Направленный поиск новых блокаторов 5-НТ3-рецепторов среди прооизводных индола и бензимидазола и изучение их фармакологических свойств

Актуальность проблемы. Важную роль в регуляции функций различных органов и систем выполняет серотонинергическая система [Сергеев П., Шимановский Н., Петров В., 1999; Мирзоян Р. и соавт., 2000; Monassier L. et al., 2010]. Большое значение отводится, в частности, третьему типу серотониновых рецепторов (5-ШУрецепторам), которые принимают участие в запуске рвотного рефлекса и восприятии болевых ощущений, осуществлении когнитивных функций и реакций эмоционально-волевой сферы, а также опосредуют изменение частоты сердечных сокращений и модулируют висцеральную чувствительность, моторику и секрецию желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) [Giordano J., Shultea Т., 2004; Kovac А., 2006; Mossner R. et al., 2007; Шульпекова Ю. О., 2011]. В связи с этим нарушение серотонинергической передачи в различных отделах центральной нервной системы (ЦНС) и на периферии является патогенетическим звеном таких заболеваний и патологических состояний, как острая тошнота и рвота, синдром раздраженного кишечника (СРК), неврозы, воспаление, болевые синдромы [Farber L. et al., 2004; Maleki-Dizaji N. et al., 2010].

Средства, блокирующие 5-НТ3-рецепторы, способны во многом устранять указанные нарушения. Однако препаратов с таким механизмом действия, разрешённых к использованию в практической медицине, в настоящее время существует немного, и они обладают целым рядом нежелательных эффектов, среди которых токсическое поражение печени, развитие аллергических реакций, нарушения зрения, расстройство функций нервной системы [Goodin S., Cunningham К., 2002]. С учётом этого, с целью разработки новых оригинальных отечественных лекарственных препаратов, лишённых этих недостатков, представляется актуальным поиск новых соединений с 5-НТ3-антагонистическим действием среди молекул, содержащих функционально-значимый фармакофор [Hibert М. et al., 1990]. К таким соединениям относятся производные индола и бепзимидазола. О перспективности поиска внутри данных классов соединений свидетельствуют ранее проведенные в ВолгГМУ исследования [Киабия С., 2003; Спасов А. и соавт., 2006; Яковлев Д., 2007; Черников М., 2008].

Настоящее исследование является составной частью научно-исследовательской работы «Изучение рецепторной активности синтетических гетероциклических азотсодержащих соединений» (№ государственной регистрации 1 200 809 579), входящей в план НИР ГБУ «Волгоградский медицинский научный центр» на 2008;2010 гг., и работы «Поиск и изучение фармакологической активности новых производных конденсированных гетероциклических систем» (№ государственной регистрации 1 200 609 440), входящей в план НИР Волгоградского государственного медицинского университета на 2007;2012 гг. Тема работы была утверждена на заседании Учёного Совета Волгоградского государственного медицинского университета (протокол № 8 от 15.04.2009 г.).

Цель исследования. Направленный поиск новых соединений, обладающих блокирующей активностью по отношению к 5-НТ3-рецепторам, среди производных индола и бензимидазола, а также изучение их фармакологических свойств. Задачи исследования.

1. Провести прогнозирование т зШсо уровня 5-НТ3-блокирующей активности новых производных индола и бензимидазола методами 2Б-С>8А11 анализа.

2. Изучить потенциально активные по результатам прогноза т бШсо соединения на предмет выявления у них 5-НТ3-блокирующей активности в эксперименте.

3. Произвести анализ зависимости 5-НТ3-антагонистического действия соединений от их химической структуры и физико-химических свойств.

4. Определить для наиболее активных соединений показатели концентрационной зависимости 5-НТ3-блокирующего эффекта 1С5о, рА2, рАю и показатель острой токсичности 1Х)5о, а также рассчитать условный терапевтический индекс.

5. Изучить эффективность наиболее активных соединений на модели цисплатин-индуцированной рвоты у собак.

6. Исследовать транквилизирующее действие наиболее активных соединений на конфликтных и неконфликтных моделях экспериментального анксиогенеза.

7. Изучить анальгезирующую активность наиболее активных веществ веществ на моделях центральной и периферической гиперальгезии.

8. Оценить противодиарейные свойства наиболее активных веществ на моделях серотонин-индуцированпой диареи у мышей и стресс-индуцированной дефекации у крыс.

9. Исследовать взаимодействие наиболее активных соединений с 5-НТ2- и 5-НТ4-рецепторами, а также с веществами, модулирующими активность основных нейромедиаторных систем организма.

10.Изучить нейротоксические эффекты наиболее активных соединений. Научная новизна. Было впервые выявлено, что Ы'-замегцённые имидазо[1,2-а]бензимидазолы, амиды 2-амино-З-индолилакриловых кислот и 1,2-аминоспирты ряда индола являются перспективными классами для поиска новых веществ с 5-НТз-антагонистическим действием. Было установлено, что наибольший вклад в развитие данного вида активности И1-замещённых имидазо[1,2-а]бензимидазолов вносит наличие пирролидинолибо пиперидинопропильного заместителя в К1-положении и 4-фторфенильного радикала у 2-го атома углерода гетероциклического ядравысокие значения показателя липофильности ядра и радикала в Ы1-положении и максимального положительного заряда на атомах этого же заместителя, а также низкое значение среднего заряда атомов радикала в С2 положении. Для производных индола было показано, что наибольшее значение для развития их 5-НТ3-антисеротонинового действия имеет сочетание в структуре молекулы этильной группировки в качестве заместителя в положении 1Я9 с наличием диэтиламиноэтильного остатка и фенильного кольца в составе радикала у 7-го углеродного атома. Для наиболее активного вещества под лабораторным шифром РУ-1276 было установлено, что оно в 1,6 раза превосходит препарат сравнения ондансетрон по условному терапевтическому индексу. На моделях экспериментальной патологии было выявлено, что вещество РУ-1276 обладает выраженными противорвотными, а также противодиарейными, анксиолитическими, анальгетическими свойствами, и было продемонстрировано, что наблюдаемые эффекты основаны на блокаде 5-НТ3-рецепторов. Было также показано, что в реализацию нейротропных эффектов соединения РУ-1276 вовлечён комплекс медиаторных систем, включая холинергическую и ГАМК-ергическую.

Научно-практическая ценность работы. Установлено, что прогнозирование т бШсо уровня 5-НТ3-антисеротониновой активности в программном комплексе «Микрокосм» 5.2 с последующей экспериментальной проверкой является эффективным средством оптимизации поиска новых 5-НТ3-антагонистов среди производных индола и бензимидазола. Выявленные закономерности между химической структурой, физико-химическими свойствами и уровнем 5-НТ3-антагонистической активности соединений могут быть использованы при направленном синтезе новых соединений с высоким уровнем 5-НТ3-блокирующего действия. Полученные данные о наличии у соединения РУ-1276 выраженного противорвотного и умеренно выраженного противодиарейного действия позволяют планировать расширенное доклиническое изучение данного вещества.

Реализация результатов исследования. Прогноз уровня 5-НТ3-антагонистической активности с помощью программного комплекса «Микрокосм» 5.2 используется на кафедре фармакологии и НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета, в лабораториях ГБУ «Волгоградский медицинский научный центр» как средство оптимизации поиска высокоактивных блокаторов 5-НТ3-рецепторов. Установленные закономерности между 5-НТ3-антагонистической активностью изученных соединений и их химической структурой и физико-химическими свойствами учитываются при синтезе новых соединений с предполагаемой высокой 5-НТ3-блокирующей активностью в НИИ физической и органической химии Южного федерального университета. Результаты работы используются в лекционных курсах на кафедрах фармакологии, фармацевтической химии, фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета, кафедре фармакологии Воронежской государственной медицинской академии, кафедре общей и клинической фармакологии Ижевской государственной медицинской академии.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. М'-замещённые имидазо[1,2-а]бензимидазолы, амиды 2-амино-З-индолилакриловых кислот и 1,2-аминоспирты ряда индола являются перспективными классами соединений для поиска новых блокаторов 5-НТ3-рецепторов.

2. Прогноз ш бШсо уровня 5-НТ3-блокирующей активности в программном комплексе «Микрокосм» 5.2 с последующей экспериментальной проверкой позволяет оптимизировать поиск 5-НТ3-антагонистов среди производных индола и бензимидазола.

3. Наиболее высоким уровнем 5-НТ3-блокирующей активности из всех изученных веществ обладает соединение под лабораторным шифром РУ-1276, превосходящее препарат. сравнения ондансетрон по условному терапевтическому индексу в 1,6 раза.

4. Соединение РУ-1276 обладает противорвотньши, транквилизирующими и обезболивающими и противодиарейными свойствами.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на XIII региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2008 г.) — 66−69-й итоговых научных конференциях студентов и молодых ученых Волгоградского государственного медицинского университета (Волгоград, 2008;2011 гг.) — 55-й и 56-й региональных научно-практических конференциях профессорско-преподавательского коллектива Волгоградского государственного медицинского университета (Волгоград, 2008;2009) — VII всероссийской конференции с молодёжной научной школой «Химия и медицина. ОРХИМЕД-2009» (Уфа, 2009) — IV-V международной Пироговской студенческой научной конференции (Москва, 2009;2010) — XVI-XVII Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 20 092 010) — 2-м международном конгрессе «ЕвразияБио-2010» (Москва, 2010 г.) — 5-й международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2010) — 2-м всероссийском научно-практическом семинаре для молодых ученых «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии» (Волгоград, 2010) — 3-м всероссийском научно-практическом семинаре для молодых ученых «Достижения молекулярной медицины как основа разработки инновационных лекарственных средств» (Волгоград, 2011) — XVI всероссийской научно-практической конференции «Молодые учёные в медицине» (Казань, 2011 г.) — XI региональном конгрессе Европейской коллегии по нейропсихофармакологии (Санкт-Петербург, 2011) — 17-й междисциплинарной международной конференции «Стресс и поведение» (Санкт-Петербург, 2012), IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 26 работ, из них 5 — в журналах, входящих в перечень ведущих периодических изданий, рекомендованных ВАКом, в том числе патент на изобретение № 2 438 669 (зарегистрировано в.

Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10.01.2012 г.).

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 191 странице машинописного текста, иллюстрирована 12 рисунками и 39 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов (глава 2), экспериментальной части (главы 3−8), обсуждения результатов (глава 9), выводов и списка литературы, включающего 31 отечественный и 192 зарубежных источника.

выводы.

1. М'-замещённые имидазо[1,2-а]бензимидазолы, амиды 2-амино-З-индолилакриловых кислот и 1,2-аминоспирты ряда индола являются перспективными классами веществ для поиска 5-НТ3-антагонистов. Три из пяти изученных 1,2-аминоспиртов индольного ряда и 8 из 13 изученных амидов 2-амино-З-индолилакриловых кислот обладали 5-НТ3-блокирующим действием. Среди 9 изученных Ы'-замещённых имидазо[1,2-а]бензимидазолов 5-НТз-антисеротониновые свойства были выявлены у 6 соединений, из них 2 превосходили по уровню активности препарат сравнения ондансетрон. Среди 9 изученных №-замещённых имидазо[1,2-а]бензимидазолов лишь одно соединений проявило статистически значимый уровень 5-НТ3-блокирующего действия.

2. Прогноз т бШсо уровня 5-НТз-блокирующей активности производных индола и бензимидазола с применением методов 2Э-С)8А11 анализа является эффективным средством оптимизации направленного поиска новых 5-НТ3-антагонистов.

3. Высокий уровень 5-ШУблокирующего эффекта М'-замещённых имидазо[1,2-а]бензимидазолов определяется наличием ггарролидино-либо пиперидинопропильного заместителя в 1Ч1 -положении и 4-фторфенильного радикала у 2-го атома углерода гетероциклического ядравысокими значениями показателя липофильности ядра и радикала в Ы1 -положении и максимального положительного заряда на атомах этого же заместителя, а также низким значением среднего заряда атомов радикала в С2 положении. Для производных индола наибольший вклад в развитие 5-НТ3-антисеротонинового действия вносит сочетание в структуре молекулы этильной группировки в качестве заместителя в положении N с наличием диэтиламиноэтильного остатка и фенильного кольца в составе радикала у 7-го углеродного атома.

4. Наиболее выраженная 5-НТ3-антагонистическая активность выявлена у вещества под лабораторным шифром РУ-1276, превосходящего препарат сравнения ондансетрон по условному терапевтическому индексу в 1,6 раза.

5. Вещество РУ-1276 в дозах 0,1 и 1 мг/кг на модели цисплатин-индуцированной рвоты у собак обладает противорвотной активностью, по степени выраженности равной активности препарата сравнения ондансетрона.

6. Вещество РУ-1276 при однократном внутрибрюшинном введении в дозе 1,5 мг/кг проявляет анксиолитические эффекты на неконфликтных моделях анксиогенеза, а также в дозах 1,5 и 7,5 мг/кг обладает периферической анальгетической активностью на модели адъювантного артрита и во второй фазе формалинового теста.

7. Соединение РУ-1276 в дозе 7,5 мг/кг на моделях экспериментальной дисфункции кишечника оказывает иротиводиарейное действие, по степени выраженности равное активности препарата сравнения лоперамида.

8. Соединение РУ-1276 неактивно в отношении 5-НТ2аи 5-НТ4-рецепторов in vitro. В тестах по взаимодействию с модуляторами основных нейромедиаторных систем ЦНС не изменяет эффекты 5-гидрокситриптофана, никотина, апоморфина, галоперидола, клофелинаоднако модулирует эффекты ареколина, пикротоксина, L-ДОФА и фенамина.

9. Соединение РУ-1276 в средней терапевтической дозе 1,5 мг/кг не обладает нейротоксическим действием. Выраженные нарушения неврологического статуса наблюдаются лишь в дозе, в семнадцать раз превышающей среднюю терапевтическую, и включают изменение характера походки, угнетение различных видов активности животных, снижение мышечного тонуса, ослабление рефлекторных реакций и снижение частоты дыхания.

8.2.

Заключение

.

По результатам изучения нейротоксического профиля соединения РУ-1276 показано, что изучаемое вещество при однократном внутрибрюшинном введении в средней терапевтической дозе 1,5 мг/кг, равно как и при увеличении вводимой дозы в 2,5 раза, не оказывало влияния на неврологический статус экспериментальных животных. Первые побочные эффекты в виде изменения уровня подвижности животных в актометре и характера двигательной активности в тесте «открытое поле» (уменьшение горизонтальной и вертикальной активности), а также незначительного снижения слухового рефлекса, наблюдались при введении вещества в дозе 7,5 мг/кг, что пятикратно превышало среднюю терапевтическую дозу. При дальнейшем увеличении вводимой дозы вещества до 22,5 мг/кг спектр побочного действия изучаемого соединения расширялся за счёт появления миорелаксирующего эффекта, проявлявшегося в угнетении ипселатерального сгибательного рефлекса, а также ухудшении способности животных удерживаться на проволоке и вращающемся стержне. В максимальной вводимой дозе 26 мг/кг, в семнадцать раз превышающей среднюю терапевтическую, наблюдались выраженные токсические эффекты, характеризовавшиеся изменением походки животных, значительным угнетением общей двигательной, исследовательской и эмоциональной активности, выраженным снижением мышечного тонуса, а также ослаблением рефлекторных реакций и снижением частоты дыхания. tf.

ГЛАВА 9. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Потенциальная терапевтическая роль антагонистов третьего подтипа серотониновых рецепторов связана с наличием у них различных видов фармакологической активности, а именно противорвотных, антииарейных, транквилизирующих и анальгезирующих свойств [Zeitz К. et al.- 2002; Nadaraja S. et al., 2012; Yakovlev D. et al., 2011]. Однако препаратов с таким механизмом действия, разрешённых на сегодняшний день к использованию в практической медицине, в настоящее время существует немного. Кроме того, их применение сопряжено с возникновением у пациентов целого ряда нежелательных эффектов, среди которых токсическое поражение печени, развитие аллергических реакций, нарушения зрения, расстройство функций нервной системы [Goodin S., Cunningham К., 2002]. Следует также отметить, что отсутствие подобных препаратов отечественного производства во многом осложняет широкое применение данной группы средств в нашей стране. В этой связи весьма актуальным направлением современной экспериментальной фармакологии является поиск новых 5-НТ3-антагонистов с целью создания на их основе новых лекарственных средств для коррекции патологий, связанных с нарушением серотонинергической регуляции.

Известно, что одним из условий проявления 5-НТ3-антагонистических свойств является наличие в структуре молекулы вещества трёх составляющих: положительно заряженного амина, жёсткого ароматического/гетероароматического ядра и электроотрицательного участка, в роли которого часто выступает карбонильная группа или её изостеричный эквивалент [Hibert М. et al., 1990]. Этому условию соответствуют соединения из группы конденсированных азолов. Более детальный анализ с привлечением литературных данных последних лет позволяет сузить область поиска к производным бензимидазола и индола, что подтверждается, с одной стороны, принадлежностью к этим химическим классам ряда известных 5-НТ3-блокирующих лигандов, таких как.

1, трописетрон, доласетрон, гранисетрони, с другой стороны, многочисленными экспериментальными данными [Спасов А. и соавт., 2001; Спасов А. и соавт., 2006; Яковлев Д. С., 2007].

Настоящее исследование явилось продолжением цикла работ по поиску 5-НТ3-антагонистов, проводимых на кафедре фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета [Киабия С., 2003; Яковлев Д., 2007; Черников М., 2008].

Проведённое на первом этапе работы компьютерное прогнозирование 5-НТ3-блокирующей активности для 70 новых соединений, синтезированных в НИИ ФОХ Южного федерального университета, позволило предсказать наличие 5-НТ3-антагонистических свойств у 34 соединений. 18 из них, представляющих собой Ы'-замещённые имидазо[1,2-а]бензимидазолы и №-замещённые имидазо[1,2-а]бензимидазолы, а также 18 соединенийпроизводных индола были впоследствии изучены в экспериментальном скрининге на модели сокращения изолированной подвздошной кишки морской свинки in vitro [Yoshida S. et al., 2007].

По результатам проведённого скрининга в ряду N1-замещённых имидазо[1,2-а]бензимидазолов из девяти изученных соединений шесть обладали 5-НТ3-блокирующим действием, из них два превосходили по уровню активности препарат сравнения ондансетрон, четыре — проявили умеренный уровень активности. Восемь из 13 амидов 2-амино-З-индолилакриловых кислот и три из пяти 1,2-аминоспиртов индольного ряда обладали умеренно выраженными 5-НТ3-антисеротониновыми свойствами. Среди девяти изученных №-замещенных имидазо[1,2-а]бензимидазолов статистически значимый уровень 5-НТ3-антагонистического действия выявлен лишь для одного соединения.

Дальнейшее исследование зависимости 5-НТ3-блокирующего эффекта^{-замещенных} имидазо[1,2-а]бензимидазолов от химической структуры и физико-химических свойств методами подструктурного анализа с дальнейшим эмпирическим изучением позволило установить, что I i наибольший вклад в развитие данного вида биологической активности вносит наличие пирролидинолибо пиперидинопропильного заместителя в^{-положении} и 4-фторфенильного радикала у 2-го атома углерода гетероциклического ядравысокие значения показателя липофильности ядра и радикала в ТчГ'-положении и максимального положительного заряда на атомах этого же заместителя, а также низкое значение среднего заряда атомов радикала в С положении. Напротив, отрицательная корреляционная связь была выявлена для наличия при 1-м атоме азота морфолинопропильного/ морфолиноэтильного заместителей, равно как и метального, и 4-бромфенила в положении С, а также положительного заряда ядра, низких значений липофильности и величины положительного заряда радикала при Ы1, а также высоких значений положительного заряда атомов радикала у 2-го атома углерода.

Для производных индола было показано, что наибольшее значение для развития их 5-НТ3-антисеротонинового действия имеет сочетание в структуре молекулы этильной группировки в качестве заместителя в положении № с наличием диэтиламиноэтильного остатка и фенильного кольца в составе радикала у 7-го углеродного атома.

Полученные данные могут быть использованы как средство оптимизации направленного синтеза новых соединений с предполагаемой высокой 5-НТ3-блокирующей активностью.

По итогам экспериментального поиска было найдено два высокоактивных соединения, РУ-1275 и РУ-1276, относящихся к классу М1-производных имидазо[1,2-а]бензимидазола. Для этих веществ была изучена концентрационная зависимость антисеротонинового эффекта и определены величины 1С5о, рА2, рА)0, показатель острой токсичности ЬП50, а также, в качестве интегрального показателя свойств соединений, был рассчитан условный терапевтический индекс. В итоге было установлено, что соединение РУ-1276 превосходит по данному показателю как вещество РУ-1275, так и препарат сравнения ондансетрон, что дало основание для расширенного изучения его фармакологических свойств на моделях экспериментальной патологии.

На следующем этапе работы были изучены различные виды активности соединения РУ-1276, связанные с блокадой 5-НТ3-рецепторов в условиях целостного организма. В первую очередь представляло интерес изучение противорвотного и противодиарейного действия как наиболее специфичных эффектов для данной группы веществ.

Противорвотное действие 5-НТ3-блокаторов реализуется в условиях аномально повышенного высвобождения эндогенного серотонина в системный кровоток (как, например, при раздражении энтерохромаффинных клеток слизистой оболочки кишечника цитостатическими препаратами) и основывается на их способности препятствовать взаимодействию серотонина с 5-НТ3-рецепторами триггерной зоны мозга, а также окончаний n. vagus и нейронов подслизистого сплетения кишечника, тем самым предотвращая развитие рвотного акта [Roberts S. et al., 2012]. Исходя из механизма развития патологии, для оценки противорвотного потенциала соединения РУ-1276 была использована экспериментальная модель цисплатин-индуцированной рвоты у собак [Fukui H. et al., 1992]. В результате исследования было показано, что изучаемое вещество эффективно снижало интенсивность рвоты по сравнению с показателями контрольной группы животных, уменьшая число рвотных приступов за период наблюдения в 1,7 раза при введении в дозе 0,15 мг/кг и в 2 раза — в дозе 1,5 мг/кг, оказывая эффект, равный эффекту препарата сравнения ондансетрона в эквимолярной дозе.

При этом, учитывая, что серотонинергический механизм не является единственно возможным в запуске рвотного акта, был проведён ряд тестов, позволяющих изучить возможный вклад дофаминергического компонента в развитие антиеметического эффекта вещества РУ-1276. По итогам экспериментов с введением агониста дофаминовых рецепторов апоморфина в широком диапазоне доз было показано, что соединение РУ-1276 не оказывает влияния на его эффекты. Это позволяет с большой долей уверенности считать, что выявленный прогиворвотный эффект изучаемого соединения обусловлен его взаимодействием с третьим типом серотониновых рецепторов.

Вторым специфическим видом фармакологического действия, характерным для некоторых 5-НТ3-блокирующих средств, является противодиарейное действие, что позволяет успешно применять препараты этой группы при диарейной форме СРК [Lee К. et al., 2011]. Блокируя 5-НТ3-рецепторы на окончаниях первичных афферентных волокон ЖКТ, они угнетают опосредованную ими секрецию ацетилхолина и, как следствие, устраняют основные симптомы заболевания, нормализуя ритм и амплитуду сокращений кишечника и улучшая всасывание жидкости [Heading R. et al., 2006].

Способность соединения РУ-1276 модулировать функциональное состояние кишечника была изучена на ряде моделей [Miyata К. et al., 1992; Miyata К. et al., 2001]. В результате экспериментов было показано, что изучаемое вещество в 2,5 раза снижало интенсивность стресс-индуцированной дефекации у крыс по сравнению с контрольной группой животных, не уступая по эффективности традиционному противодиарейному средству лоперамиду. На модели серотонин-индуцированной диареи у мышей также было выявлено положительное влияние вещества РУ-1276 по устранению симптомов экспериментальной патологии. При этом расширенное изучение возможного механизма, посредством которого реализуется противодиарейный эффект, позволило установить, что соединение РУ-1276 в концентрациях, наиболее характерных для специфического рецепторного действия веществ, не обладало влиянием на М-холинорецепторы, которым, наравне с серотониновыми, отводится ключевая роль в регуляции моторики ЖКТ. Это даёт основания считать, что в основе противодиарейного действия вещества РУ-1276 лежат его 5-НТ3-блокирующие свойства.

Из литературных данных о распределении и функциональной роли серотониновых рецепторов третьего типа известно, что наиболее высокая плотность этих структур обнаруживается в головном и спинном мозге [Thompson A., Lummis S., 2006; Barnes N. et al., 2009]. Триггерная зона, о которой упоминалось выше, является лишь одним из представительств 5-НТ3-рецепторов в ЦНС. Они локализованы также в различных отделах коры, гиппокампе, прилежащем ядре, миндалевидном теле, задних рогах спинного мозга [Tecott L. et al., 1993]. Одной из важнейших функций центральных 5-ШУрецепторов считается участие в процессах обучения и запоминания, а также регуляция эмоционального статуса [Jones В. et al., 1988; Johnson В. et al., 2000]. Подтверждением этого служит, в частности, тот факт, что у мышей с нокаутом по генам, кодирующим белки субъединиц 5-НТз-рецептора, наблюдается выраженное снижение уровня тревожности [Kelley S. et al., 2003; Bhatnagar S. et al., 2004]. Анксиолитический потенциал 5-НТз-блокирующих средств на примере ондансетрона был продемонстрирован в работах M. Roychoudhury и S. Kulkarni [1997]. В более поздних отечественных исследованиях также были показаны транквилизирующие свойства нового соединения РУ-1204 на различных моделях анксиогенеза [Яковлев Д., 2007; Яковлев Д. и соавт., 2011].

В то же время не все 5-НТ3-блокирующие средства демонстрируют столь выраженное анксиолитическое действие. Так, например, итасетрон проявил таковое лишь в трёх исследованиях из одиннадцати проведённых [Griebel G., 1995]. Кроме того, встречаются данные, согласно которым определённое значение имеет длительность введения препаратов, что отражено в работах R. Rodgers и соавт. [1996], в которых ондансетрон не оказал ожидаемого транквилизирующего эффекта при субхроническом введении мышам. Неоднозначные суждения высказываются также о зависимости эффекта от механизма анксиогенеза [Castejon A., Cubeddu L., 1998].

Учитывая вышесказанное, на следующем этапе настоящего исследования было предпринято изучение анксиолитического потенциала соединения РУ-1276 на ряде моделей экспериментального анксиогенеза при остром и хроническом введении и в результате было показано, что для изучаемого вещества при однократном внутрибрюшинном введении в дозе 1,5 мг/кг характерно анксиолитическое действие на ненаказуемых моделях анксиогенеза, сравнимое по уровню эффекта с традиционным бензидиазепиновым транквилизатором диазепамом. При этом использование моделей наказуемого поведения не выявило анксиолитических свойств ни при однократном, ни при длительном введении, что согласуется с данными Castejon и Cubeddu [1998] о том, что наказуемое поведение в гораздо меньшей степени корректируется 5-НТ3-антагонистами по сравнению с ненаказуемыми ситуациями.

Ещё одним перспективным направлением в изучении свойств 5-НТ3-блокаторов является оценка их анальгетического профиля. Эта группа средств постепенно находит всё более широкое практическое применение в лечении фибромиалгии, артритов, болевого синдрома при СРК [Crowell M., 2001; Stratz Т., Muller W., 2003; Spath M. et al, 2004]. Механизм их обезболивающего действия, однако, к настоящему моменту исследован неполно и представляется во многом противоречивым. Для 5-НТ3-рецепторов показана локализация в различных отделах как восходящей ноцицептивной, так и нисходящей антиноцицептивной систем, что обусловливает сложность механизмов, вовлечённых в их обезболивающий эффект [Giordano J., Schultea T., 2004]. Считается, что одну из наиболее важных ролей в его развитии играет подавление серотонин-опосредованного выброса субстанции Р, а также угнетение серотонин-индуцированного синтеза цитокинов и простагландинов, особенно в условиях воспаления [Seidel M. et al., 2008]. При этом остаётся неясным, преобладает ли в формировании этого эффекта центральный механизм антиноцицепции, или же доминирующее влияние принадлежит периферической анальгезии.

Принимая во внимание всё вышесказанное, оценка обезболивающего действия изучаемого соединения РУ-1276 проводилась на различных | моделях гиперальгезии, позволяющих оценить вклад разных механизмов обезболивания в развитие изучаемых эффектов.

На модели спинальной гиперальгезии при электрическом раздражении хвоста крыс, а также в тесте «горячая пластина» изучаемое вещество практически не проявило эффекта, что свидетельствует об отсутствии у соединения РУ-1276 способности влиять на передачу болевого импульса в пределах ЦНС, в частности, спинного мозга, ствола и таламуса. Дальнейшее изучение на модели хронического воспаления при введении адъюванта Фрейнда показало, что исследуемое вещество в средней и высшей терапевтических дозах в среднем на 40% повышало болевой порог животных по сравнению с животными, у которых была сформирована гиперальгезия. С этими данными согласуются результаты формалинового теста, в котором изучаемое вещество, также в обеих изученных дозах, проявило активность во второй фазе эксперимента, отражающей влияние на болевую чувствительность в ходе развивающегося воспалительного процесса в периферических тканях. При этом в первой фазе, отражающей активацию чувствительных С/А8-волокон и возникновение первичного потока болевой импульсации в ответ на химическое раздражение, эффекта РУ-1276 не наблюдалось, равно как и на модели механического раздражения, приложенного через 2 минуты после введения формалина.

Так, наличие у вещества РУ-1276 анальгетической активности на модели адъювантного артрита и во второй фазе формалинового теста в совокупности с отсутствием влияния на проведение болевых импульсов в структурах ЦНС, позволяет сделать вывод о том, что механизм анальгетического действия изучаемого соединения является периферическим и в основе его лежит блокирование 5-НТ3-рецепторов и последующее устранение эффектов серотонина как медиатора ноцицептивной реакции, особенно в условиях воспаления.

Таким образом, в экспериментах in vitro, а также на ряде моделей экспериментальной патологии in vivo показано, что эффекты соединения РУ-1276 опосредованы блокадой третьего типа серотониновых рецепторов. При этом проведённые тесты не позволяют полностью исключить его возможного влияния также и на другие типы 5-НТ-рецепторов. Кроме того, известно, что серотониновая нейропередача находится в кооперативном взаимодействии с другими нейромедиаторными системами организма, и изменение состояния одной из них неизбежно влечёт за собой изменения в функционировании других. В частности, показано, что наиболее тесная взаимосвязь существует между обменом серотонина, ацетилхолина, ГАМК и дофамина [Farber L. et al., 2004; Song Z. et al., 2011]. Это явилось предпосылкой для детального фармакологического анализа эффектов соединения РУ-1276 с целью уточнения возможных аспектов механизма его действия.

В серии экспериментов in vitro, позволяющих оценить влияние на 5-НТ4-рецепторы, изучаемое вещество не проявило способности к взаимодействию с данным рецепторным типом (см. рис. 12). Оно оказалось неактивно и при изучении 5-НТ2а-серотонинергической активности на модели серотонин-индуцированной активации тромбоцитов, что подтверждается также результатами поведенческого теста с введением 5-гидрокситриптофана, в котором вещество РУ-1276 не продемонстрировало влияния на специфический, вызванный 5-ГТФ, гиперкинез у мышей. В совокупности полученные данные убедительно свидетельствуют о высокой степени селективности действия вещества РУ-1276 в отношении третьего типа рецепторов серотонина по сравнению с другими типами 5-НТ-чувствительных клеточных структур.

При изучении влияния на холинергическую нейропередачу было показано, что для исследуемого соединения нехарактерно влияние на эффекты никотина, однако отмечена умеренно выраженная активность в тесте с ареколином. При этом периферическое М-холинергическое действие.

160 было уже изучено ранее в ходе работ по исследованию противодиарейных свойств вещества РУ-1276, где было показано отсутствие у него действия на периферические М-холинергические структуры (см. п. 4.2.2).

В опытах с веществами-модуляторами функционального состояния адренергической системы было выявлено, что изучаемое соединение не оказывает влияния на эффекты клофелина и резерпина, что является косвенным показателем отсутствия у него центрального адренергического действия.

При дальнейшем изучении выяснилось, что вещество РУ-1276 не изменяет эффекты Б2-антагониста галоперидола, что свидетельствует об отсутствии у него дофаминергического влияния. Эти результаты согласуются с результатами, полученными в серии тестов с апоморфином при изучении возможного дофаминергического компонента противорвотного действия изучаемого вещества (см. п. 4.1.2).

В то же время, была обнаружена способность соединения РУ-1276 усиливать эффекты малых доз L-ДОФА, что позволяет предположить у него наличие МАО-ингибирующего действия, которым, по всей видимости, обусловлена тенденция к усилению эффектов фенамина, выявленная в соответствующем тесте.

В заключительном тесте по оценке влияния на ГАМК-ергическую нейропередачу соединение РУ-1276 приводило к статистически значимому повышению числа судорожных приступов у экспериментальных животных, что говорит об усилении эффектов ГАМКА-антагониста пикротоксина. Эти результаты особенно интересны в свете предположения М. Miranda-Morales и соавт. [2007] о том, что ГАМКаи 5-НТ3-рецепторы могут быть организованы в единый кластер и, таким образом, возможна перекрёстная регуляция функционального состояния этих ионных каналов. Эта гипотеза на сегодняшний день пока не получила детальной разработки, но полученные данные в определённой степени согласуются с ней.

Таким образом, было установлено, что в реализации нейротропных эффектов соединения РУ-1276 участвует ряд медиаторных систем, включая, как минимум, холинергическую и ГАМК-ергическую. Эти результаты во многом согласуются с имеющимися на сегодня в литературе данными о взаимном влиянии и кооперации между собой нейромедиаторных систем цнс.

На заключительном этапе исследований изучался нейротоксический профиль вещества РУ-1276. Было установлено, что в однократной средней терапевтической дозе (1,5 мг/кг), равно как и при увеличении её в два с половиной раза, соединение не оказывало нежелательного действия. Первые побочные эффекты в виде снижения двигательной активности животных были отмечены при введении дозы, пятикратно превышающей среднюю терапевтическую и соответствующей 7,5 мг/кг. Выраженный характер отклонений неврологического статуса животных от нормы наблюдался лишь при введении соединения РУ-1276 в дозе 26 мг/кг, в 17 раз превышающей среднюю терапевтическую дозу. Картина интоксикации при этом сопровождалась значительным угнетением общей двигательной, исследовательской и эмоциональной активности, выраженным снижением мышечного тонуса, а также ослаблением рефлекторных реакций и снижением частоты дыхания,.

Таким образом, по результатам экспериментального поиска 5-Шублокаторов среди новых производных индола и бензимидазола с предшествующим прогнозом уровня активности средствами ИТ «Микрокосм» у.5.2 было установлено, что наиболее выраженными 5-НТз-антагонистическими свойствами обладают Ы1-замещённые имидазо[1,2-а]бензимидазолы. Максимально выраженное действие обусловливается наличием пирролидипо-/пиперидинопропильного заместителя у 1-го атома азота и 4-фторфенильного заместителя у 2-го атома углерода гетероциклического ядра, а также показателями липофильности целой молекулы и заместителя в N1-положении и зарядовыми.

I 2 характеристиками атомов в составе радикалов в N и С положениях.

В ходе работы было найдено соединение под лабораторным шифром РУ-1276, демонстрировавшее высокий уровень антагонистической активности в отношении третьего типа серотониновых рецепторов. В дальнейшем были изучены его противорвотные, противодиарейные, анксиолитические и анальгетические свойства, а также токсикологические параметры. Кроме того, для изучаемого вещества с использованием комплекса моделей in vivo и in vitro был проведён анализ возможных аспектов механизма действия.

Наличие у изучаемого соединения РУ-1276 выраженных антиеметических, а также противодиарейных, транквилизирующих и анальгетических эффектов позволяет рассматривать его как перспективное вещество для дальнейших расширенных доклинических фармакологических исследований.