Характеристика вируса эукариотической зеленой водоросли Chlorococcum Minutum

Трудно переоценить значение водорослей в природе. Их роль в общем балансе живого вещества на Земле огромна — около 30% вырабатываемой на планете органической массы приходится на долю водорослей (Голлербах, 19 776). Повсеместное распространение водорослей в природе и обильное, а подчас и массовое развитие их в водоемах разного типа, на надземных субстратах и в почве определяют огромное значение этих растений как в повседневной жизни человека, так и в его хозяйственной деятельности. И несмотря на то, что их искусственное разведение уже началось в ряде стран и у нас на Дальнем Востоке, все же имевдиеся возможности практического использования водорослей далеко еще не исчерпаны, а методы управления их жизнью только намечаются.

Особенности фотосинтетического, биохимического и генетического аппаратов водорослей, наличие наряду с относительно простыми одноклеточными формами форм с высоким уровнем клеточной дифференциации привлекают к водорослям внимание широкого круга исследователей и делают их объектом интенсивного и разностороннего экспериментального изучения.

Долгое время водоросли считали особой группой организмов, являющихся исключением среди обитателей животного и растительного мира, поскольку не было известно ни одного из их представителей, способного подвергаться вирусной инфекции. Лишь только в 1958 году Н. Б. Заварзина и А. Е. Проценко, изучая причины массового лизиса культур эукариотической зеленой водоросли Chlorella pyrenoidosa, впервые высказали предположение, что лизис водоросли может вызываться агентом вирусной природы. Обнарушенный ими альгологический агент напоминал некоторые известные колифаги. По аналогии его было предложено назвать хлореллофагом. Несмотря на то, что авторам, в силу ряда, причин, не удалось привести четких доказательств вирусной ¡-природа хяореллофага, эта работа явилась первым шагом на пути к изучению вщзусов водорослей (Заварзина, 1961; 1962; 1964; Тихоненко, Заварзина, 1966).

Хотя первый альголитиче ский агент был обнаружен у эука-риотической водоросли, дальнейший интерес к изучению вирусов водорослей был вызван обнаружением вируса, лизируицего про-кариотические сине-зеленые водоросли (Safferman, Morris, 1963). С тех пор появилось огромное количество работ, посвященных цианофагам, интерес к которым объясняется как теоретическим, так и практическим значением их хозяев, а также и проблемами качества ВОДЫ (Brown, 1972; Padan, Shilo, 1973; Sherman, Brown, 1978).

Сообщения о вирусах и вирусоподобных частицах эукариоти-ческих водорослей постоянно стали появляться только с 1971 года" Однако большинство работ носило, и часто еще носит, чисто описательный характер и ограничивалось исключительно электрон-нонйикроскопическим изучением ультраструктуры зараженных клеток. Очень часто обнаружение вирусоподобных частиц было чисто случайным, в ходе изучения ультраструктуры той шеи иной водоросли (Lenuoe, 1976; Sherman, Brown, 1978; Dodds, 1979). В результате, несмотря на более чем двадцатилетнюю историю, вирусы эукариотических водорослей являются на сегодняшний день одной из наиболее слабо изученных групп вирусов. Причины, вызвавшие такое отставание этой области вирусологии, по-видимому, состоят в том, что во-первых, вирусологи, изучающие вирусы растений вообще и вирусы водорослей в частности, интересуются, как правило, вирусами, имещими экономическое значениево-вторых, это сложность культивирования водорослей и получения больших количеств биомассы с тем, чтобы выделить достаточное количество вируса для очистки и изученияв-третьих, это сложность работы с культурами водорослей и неприменимость к ним обычных бактериологических методов — и, наконец, в-четвертых, это, как правило, отсутствие контрольных культур, свободных от вирусной инфекции.

Появление в последние пять лет все возрастающего количества работ, посвященных вирусам эукариотических^{водорослей,} со всей очевидностью свидетельствует о важности и перспективности исследования этой группы вирусов. Их изучение и понимание взаимодействия с клетками хозяев несомненно явится ценным инструментом не только для решения проблем физиологии эукариотических водорослей, но и ряда, проблем, касающихся их эволюции, филогенеза и систематики. Актуальность работ в этом направлении определяется также потребностями генной инженерии, поскольку система, вирус — эука-риотическая водоросль явится прекрасной моделью для изучения транскрипции, трансляции и репликации ДНК в клетках фотосинтезирухщих эукариотических организмов.

В течение ряда последних лет в лаборатории микробиологии Биологического научно-исследовательского института Ленинградского университета ведется работа по изучению строения и характеристике вируса эукариотической зеленой водоросли сыогососсит пипи-Ьш!. Целью настоящей работы явилось исследование биологических и физико-химических свойств этого вируса, а также изучение взаимодействия с клеткой хозяина." Для этого были сформулированы следующие конкретные задачи исследования:

1 — разработать эффективный метод выделения вируса, позволяющий получать внсокоочшценнне и концентрированные препараты;

2 — разработать метод количественного определения вируса;

3 — изучить особенности взаимодействия вируса с зооспорами С.тд.ш^ит ;

4 — изучить устойчивость вируса к действию некоторых физических и химических факторов;

5 — определить спектральные и седиментационные характеристики В1фуса.;

6 — охарактеризовать белковый компонент вируса;

7 — охарактеризовать нуклеиновый компонент вируса".

Приношу глубокую благодарность моему научному руководителю профессору Громову Борису Васильевичу и консультанту к.б.н. Худякову Ивану Яковлевичу, а также всем сотрудникам лаборатории микробиологии Биологического НИИ ЛГУ за поддержку" внимание, ценные советы и помощь, оказанную при выполнении настоящей работы. Выражаю искреннюю признательность руководителю лаборатории молекулярной биологии Биологического НИИ ЛГУ ст.научн.сотр. А. В. Козлову за любезно предоставленную возможность использовать оборудование лаборатории и со трудникам этой лаборатории к.б.н. Дмитриевой Е. Ю., Кулыба Н. П. и Плавнику Ю. А. за помощь и дружеское содействие.

ВЫВОДЫ.

1. Разработан простой и эффективный метод концентрирования и очистки вируса СЫогососсит, позволяющий получать вы-сокоочшценные препараты с концентрацией порядка 0,7 мг • мл" «* и общим содержанием вируса около 35 мг.

2. Разработан метод количественного определения вируса СЫогососсит, в основе которого лежит метод серийных раЗВесэ дений. Очищенные препараты вируса содержат порядка 10.

9 —Т.

10 инф.ед.-мл .

3. Вирус СЫогососсит служит первым примером флагеллотропно-го вируса эукариотической клетки. Заражение зооспор вирусом происходит в процессе работы жгутиков, при этом активная работа жгутиков является необходимым условием эффективного заражения зооспоры.

4. Установлено, что первым результатом взаимодействия вируса с зооспорой является её обездвиживание.

5. Температурная инактивация вируса СЫогососсит наступает при 55°. Вирус наиболее стабилен при рН 8,0. Осмотический шок, вызванный 2 М раствором хлорида натрия, приводит к полной инактивации вируса, обусловленной деградацией частиц и высвобождением ДНК. Кратковременная обработка хлороформом приводит к полной потере инфекционности, что вызвано растворением липидов, входящих в состав мембран оболочки вируса.

6. Плавучая плотность частиц вируса СЫогососсит составляо ет 1,230 г* см. Молекулярная масса частиц, рассчитанная по их плавучей плотности и диаметру, равна 2,15 -2,62 х Ю9 дальтон.

7. В состав вируса СЫогососсит входит 30 полипептидов, причем 4 из них дают положительную реакцию на гликопро-теиды с реактивом Шиффа. Полипептид с молекулярной массой 42 200 дальтон является главным, представляя значительную часть общего белка вируса.

8. Вирус СЫогососсит содержит двухспиральную ДНК. По содержанию гуанина и цитозина ДНК вируса относится к ГЦ-типу. Значение (Г+Ц), определенное по температуре плавления, оказалось равным 61,2 мол$ при плавлении в 0,1 Б8С и 60,1 тол% при плавлении в 0,01 М Нафосфатном буфере, рН 7,0, содержащем 0,001 М На^ЕМА. Значение (Г+Ц) по данным хроматографии кислотных гидролизатов ДНК составило 59,1 мол.$, что близко аналогичному значению для ДНК хозяина (62,1 мол.$ (Г+Ц)). Молекулярная масса ДНК вируса по предварительным оценкам составляет 200 -300 х Ю6 дальтон.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Результаты проведенной работы по характеристике вируса, эукариотической водоросли СЫогососсит т±хш?ит показывают, что этот вирус отличается от всех описанных ранее вирусов эукариот в целом и вирусов эукариотических водорослей в частности.

Вирус СЫогососсит является одним из наиболее крупных вирусов и имеет фагоподобное строение. Однако бактериофаги с направленным внутрь головки отростком, способным выворачиваться наружу, описаны не были. Вирус проникает в клетку хозяина своеобразным и пока, не описанным ни у каких других вирусов путем. Проникновение происходит через жгутиковые каналы зооспоры, где вирус, подобно бактериофагам, инъецирует свое содержимое через плазмалемму клетки (Громов, Мамкаева, 1979). Заражение зооспор вирусом происходит в процессе работы жгутиков, при этом активная работа жгутиков является необходимым условием эффективного заражения зооспоры. Таким образом, вирус СЫогососсит может служить первым примером флагеллотропного вируса эукариотической клетки.

Геном вируса. СЫогососсит представлен двухспиральной ДНК, в состав которой входят четыре обычных основания. По содержанию гуанина и цитозина. ДНК вируса, относится к отчетливо выраженному ГЦ-типу. Молекулярная масса ДНК, по нашим оценкам, должна составлять 200 — 300 х Ю6 дальтон.

В состав вируса СЫогососсит входит 30 полипептидов, причем один из них по своему вкладу в общее содержание белка в вирионе является основным или главным. 4 из 30 вирусных полипептидов дают положительную реакцию на. гликопротеиды с реактивом Шиффа.

Среди вирусов растений ДНК-содержащие встречаются крайне редко. В настоящее время известий две небольшие группы таких вирусов — это, во-первых, группа очень мелких, так называемых вирусов-близнецов или спаренных вирусов, содержащих однонитчатую ДНК с молекулярной массой 0,66 — 0,95 х / fi.

10 дальтон и максимальным диаметром изометрических частиц порядка 19 нм (Goodman, 1977а, Ъ, с — Harrison et al., 1977; Shepherd, 1979). Во-вторых, это вирусы, принадлежащие группе вируса мозаики цветной капусты, содержащие кольс цевую двухспиральную ДНК с молекулярной массой 4,4×10 дальтон и диаметром частиц 45 — 50 нм (Shepherd, 1976, 1979). Несколько обособленно стоит вирус курчавости картофеля. По своей биологии этот вирус удивительным образом напоминает некоторые вирусы растений, содержащие однонитчатую РНК, однако вирус курчавости картофеля содержит двухспиральную ДНК с с молекулярной массой около 1,3×10 дальтон. Изометрические частицы вируса имеют диаметр около 23 нм (Sarkar, 1973, 1976). Даже при таком беглом рассмотрении легко заметить, что вирус Chlorococcum резко отличается от ЛНК-содержащих вирусов высших растений.

С другой стороны, среди вирусов водорослей известно много представителей с фагоподобным строением, имеющих линейную двухспиральную ДНК. Это хорошо охарактеризованные к настоящему времени цианофаги. Однако диаметр капсиды самого крупного цианофага равен 100 нм, молекулярная масса ДНК различных цианофагов варьирует в пределах от 27 х I06 до 62 х I06 дальтон и, что самое важное, все известные цианофаги развиваются только в клетках прокариотических сине-зеленых водорослей (Padan, Shilo, 1973; Sherman, Brown, 1978; Горю-шин, 1980; Худяков, Матвеев, 1981).

Из всех охарактеризованных вирусов эукариотических водорослей только два. можно сравнить с вирусом Chlorococcum • Это вирус Cylindrocapsa (Hoffman, Stanker, 1976; Stanker et al." 1981) и вирус HVCV-1 (Meinte et al. t 1981; Van Btten et al", 1981, 1982) Диаметр частиц вирусов Cylindrocapsa и HVCV-1 составляет 200 — 230 нм и 170 — 180нм соответственно. Оба вируса содержат двухспиральную ДНК с молекулярной массой 175 — 190 х Ю6 дальтон и 155 х I06 дальтон. В состав вирусов входит 10 и 19 полипептидов, причем один является главным. Вирус Cylindrocapsa поражает зооспоры зеленой нитчатой водоросли Cylindrocapsa geminella, а. вирус HVCV-1 реплицируется в клетках хлорококко-в о й водоросли Chlorella t причем в момент адсорбции вируса на, клеточной стенке у него появляется отросток, напоминающий отросток бактериофага. Однако более существенными оказываются различия этих двух вирусов с вирусом Chlorococcunu К ним прежде всего следует отнести то, что репликация обоих вирусов происходит в ядре, а не в цитоплазме. Помимо этого, у вируса Cylindrocapsa никогда не обнаруживался отросток. Биология этих двух вирусов практически не изучена. Поэтому сейчас было бы преждевременно объединять вирус Chlorocoocum и вирусы Cylindrocapsa и HVCV-1 в одну группу.

Насколько нам известно, из всех существующих групп вирусов есть только одна, к которой можно было бы отнести вирус Chlorococcum — это так называемая группа икосаэдрических цитоплазматических дезоксирибовирусов (ИЦД-вирусы). Для того, чтобы какой-либо вирус можно было поместить в эту группу необходимо и достаточно выполнение трех условий: Iвирус должен быть икосаэдрическим- 2 — его репликация должна осуществляться в цитоплазме- 3 — вирус должен содержать ДНК (Kelly, Robertson, 1973; Goorha, Granoff, 1979). К этой группе относятся самые различные вирусы, инфицирующие многие виды организмов, включая млекопитающих, амфибий, рептилий, рыб, насекомых, моллюсков и простейших, а также высшие растения и грибы. Несмотря на то, что к этой группе относится более сорока вирусов, охарактеризованных среди них немного. Размеры ИЦЦ-вирусов варьируют от 50 нм до ЗООнм. Плавучая плотность вирусных частиц в хлориде цезия колеблетq ся около значения 1,3 г"см. Как следует ожидать из значительных различий в размерах ЩЦ-вирусов, молекулярная масса с их ДНК варьирует в весьма широких пределах от 4,3×10 до с.

397×10 дальтон, при этом ДНК многих вирусов по содержанию гуанина и цитозина относится к АТ-типу. Число полипептидов, входящих в состав вирионов, также варьирует в широких пределах от 2-х до 28-и, однако, почти во всех случаях имеется главный полипептид.

Таким образом, вирус Chlorococcuat отвечает всем требовав ниям и, следовательно, может быть включен в группу ИЦЦ-вирусов. Тем не менее необходимо отметить, что ни один из ЖЩвирусов не имеет отростка, а проникновение в клетку осуществляется посредством пиноцитоза. Поэтому логичнее было бы считать вирус сыогососсиш первым и пока единственным представ вителем специфической, с точки зрения морфологии и биологии, группы вирусов эукариотических водорослей.

Простота и эффективность разработанного метода очистки и концентрирования, позволяющего получать большие количества высокоочищенного препарата вируса СЫогососсит, и наличие методов его количественного определения делают систему вирус — эукариотическая водоросль с. аЛшЛша весьма удобной моделью как для детальных биохимических исследований, так и для изучения различных аспектов развития ДНК-содержащих вирусов в клетках эукариотических фотосинтезирующих микроорганизмов.