызывают гибель лейкоцитов крови по типу позднего апоптоза — с длительной задержкой по времени, характерной для генерализации воспалительного процесса (сепсиса). Штаммы Y. pestls EV НИИЭГ, 231 и КМ260 (12), относящиеся к различным группам патогенности (опасности), различаются по интенсивности цитотоксический эффекта на лейкоциты человека в интервале времени от 24 до 48 ч инкубации образцов крови при температуре 37 °C .

7. Секреторную дегрануляцию и ранний апоптоз клеток врожденного иммунитета человека запускают в образцах цельной крови человека убитые клетки чумного микроба, выращенные при температуре 28 °C, а также препараты ЛПС и капсульного антигена чумного микроба. У всех лиц, не привитых ЖЧВ, наблюдается слабая реакция нейтрофилов периферической крови по данным показателям.

8. Противочумная вакцинация активирует секреторную функцию клеток врожденного иммунитета человека, осуществляющих распознавание антигенов чумного микроба, и оказывает модулирующее воздействие на характер развития в крови, индуцируемого чумными микробами апоптоза. Интенсивность дегенеративных изменений, развивающихся в лизосомальном аппарате и ядерном хроматине лейкоцитов крови привитых против чумы людей при контакте in vitro с клетками или антигенами чумного микроба, зависит от срока, прошедшего после прививки ЖЧВ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Прогноз для России по чуме остается на ближайшее время неблагоприятным [Самойлова Л.В., 2007; Топорков В. П. с соавт., 2007], что при отсутствии коммерческой противочумной вакцины, способной защитить человека и животных от первичной легочной чумы, определяет актуальность разработки вакцин нового поколения, а также внедрения новых показателей, характеризующих безвредность и иммунологическую эффективность средств экстренной и специфической профилактики чумы на клеточном уровне в условиях in vivo и vitro [DeLeo F. R., Hinnebusch B.J., 2005; Bashaw J. et al., 2007].

Согласно существующим в России нормативным документам [СП 3.3.2.56 196 «Государственные испытания и регистрация новых медицинских препаратов" — РД 42−28−10−90 «Порядок и методы контроля иммунологической безопасности вакцин. Общие методические принципы" — РД 42−28−8-89 «Доклинические испытания новых медицинских иммунологических препаратов. Основные положения» и другие] программа испытаний новых вакцин включает доклиническое изучение препарата на лабораторных животных, а также исследование на ограниченной и расширенной группах людей. Для оценки у людей противочумного иммунитета применяется кожная аллергическая реакция. Более безопасный альтернативный способ оценки иммунитета на клеточном уровне (в экспериментальной системе in vitro) на сегодняшний день отсутствует, что осложняет доклиническое испытание новых препаратов [Коровкин А.С., 2008], а также соблюдение правил биологической безопасности, требующих контроля за эффективностью вакцинации лиц, работающих с возбудителем чумы в лабораторных условиях ["Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности). Санитарные правила СП 1.3.1285 03 «].

Адекватная оценка взаимодействия патогенных бактерий с клетками организма хозяина — это актуальная проблема современной микробиологии и иммунологии, от решения которой зависит эффективность профилактики, диагностики и лечения инфекционных заболеваний человека и животных. В последние годы проблема решается в клинических условиях путем автоматизации цитологических исследований на основе метода импульсной проточной цитометрии [Alvarerez-Barrientos A. et al., 2000], который является наиболее эффективным методом оценки апоптоза, фагоцитоза и степени реактивности бактерицидных систем клеток врожденного иммунитета [Voyich J., DeLeo F., 2002; Олиферук H.C., Пинегин Б. В., 2007].

Новый подход к оценке напряженности приобретенного иммунитета у привитых против чумы животных (мышей и приматов) учитывает современные достижения в области изучения клеточных механизмов патогенеза чумы и основан на способности противочумной вакцинации предотвращать цитотоксический эффект устойчивых к фагоцитозу чумных микробов на клетки иммунной системы как в условиях in vivo, так и in vitro. На примере химической противочумной вакцины экспериментально доказано, что иммунологическую эффективность ' противочумных вакцин нового поколения (их способность защищать животных от аэрогенного заражения чумой) необходимо оценивать не по титру в сыворотке крови специфических антител к капсульному антигену и/или V-антигену чумного микроба, а по функциональной активности антител на клеточном уровне — по их способности предотвращать при чуме апоптотическую гибель клеток организма хозяина. Для адекватной сравнительной оценки в условиях in vitro интенсивности цитотоксического эффекта бактерий на клетки иммунной системы привитого и не привитого против чумы организма применяется метод проточной цитофлуориметрии, позволяющий быстро регистрировать распределение большой статистической выборки эукариотических клеток по клеточному циклу и определять в гетерогенной лейкоцитарной популяции долю апоптотических клеток, несущих молекулу ДНК на стадии деградации [Bashaw J. et al., 2007].

Использование такого подхода для оценки in vitro напряженности приобретенного иммунитета у привитых против чумы людей требует, по мнению зарубежных специалистов, детального изучения антифагоцитарных и цитотоксических свойств чумного микроба в различных экспериментальных системах его взаимодействия in vitro с лейкоцитами крови именно человека, так как по устройству и функционированию клеточных механизмов врожденной антибактериальной защиты люди существенно отличаются от лабораторных животных [DeLeo F., Hinnebusch B.J., 2005]. Для людей характерен, как известно, гранулоцитарный тип кроветворения и доля гранулоцитов в периферической крови человека около 60%, что вдвое выше, чем в крови мышей и морских свинок [Фрадкин В.А., 1985]. Клетки первой линии антибактериальной защиты (нейтрофилы) содержат у людей вдвое больше бактерицидных гранул, характеризуются более высокойстепенью’зрелости [КравцовА.Л. 1997] и отвечают секрецией бактерицидных веществ (секреторной деграиуляцией) на контакт с микробными клетками и бактериальными: антигенами иначе, чем нейтрофилы крови лабораторных животных [Carnlli G. 1996]- Однако, цитотоксический эффект чумного микроба налейкоциты, крови человека: методом проточной, цитофлу’ориметрии не изучался. При моделировании in ¦ vitro чумной бактериемии не исследовалась зависимость интенсивности и динамики повреждениялейкоцитов в образцахцельной крови, человека от исходной микробнойг концентрации, от. условийвыращивания бактериальной культуры и показателей степени неоднородности клеток микробной популяции, от уровня1 устойчивости бактерий. к поглощению фагоцитами: и. реактивности бактерицидных гранул клеток врожденного иммунитета, атакже от степени патогенностиг (вирулентности): штаммов чумного. микроба для? лабораторных животных. Современными методами автоматического цитологического анализа не. изучалось влияние вакцинации* людей' живой чумной вакциной/ на функциональную активность и интенсивность повреждения лейкоцитов крови в экспериментальной, системе их взаимодействия-: in vitro с клетками, иантигенамичумного микроба. • - «'. •'• '. .

В диссертационной работе впервые решались задачи по получению этой, важной информации с целью создания экспериментально-методическойосновы для характеристики: in vitro биологических свойств чумного микроба и оценки: у людей приобретенного противочумного иммунитета. Работа, выполнялась на базе лаборатории иммунологии-, РосНИПЧИ «Микроб» ' ПОД руководством Д-б.Ш КраВЦОВа А.Л. И: fliM.H./lj^OBCKOifc, TiH": врамках двух завершенных НИР, в которых автор" являлся соисполнителем: «Изучение взаимодействия, чумного микроба с клетками крови в: модельных' системах in vitro" — «Изучение роли биомолекул возбудителей, особо опасных заболеваний (чумы и холеры) в контроле апоптоза (запрограммированной гибели) эукариотических клеток» как раздела ФЦНТП «Исследования и разработки: по приоритетным направлениям науки и техники».

Основой данной работы явился многолетний опыт сотрудников института по применению метода проточной цитофлуориметрии для изучения реактивности бактерицидных гранул и ядерного хроматина клеток иммунной < системы при ¦ 122 чумном вакцинном и инфекционном процессах, а также по оценке фагоцитоза и цитотоксических свойств чумного микроба в экспериментальной системе его взаимодействия in vitro с макрофагами лабораторных животных [Кравцов A.JI. с соавт., 1994; Кравцов А. Л., 1997].

Использовали имеющейся в институте коммерческий проточный цитофлуориметр ICP-22 PHYWE (Германия) — первый современный проточный клеточный анализатор, освоенный зарубежной промышленностью. Этот прибор обладает высокой чувствительностью и разрешающей способностью при измерении относительного содержания различных биологически активных веществ в отдельных лейкоцитах крови человека и экспериментальных животных [Gohde W., 1973; Peters D., 1979], а также в отдельных клетках гетерогенной микробной популяции (Кравцов А.Л., 1997). В диагностических лабораториях он применяется с 70-х гг. прошлого столетия. Причем, использованные в диссертации цитохимические методы исследования впервые прошли широкую апробацию в клинических условиях именно на этом цитофлуориметрическом оборудовании [Barlogie В. et al., 1976; Исаков В. Л. с соавт., 1988; Кравцов А. Л., 1997].

Путем измерения относительного содержания ДНК в больших статистических выборках отдельных бактерий (около 50 ООО м.к.) в данной диссертационной работе впервые был проведен сравнительный анализ частотных распределений их по клеточному циклу (по содержанию ДНК на клетку) в стационарных двухсуточных культурах • вирулентного, вакцинного и авирулентного (бесплазмидного) штаммов чумного микроба, выращенных при температуре 28 °C, а также в субкультурах этих штаммов, находящихся на различных стадиях роста при аэрации на жидкой питательной среде с температурой 37 °C.

В результате было установлено, что, независимо от биологических свойств исследуемого штамма, около 90% клеток чумного микроба в исходных стационарных культурах, выращенных при температуре 28 °C, характеризуется относительно низким содержанием ДНК. Высокая степень неоднородности по данному показателю, свидетельствующая об активации в бактериях процесса репликации ДНК, устанавливалась в культурах трех исследуемых штаммов с различными биологическими свойствами через 6 ч роста бактерий при температуре 37 °C. Однако, через 48 ч культивирования при данной температуре она полностью исчезала в популяции клеток вирулентного штамма, но частично сохранялась в популяции клеток авирулентного штамма чумного микроба. Это отражало различный характер деления клеток в гетерогенных микробных, популяциях (Steen H.B. et al., 1982; Kell D. et al., 1991), свидетельствовало о более быстром делении клеток вирулентного штамма на поздней стадии его роста при температуре 37 °C.

При делении клеток грамотрицательных бактерий высвобождаются, как известно, эндотоксины (мультимолекулярные комплексы ЛПС с мембранными белками), обладающие выраженными цитотоксическими свойствами (Hellman J. et al., 2000; Винокуров М. Г. с соавт., 2006). Вероятно поэтому вирулентный штамм чумного микроба оказывал, по нашим данным, в отличие от авирулентного штамма, интенсивный поздний цитотоксический эффект на лейкоциты человека в образцах цельной крови с температурой 37 °C. Было замечено, что по характеру роста на жидкой питательной среде с температурой организма хозяина вакцинный штамм EV чумного микроба занимает промежуточное положение между вирулентным и авирулентным штаммами. Скорость размножения клеток вакцинного штамма EV в образцах крови человека зависела от уровня содержания ДНК, суммарного белка и специфических поверхностных антигенов в отдельных микробных клетках и резко увеличивалась при повышении температуры выращивания исходной бактериальной культуры с 28 0 до 37 °C.

При решении поставленных в диссертации задач учитывали, что в клинических условиях степень тяжести инфекционных заболеваний оценивается в настоящее время на клеточном уровне по двум показателям — по интенсивности дегенеративных изменений в ядерном хроматине и азурофильных гранулах лейкоцитов периферической крови пациентов. По значению индекса дегенерации более 50 (доля поврежденных нейтрофилов более 50%) прогнозируется развитие характерных для сепсиса инфекционных осложнений и высокая вероятность неблагоприятного исхода заболевания [Козинец Г. И. с соавт., 2001]. С другой стороны, по интенсивности секреторной дегрануляции, гибели и лизиса нейтрофилов на начальной стадии инфекционного процесса, либо на начальной стадии взаимодействия бактерий с лейкоцитами крови (в течение первых 3−6 ч) в условиях in vitro, принято оценивать адекватность реагирования клеток врожденного иммунитета человека на внедрение инфекционного агента в кровь и тканиорганизмахозяина: [Urban G. et al., 2008;Бобылева E. Bl, 2004]- Благодаря контролю за развитием секреторной дегрануляции в нейтрофильных гранулоцитах была впервые установлена ранее неизвестная: зависимость антибактериального реагирования клеток врожденного иммунитета человека и животных от вида и биологических свойств возбудителя — способность иерсиний (возбудителей чумы и псевдотуберкулеза) подавлять, в отличие от золотистого стафилококка, процесс секреции, бактерицидных веществ из гранул фагоцитов периферической, крови во внеклеточное пространство [Urban С. et ah, 2008]. В: опытах in vitroантифагоцитарные свойства клеток Г. pseudotuberculosis изучались по данному показателю в сравнении с клетками S.. aureus для доказательства, что подавление реакции бактерицидных систем нейтрофиловкровш. человека является важной видовой характеристикой антифагоцитарных свойств возбудителя. псевдотуберкулеза, а не следствием наличияв организме доноров врожденного или приобретенного иммуиодефицитного состояния [Исачкова JI.M., ПлеховаН.Г. 2002]. V" '. .':¦•.¦¦¦ '¦" ': ¦¦¦'',. '' л.

Поэтому в диссертационной работе результат взаимодействия чумного микроба с клетками иммуннойсистемы человека впервые оценивался нами: методом проточной цит офлуориметрии одновременно по двум показателям, а не только по характерному для апоптоза изменению в лейкоцитах внутриклеточного содержания ДНК, причем в ¡-условиях адекватного антибактериального реагированияг клеток врожденного иммунитета на внедрение в кровь человека золотистого стафилококка. .

Образец цельной дефибринироваиной крови каждого донора делили по объему на четыре равные части. Одну часть инкубировали при температуре 37° С в отсутствие бактерий (отрицательный' контроль), другую с клетками S. aureus (положительный контроль), а в два оставшихся образца1 добавляли, соответственно, живые клетки Y. pestis EV, выращенные при температуре 28 °C или 37 9С, которые по данным: предварительно 'проведенных микробиологических исследований различались по содержанию на клетку ДНК, белка, специфических поверхностных антигенов, а также по способности выживать: и размножаться в цельной крови человека. Бактерии добавлялись в кровь в одинаковой исходной концентрации, в пределах от 10J до 109 м.к./мл. Результаты учитывали в 4-х исследуемых образцах крови в динамике, с интервалом времени в 1 ч в течение первых 8 ч инкубации при температуре 37 °C, а также через 24 и 48 ч. Для этого из 4-х образцов крови каждого донора в эти сроки одновременно отбирали по 200 мкл и методом проточной цитофлуориметрии исследовали в микрообъемах цельной крови по 60 ООО отдельных лейкоцитов, измеряя в каждой отдельной клетке относительное содержание ДНК и бактерицидных гранул. Из статистических распределений лейкоцитов по клеточному циклу и по состоянию лизосомального аппарата (гистограмм) определяли в гетерогенной лейкоцитарной популяции относительное содержание: лимфоцитов и фагоцитовактивных фагоцитов с повышенным содержанием ДНК на клетку (2С ДНК фагоцита+ДНК всех поглощенных бактерий) — фагоцитов в состоянии секреторной дегрануляции, утративших свои бактерицидные гранулы при взаимодействии с живыми микробамиповрежденных клеток, находящихся на стадии гибели по типу апоптоза и несущих менее 2С ДНК на клетку.

В результате проведенных исследований было установлено, что в экспериментальной системе, основанной на введении живых бактерий в цельную кровь человека и использовании проточной цитофлуориметрии для измерения в v отдельных лейкоцитах культивируемой крови относительного содержания ДНК и бактерицидных (азурофильных) гранул, может быть получена важная информация об антифагоцитарных и цитотоксических свойствах чумного микроба, а также о том влиянии, которое оказывает вакцинация людей живой чумной вакциной на функциональную активность и интенсивность повреждения клеток иммунной системы в условиях in vitro.

Представленные в диссертации экспериментальные данные свидетельствуют, что клетки врожденного иммунитета человека, адекватно реагирующие на внедрение в кровь золотистого стафилококка (активный фагоцитоз бактерий через 1−2 ч, быстрая дегрануляция и гибель активных фагоцитов соответственно к 4 и 6 ч инкубации), абсолютно не реагируют в течение 24 ч (по данным показателям) на внедрение в цельную кровь клеток вакцинного штамма EV чумного микроба, если это клетки экспоненциальной бульонной культуры, выращенной с аэрацией при температуре 37 °C и характеризующейся высокой степенью неоднородности с точки зрения распределения в ней отдельных бактерий по клеточному циклу (по относительному содержанию ДНК на клетку).

Попадая в цельную кровь человека, клетки такой бактериальной культуры запускали дегрануляцию и гибель лейкоцитов с длительной задержкой по времени, характерной для генерализации воспалительного процесса (сепсиса). Причем, с помощью не связанного с фагоцитозом механизма цитотоксичности. В крови полностью отсутствовали активные фагоциты с повышенным содержанием ДНК на клетку, несущие поглощенную бактериальную ДНК. Независимо от исходной i микробной концентрации чумные микробы размножались в крови человека, не проявляя на клеточном уровне своих реактогенных и токсических свойств в течение длительного инкубационного периода (в течение суток). Однако, от дозы зависела интенсивность гибели лейкоцитов (фагоцитов и лимфоцитов) по типу позднего апоптоза в обсемененных живыми чумными микробами образцах цельной крови человека (в интервале времени от 24 до 48 ч инкубации).

При добавлении в кровь убитых клеток чумного микроба из той же экспоненциальной бактериальной культуры, выращенной при температуре 37 °C, не наблюдали развития позднего цитотоксического эффекта. Это согласуется с литературными данными, свидетельствующими, что массовую гибель клеток иммунной системы организма хозяина запускают живые чумные микробы, которые при контакте с поверхностью эукариотических клеток секретируют в их цитоплазму эффекторные белки внешней мембраны (Yops), обладающие цитотоксическими свойствами [Cornelis G.R., 1998; Hueck C.J., 1998].

По мнению Urban C.F. et al. (2008) уникальность стратегии защиты чумного микроба от бактерицидного эффекта самой многочисленной популяции клеток врожденного иммунитета, ответственной за нейтрализацию факторов вирулентности иерсиний, состоит не в том, что он быстро приобретает устойчивость к поглощению нейтрофилами (такую стратегию используют многие возбудители). Возбудитель чумы полностью подавляет необходимый для развития местного воспаления и обеспечения эффективного киллинга бактерий механизм внеклеточной бактерицидности нейтрофильных гранулоцитов — секрецию в кровь и ткани организма (во внеклеточное пространство) бактерицидных веществ («extracellular traps»), образуемых при секреторной дегрануляции (функциональной активации) и гибели (фрагментации ядерного хроматина) нейтрофилов.

Экспериментальные данные, впервые полученные нами на модели взаимодействия чумного микроба с лейкоцитами цельной крови человека, могут иметь большое теоретическое и, в перспективе, практическое значение, поскольку они подтверждают современную гипотезу о причине длительной задержки воспалительного ответа организма хозяина при первичной легочной чуме. Исходя из результатов экспериментов на различных лабораторных животных, эту задержку объясняют в настоящее время, с одной стороны, уникальной способностью возбудителя чумы подавлять защитный механизм функциональной активации, гибели и лизиса нейтрофилов на начальной стадии развития инфекционного процесса, а с другой стороны, его способностью запускать с помощью не связанного с фагоцитозом механизма цитотоксичности массовую гибель фагоцитов и лимфоцитов периферической крови по типу апоптоза на стадии (36−48 ч после заражения), предшествующей гибели животных от чумного сепсиса. Предполагают, что характерные для сепсиса инфекционные осложнения неожиданно быстро развиваются при первичной легочной чуме под влиянием продуктов распада поврежденных клеток организма хозяина [Bubeck S. et al., 2007].

Одним из таких продуктов может быть лейкоцитарная эластаза, которая при массивной дегрануляции и гибели нейтрофилов периферической крови попадает во внеклеточное пространство, вызывая разрушение белков плазмы крови и структурных белков различных тканей организма человека и животных. Динамика повреждения лейкоцитов крови человека устойчивыми к фагоцитозу чумными микробами позволяет нам сделать такое предположение, поскольку при других легочных инфекциях резкое повышение концентрации лейкоцитарной эластазы в плазме крови пациентов неизбежно приводит к быстрому развитию синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (ДВС-синдрома) и септического шока [Доценко В.Л. с соавт., 2000; Lengas A. et al., 1994]. Ключевая роль ДВС-синдрома в патогенезе чумы хорошо известна [Исин Ж.М., 1990] и вполне вероятно, что его развитие при чуме зависит от патогенетических аспектов физиологической функции лейкоцитарной эластазы. Пока это только гипотеза, для подтверждения (или опровержения) которой требуются специальные биохимические исследования. Учитывая, что современная стратегия предотвращения генерализации воспалительного процесса у пациентов при острых легочных инфекциях основана на использовании специфических ингибиторов лейкоцитарной эластазы в сочетании с антибиотиками [Simpson A.J., 2001;

Kawabata К. е1 а1., 2002], те же ингибиторы могут оказаться эффективными средствами защиты организма человека и от легочной чумной инфекции.

В разработанной нами экспериментальной системе антифагоцитарные и цитотоксические свойства чумного микроба зависели от условий выращивания бактериальной культуры (от температурного режима, питательной среды и длительности срока культивирования). Защитную реакцию клеток врожденного иммунитета вызывали в периферической крови лиц, не привитых живой чумной вакциной, двухсуточные стационарные культуры чумного микроба, выращенные на твердой питательной среде при температуре 28 °C.

В таких культурах, обладающих реактогенными свойствами на ранней стадии взаимодействия с лейкоцитами крови человека, микробные клетки существенно отличались от клеток, присутствующих в экспоненциальных культурах, выращенных при аэрации на жидкой питательной среде с температурой 37 °C. Фактически все бактерии (более 90%) характеризовались относительно низким содержанием на клетку ДНК, белка и специфических поверхностных антигенов, что свидетельствовало об очень высокой степени однородности клеток микробной популяции по данным структурным показателям.

Литературные данные подтверждают, что когда для подкожного заражения г или вакцинации) животных используются двухсуточные стационарные культуры чумного микроба, выращенные при температуре 28 °C, на месте внедрения бактерий развивается защитная воспалительная реакция, которая, однако, значительно слабее реакции, вызываемой стафилококками. С точки зрения микробиологии не удается объяснить, почему чумной микроб не вызывает, подобно стафилококкам, интенсивного поражения тканей на месте внедрения, но при этом быстро распространяется в организме хозяина [Домарадский И.В., 1966, 1998].

Важно, что полученные в диссертации новые экспериментальные данные, вероятно, смогут объяснить данный феномен с точки зрения иммунологии, поскольку они согласуются с современными представлениями об иммунной основе инфекционного воспаления, обусловленной зависимостью процессов секреторной дегрануляции, эмиграции и гибели нейтрофильных гранулоцитов от реакции антиген-антитело в стенке сосудов [Исачкова Л.М.- Плехова Н. Г., 2002].

Термостабильные опсонины (специфические ^О), способные активировать фагоцитарную и бактерицидную функцию нейтрофилов крови по отношению к чумному микробу, отсутствовали в сыворотках крови лиц, не привитых живой чумной вакциной, в то время как в тех же сыворотках присутствовали функционально активные специфические антитела, к антигенам S. aureus. Видимо поэтому на раннем этапе взаимодействия с лейкоцитами’крови чумные микробы, выращенные, при температуре 28 °C, активировали и повреждали вдвое меньше клеток врожденного иммунитета человека, чем клетки золотистогостафилококка. Процессы дегрануляции и гибели лейкоцитов в ответ начумные микробы носили. затяжной характер, типичный для не завершенного (дефектного) фагоцитоза, и развивались в крови в два этапа. К 6 ч инкубации чумные микробы успевали повредить, не более 30% суммарного пула лейкоцитов крови (около 50% фагоцитов). Затем их цитотоксический эффект на длительный промежуток времени полностью прекращался, свидетельствуя об изменении биологических свойств бактерий в крови с температурой 37 °C. Основная масса клеток иммунной системы повреждалась устойчивыми к фагоцитозу, чумными микробами в интервале от 24 до 48 ч инкубации, точно также как в случае с исходными культурами, выращенными при температуре 37 °C. ' Динамика повреждения, лейкоцитов крови человека в разработанной нами экспериментальной системе зависела от степени патогенности (вирулентности) штамма чумного микроба для лабораторныхживотных. Высоковирулентный штамм оказывал значительно более интенсивный поздний цитотоксический эффект на клетки иммунной системы, чем вакцинный штамм EV НИИЭГ, при фактическом отсутствии в тех же условиях цитотоксического эффекта авирулентного (бесплазмидного) штамма.

Нами установлено, что лейкоциты крови привитых против чумы людей обладают способностью к более эффективному распознаванию специфических антигенов чумного микроба in vitro, так как они отвечаютболее интенсивной секреторной дегрануляцией на низкую дозу ЛПС чумного микроба, а также на убитые или живые чумные микробы, выращенные при температуре 28 °C. Активируя клетки врожденного иммунитета на начальной стадии их взаимодействия с чумными микробами, противочумная вакцинация способствовала предотвращению развития в образцах крови человека позднего цитотоксического эффекта устойчивых к фагоцитозу чумных микробов.

Таким образом, полученные в работе экспериментальные данные согласуются с современными представлениями о молекулярных механизмах, лежащих в основе антиинфекционной резистентности [Исачкова JI.M., Плехова Н. Г., 2002], а также в основе феномена гиперчувствительности при инфекциях, вызываемых грамотрицательными микроорганизмами [Owen С.А. et al., 1997; Гюлазян Н. М. с соавт., 2006]. Поэтому они создают необходимую экспериментально-методическую основу для дальнейших исследований, направленных на разработку эффективного теста оценки у людей напряженности приобретенного противочумного иммунитета, а также для характеристики и дифференцирования штаммов чумного микроба по степени их патогенности (эпидемической опасности) для человека.