Диплом, курсовая, контрольная работа
Помощь в написании студенческих работ

Биолюминесцентный молекулярный микроанализ на основе Ca2+-регулируемого фотопротеина обелина

Диссертация: Биолюминесцентный молекулярный микроанализ на основе Ca2+-регулируемого фотопротеина обелина
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Ассортимент современных химических реагентов, предлагаемый рядом фирм (Pierce, Sigma-Aldrich, Uptima и др.) весьма обширен и позволяет выбрать кросс-линкеры, осуществляющие соединение молекул с использованием доступных реакционно-способных групп на их поверхности — -NH2, -SH, -ОН, -СООН. Задачей экспериментатора состоит в том, чтобы подобрать такие условия коньюгирования, которые позволяют… Читать ещё >

Содержание

  • ГЛАВА 1. РЕКОМБИНАНТНЫЕ Са2±РЕГУЛИРУЕМЫЕ ФОТОПРОТЕИНЫ КАК РЕПОРТЕРНЫЕ БЕЖИ В МОЛЕКУЛЯРНОМ АНАЛИЗЕ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
    • 1. 1. Получение и очистка рекомбинантных Ca -регулируемых фотопротеинов
    • 1. 2. Получение биоспецифичных производных рекомбинантных фотопротеинов, пригодных для использования в качестве меток в микроанализе in vitro
      • 1. 2. 1. Химический синтез коньюгатов
      • 1. 2. 2. Получение бифункциональных химерных белков акворин -биоспецифичный полипептид
    • 1. 3. Биолюминесцентный молекулярный микроанализ с использованием акворина в качестве репортерного белка
      • 1. 3. 1. Биолюминесцентный иммуноанализ с использованием акворина как репортерного белка
      • 1. 3. 2. ДНК-гибридизационный анализ с использованием акворина в качестве репортерного белка
  • ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
  • ГЛАВА 3. ВЫ ДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНОГО ОБЕЛИНА
    • 3. 1. Экстракция апообелина из рекомбинантных клеток Е. coli (этапы 1−3)
    • 3. 2. Очистка апообелина ионообменной хроматографией в денатурирующих условиях (этап 4)
    • 3. 3. Активация апообелина целентеразином. (этап 5)
      • 3. 3. 1. Влияние природы восстановителя и его концентрации на эффективность активации апообелина
      • 3. 3. 2. Зависимость эффективности активации от остаточной концентрации мочевины
      • 3. 3. 3. Зависимость эффективности активации от pH активационного буфера
      • 3. 3. 4. Зависимость эффективности активации от концентрации апобелка
      • 3. 3. 5. Кинетика активации
    • 3. 4. Очистка обелина ионообменной хроматографией (этап 6)
    • 3. 5. Основные физико-химические свойства рекомбинантного обелина
  • ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ БИОСПЕЦИФИЧНЫХ КОНЬЮГАТОВ РЕКОМБИНАНТНОГО ОБЕЛИНА, ПРИГОДНЫХ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В КАЧЕСТВЕ МЕТОК В МОЛЕКУЛЯРНОМ АНАЛИЗЕ
    • 4. 1. Получение биоспецифичных коньюгатов обелина химическими методами
      • 4. 1. 1. Синтез биотинилированных производных
      • 4. 1. 2. Синтез коньгатов с другими гаптенами и с белками
    • 4. 2. Получение коньюгатов обелина в виде генетических химер
      • 4. 2. 1. Биотинилирование обелина in vivo
      • 4. 2. 2. Получение химерного белка proZZ-Obe
  • ГЛАВА 5. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ИММУНОАНАЛИЗ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОНЬЮГАТОВ ОБЕЛИНА В КАЧЕСТВЕ МЕТКИ
    • 5. 1. Биолюминесцентный иммуноанализ альфафетопротеина (АФП)
    • 5. 2. Биолюминесцентный иммуноанализ тиреотропина (ТТГ) и двух форм тироксина — общего (ТТ4) и свободного (FT4)
    • 5. 3. i, Бйолюминесцентнышиммуноанализ инфекционных агентов.'
    • 5. 4. Био люминесцентный a иммуноанализ- антител к туберкулезному ТОКСИН^!.'-.'
    • 5. 5. Одновремешшй биолюминесцентный иммуноанализ. двух антигенов в. одном образце с ипользованием мутантных вариантов обелина с измененными^ спектрами биолюминесценции
    • 5. 6. Биолюминесцентный иммуноанализ двух антигенов в одном образце с ипользованием обелина в тандеме с целентеразин-зависимой люциферазой
  • Metridia longa
    • 5. 6. 1. Выделение, очистка и некоторые физико-химические свойства целентеразин-зависимой рекомбинантной люциферазы Metridia longa (MLuc39)
    • 5. 6. 2. Биотинилирование MLuc39 и использование полученных производных в твердофазном микроанализе двух антигенов в одном образце в тандеме с обелином
  • ГЛАВА 6. БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ГИБРИДИЗАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ОБЕЛИНА
    • 6. 1. Твердофазный гибридизационный анализ в модельных системах
      • 6. 1. 1. Анализ на мелкодисперсном полимере ДМЭГ
      • 6. 1. 2. Анализ на поверхности микропланшет
    • 6. 2. Анализ продуктов ПЦР гена вируса гепатита С

Биолюминесцентный молекулярный микроанализ на основе Ca2+-регулируемого фотопротеина обелина (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Биолюминесценция — это излучение света в видимом диапазоне, происходящее в процессе жизнедеятельности живых организмов [Hastings J.W., 2001]. Хотя светящиеся организмы стоят на разных ступенях эволюционной лестницы — от бактерий до рыб, — все они имеют одинаковую природу свечения. Фактически, биолюминесценция — это хемилюминесцентная реакция, в которой происходит окисление субстраталюциферина, катализируемое специфическим ферментом — люциферазой. Все люциферазы принадлежат к классу оксигеназ и катализируют реакции окисления субстратов молекулярным кислородом, в результате чего образуются молекулы продукта в высокоэнергетичном (возбужденном) состоянии. При переходе в основное состоянии избыток энергии высвобождается в виде кванта света. Важным преимуществом биолюминесцентных реакций, по сравнению с хемилюминесцентными, является высокий квантовый выход, достигающий в некоторых случаях 90%. Этот факт предопределил перспективность создания сверхчувствительных и высокоспецифичных аналитических систем с использованием биолюминесцентных белков в качестве репортеров биоспецифического взаимодействия [Kricka L., 1988]. Сейчас люциферазы используются как репортерные белки во всех областях фундаментальной биологической науки, где требуется визуализация протекающих процессов — от изучения белок-белковых взаимодействий в отдельных клетках до поведенческих реакций организмов. Гены люцифераз широко используются для визуализации экспрессии генов в молекулярно-биологических и медицинских исследованиях. Люцифераза светляка используется как репортер в пиросеквенировании ДНК. Активно развивается применение люцифераз в аналитических методах in vitro для решения! широкого спектра аналитических задач — от экологического мониторинга среды обитания человека (интегральные биотесты) до молекулярной диагностики различных заболеваний и инфекций. применения фотопротеинов в качестве репортеров в анализе in vitro [Lewis J.C., Daimert S., 2000, Actor J., 2000]. Мощным стимулом для развития этого направления послужило клонирование кДНК ряда апофотопротеинов (акворина, обелина и других) в период с 1985;1995 и получение рекомбинантных белков, практически не отличающихся по своим физико-химическим свойствам от природных. В последующий период появился ряд работ, описывающий эффективное использование рекомбинантного фотопротеина акворина в качестве репортерного белка в иммуноанализе ряда биологически важных соединений, а также в гибридизационном анализе для решения целого ряда задач — от изучения механизмов регуляции экспрессии генов в ответ на различные стимулы, до определения генмодифицированных источников в пищевых продуктах. Эти исследования проводятся исключительно за рубежом, и хотя некоторые фирмы производят этот белок, его коммерческая стоимость велика, что делает его недоступным для широкомасштабного практического использования.

В-Институте биофизики СО РАН на протяжении последних 20-ти лет проводились интенсивные исследования биолюминесцентной системы гидроидного полипа Obelia longissima, обитающего в водах Белого моря. Свечение этого организма обусловлено наличием белка обелина, также принадлежащего семейству Са2±регулируемых фотопротеинов. Были получены в чистом виде и изучены* несколько изоформ природного обелина, клонирован ген апообелина, получены генетические конструкции для экспрессии рекомбинантного апообелина в клетках Е. coli, что обеспечило постоянный источник, рекомбинантного белка. Проведенные исследованиясоздали предпосылки? для, разработки высокоэффективных биолюминесцентных аналитических систем на основе обелина. Современнаяотечественная? медицина, фундаментальная? биология" и биотехнология нуждаются в новых высокочувствительных, высокоспецифичныхи- в то же время, недорогих методах, молекулярной диагностики. К создаваемым новым аналитическим системам предъявляются следующие основные требования:

1) высокая чувствительность, сравнимая с радиоизотопным анализом, но при этом все компоненты должны отличаться стабильностью и безопасностью для работы персонала- 2) доступность всех составляющих компонентов- 3) возможность проведения анализа в автоматическом режиме- 4) простота процедуры анализа, не требующая высокой квалификации персонала.

К сожалению, современные российские медицинские лаборатории в огромной степени оснащены либо морально устаревающими радиоизотопными диагностикумами, либо импортными аналитическими приборами и наборами реактивов. Последнее существенным образом отражается на стоимости анализа и делает отечественное здравоохранение зависимым от импортных поставок и состояния мирового рынка.

В этом аспекте разработка отечественных высокочувствительных, надежных и относительно недорогих диагностикумов является чрезвычайно актуальной задачей. Одним из ее решений может стать разработка диагностикумов на основе светоизлучающих белков и, в частности, на основе Са2±регулируемых фотопротеинов. Это определило направление исследований данной работы, ориентированной на комплексное исследование рекомбинантного Са2±регулируемого фотопротеина обелина применительно к биоаналитическим задачам, конечной целью которой является создание на его основе отечественных высокочувствительных надежных и простых для рутинного применения биолюминесцентных диагностикумов для определения социально-важных заболеваний и инфекций.

Целью настоящего исследования было создание биотехнологической основы нового направления молекулярного высокопроизводительного микроанализа с использованием рекомбинантного Са2±регулируемого фотопротеина обелина и его генетически-модифицированных аналогов, в. качестве биолюминесцентных репортеров.

Достижение поставленной цели требовало решения следующих задач:

1. Разработать высокоэффективную технологию получения рекомбинантного обелина и его мутантных аналогов в высокоочищенном виде.

2. Разработать способы получения производных обелина — химических коньюгатов и генноинженерных химер — с различными биоспецифичными молекулами, пригодных для использования в качестве высокочувствительных репортеров в анализе in vitro.

3. Показать перспективность применения обелиновых репортеров в иммуноанализе и ДНК-зондировании и обосновать конкурентноспособность ' предлагаемого нового направленйя биолюминесцентного молекулярного микроанализа.

Цель работы и комплекс задач сформулированы впервые. Их решение обеспечило получение новых фундаментальных знаний по различным аспектам биотехнологии рекомбинантных Са регулируемых фотопротеинов и являются научной основой для практического применения этих белков в различных молекулярно-биологических исследованиях, а также созданию отечественных высокочувствительных биолюминесцентных диагностикумов для определения биологически важных веществ и инфекционных агентов. Научная новизна.

Впервые проведены комплексные исследования рекомбинантного Са2±регулируемого фотопротеина обелина как высокочувствительного репортера для биолюминесцентного молекулярного микроанализа.

Разработан эффективный способ получения рекомбинантного обелина в гомогенном виде с выходом около 50% от экспрессированного апобелка. Изучены основные физико-химические свойства рекомбинантного обелина (спектральные характеристики, параметры биолюминесцентной* реакции, термоинактивации и условия хранения).".

Выявлены закономерности химического модифицирования рекомбинантного обелина действием различных реагентов, направленного на получение его высокоактивных коньюгатов с биоспецифичными молекулами гаптенами, авидином или стрептавидином, иммуноглобулинами, пригодных для использования в качестве высокочувствительных репортеров (меток) в биолюминесцентном микроанализе. Получен и охарактеризован как высокочувствительный биолюминесцентный репортер химерный белок proZZObe, обладающий биолюминесцентной активностью обелина и аффинностью белка, А из Stapyilococcus aureus к Fe фрагментам иммуноглобулинов класса G.

Экспериментально обоснована перспективность применения полученных коньюгатов для биолюминесцентного иммуноанализа на примере определения ряда биологически-активных веществ — гормонов, онкомаркеров, инфекционных агентов в сыворотках. Показано, что метки на основе рекомбинантного обелина обеспечивают чувствительность микроанализа, равную или близкую чувствительности радиоизотопного анализа, стабильны при хранении в растворе, замороженном или лиофилизированном виде, обладают низким уровнем шума, просты и безопасны. В отличие от иммуноферментного анализа с колориметрической детекцией продукта, анализ на основе обелинового репортера исключает стадии длительного инкубирования с субстратом и остановки ферментативной реакции.

Впервые предложены варианты высокочувствительного двухпараметрического биолюминесцентного микроанализа: одновременногона основе мутантных вариантов обелина с измененными спектрами биолюминесценции и последовательного — на основе обелина в тандеме с целентеразин-зависимой люциферазой Metridia longa.

Показано, что коньюгаты обелин-авидин (или стрептавидин) являются высокочувствительными и быстрыми репортерами для определения биотинилированных олигонуклеотидов. в гибридизационном анализе продуктов ПЦР. Использование биолюминесцентого репортера позволяет определять 10~ПМ (10~15 моль) матрицы, что напорядок выше чувствительности аналогичного кориметрического репортера на базе щелочной фосфатазы.

Практическая значимость.

На основе разработанной технологии получения рекомбинантого обелина высокой очистки налажено его мелкооптовое производство. Получение белка занимает в среднем 22−24 часа и может осуществляться специалистом технической квалификации. Этим способом получены ряд различных генетических вариантов обелина, а также рекомбинантные акворин.

24″ и его варианты, клитин и Сарегулируемый целентеразин-связывающий белок КепШа тиеПеп.

Полученные коньюгаты обелина с биоспецифическими молекулами являются основными компонентами для создания отечественных высокочувствительных биолюминесцентных иммунодиагностикумов и наборов для ДНК-гибридизационного анализа, направленных на выявление социально-важных заболеваний и инфекций.

Предложенные варианты двухпараметрического биолюминесцентного микроанализа позволяют создавать двухпараметрические диагностикумы, а в перспективе — многопараметрические диагностикумы, использование которых существенным образом удешевит и интенсифицирует анализ, а также позволит исключить ошибки разнесенного во времени раздельного определения двух или нескольких антигенов в одном образце сыворотки.

В перспективе разработка биолюминесцентных высокочувствительных и простых для рутинного применения молекулярных диагностикумов на основе рекомбинантного обелина может способствовать решению задачи обеспечения отечественного здравоохранения тест-системами нового поколения.

Положения, выносимые на защиту.

1. Разработан эффективный способ получения рекомбинантного Сарегулируемого фотопротеина обелина и его генетических вариантов, позволяющий за 22−24 ч получать высокоочищенный белок силами специалиста технической квалификации.

2. Выявлены закономерности химического модифицирования обелина и предложены способы получения его высокоактивных химических коньюгатов с гаптенами и биоспецифическими белками, пригодных для использования в качестве биолюминесцентных репортеров в молекулярном микроанализе.

3. Экспериментально обоснована перспективность и конкурентноспособность биолюминесцентных репортеров на базе рекомбинантного обелина в иммунои ДНК-гибридизационном микроанализе биологически важных веществ.

4. Предложены варианты высокочувствительного двух-параметрического биолюминесцентного микроанализа: одновременного — на основе мутантных вариантов обелина с измененными спектрами биолюминесценции и последовательного — на основе обелина в тандеме с целентеразин-зависимой люциферазой Metridia longa.

В результате проведенных комплексных исследований разработана биотехнологическая основа для создания отечественных биолюминесцентных диагностикумов социально-важных заболеваний и инфекций. Вклад автора. Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в планировании' и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.

Апробация работы и публикации.

Основные материалы, изложенные в работе были представлены на Международной конференции по медицинской биотехнологии, иммунизации и СПИДу (Ленинград, 1991), Симпозиуме по биолюминесценции (Гаваи, США, 1993), на VIII-XV Симпозиумах по биолюминесценции и хемилюминесценции (Кэмбридж Великобритания, 1994 г.- Вудсхол США, 1996 г.- БолоньяИталия, 19 981 г.- Асиломар США, 2000 г.- Кэмбридж Великобритания, 2002 г.- Йокогама Япония, 2004 г.- Парадиз Пойнт США, 2006, Шанхай Китай 2008 гг.), П-й Международной конференции по клинической хемилюминесценции- (Берлин, 1996), 31-ом Международном. симпозиуме по морской биологии (С.Петербург, 1996), на Международной конференции по инструментальным методам анализа (Патры, Греция, 2007), на Международных конференциях «Фундаментальная наука — медицине» (Новосибирск, 2007, 2008 гг.), на V съезде Российского фотобиологического общества (Пущино, 2008), на семинарах лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН.

По материалам диссертации опубликовано 57 работ, из которых 18 -статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 10 — статьи в сборниках трудов Международных конференций, 1 заявка на патент, 1— препринт и 27 — тезисы докладов на конференциях.

ВЫВОДЫ.

1. Разработана эффективный способ получения рекомбинантного Са2+ -регулируемого апофотопротеина обелина из штамма-суперпродуцента Е. соИ ВЬ2^оМ (рЕТ19-ОЬ8). Разработанный подход успешно использован для выделения ряда мутантных вариантов апообелина и других рекомбинантных целентреразин-связывающих Са — активируемых белков, полученных на основе аналогичной экспрессирующей конструкции. Выход высокоочищенных апобелков составляет 30−45 мг на грамм сырой клеточной пасты.

2. Разработаны эффективные условия получения активированного рекомбинантного обелина дикого типа в практически индивидуальном состоянии с выходом 75−80% от исходного апобелка. Выход активированных мутантных вариантов обелина в тех же условиях зависит от произведенных аминокислотных замен.

3. Рекомбинантный обелин дикого типа обладает физико-химическими свойствами, близкими природному обелину: удельная биолюминесцентная активность: б. ЗхЮ15 кв мг" 1- константа спада биолюминесцентного сигнала: к^ = 6.6 с" 1- спектральные характеристики свечения: Хтах=482 нм, плечо при А.=390 нмспектр абсорбции содержит две характерные полосы с Хтах)=280 нм, Е]МГ/МЛ=2.5 и А, тах2=460 нм, Е2мг/мл=0.022. Предел обнаружения рекомбинантного обелина составляет 1 амоль. Белок обладает относительной стабильностью к действию протеаз. Определены условия хранения в растворе, замороженном и лиофилизированном виде без потери биолюминесцентной активности.

4. Разработан, эффективный способ получения коньгатов обелина. с биоспецифичными молекулами4 (гаптенами, иммуноглобулинами, авидином или стрептавидином), позволяющий сохранить 75−80% исходной биолюминесцентной активности белка. Полученные производные стабильны в условиях проведения модельного анализа, при хранении в растворе, а также в замороженном и лиофилизированном виде.

5. На примере твердофазного иммуноанализа ряда биологически важных веществ в сыворотках (гормонов, инфекционных агентов и др.) показано, что полученные коньюгаты обладают чувствительностью равной или близкой радиоизотопной метке, широким линейным диапазоном, низким уровнем шума, безопасны и стабильны в условиях анализа и при хранении. Биолюминесцентная реакция обелиновых меток отличается простотой (надо только добавить раствор Са2+) и высокой скоростью (на измерение стандартного 96-луночного планшета требуется 8 мин).

6. На примере твердофазного иммуноанализа двух гонадотропных гормонов показано, что репортеры на основе мутантных вариантов обелина с измененными характеристиками свечения позволяют одновременно и с высокой чувствительностью определять две мишени в одном образце сыворотки: сигналы от каждой мишени эффективно выделяются с помощью широкополосных оптических фильтров.

7. Разработан вариант иммуноанализа двух антигенов с использованием двух разных репортеров — обелина и люциферазы МегНсНа с последовательным запуском биолюминесценых реакций. Показано, что применение в качестве «субстрата» люциферазы Са2±зависимого целентеразин-связывающего белка КепШа позволяет инициировать биолюминесценцию обеих меток ионами Са2+.

8. Коньюгаты обелин-авидин (или стрептавидин) являются высокочувствительными и быстрыми репортерами для определения биотинилированных олигонуклеотидов в гибридизационном анализе продуктов ПЦР. Использование биолюминесцентого репортера исключает стадии длительного инкубирования с субстратом и остановки ферментативной реакции и позволяет определять 10~ПМ (10*15 моль) матрицы, что на порядок выше чувствительности аналогичного кориметрического репортеров на базе щелочной фосфатазы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Настоящая работа посвящена комплексным исследованиям рекомбинантного Сарегулируемого фотопротеина обелина как перспективного белка для использования в качестве биолюминесцентного репортера в аналитических системах in vitro.

Современные методы молекулярной диагностики — иммуноанализ и ДНК-гибридизационный анализ основаны на образовании высокоспецифичных комплексов антиген-антитело или комплексов комплементарных нуклеотидных последовательностей, одна из которых является мишенью. Для выявления этих комплексов используется ряд различных физико-химических методов, основанных на измерении радиоактивного, хемилюминесцентного, колориметрического, флуоресцентного или электрохимического сигнала. В этом ряду все большее внимание привлекают методы, основанные на регистрации светового сигнала, генерируемого светоизлучающими белками — люциферазами. Преимуществом биолюминесцентных систем, по сравнению с хемилюминесцентными, является высокий квантовый выход, позволяющий производить измерения с чувствительностью, близкой или превосходящей чувствительность радиоизотопного анализа. Среди известных на сегодняшний день биолюминесцентных систем особое место занимают кальций-регулируемые фотопротеины кишечнополостных. Эти небольшие (около 20 кДа) односубъединичные белки представляют собой устойчивые комплексы из апобелка и окисленного субстрата — 2-пероксицелентеразина. В аминокислотной последовательности белка находятся 3 кальций-связывающих сайта, присоединение ионов кальция по которым вызывает практически мгновенное декарбоксилирование субстрата с выделением энергии в виде света с квантовым выходом-около 0,25.

Как показывает анализ литературных данных, исследованияпо применению одного из наиболее изученных фотопротеинов — акворина. медузы Aequoria victiria, проводимые учеными ряда стран — США, ВеликобританииГреции, Италии и других — демонстрируют его перспективность как репортерного белка в исследованиях внутриклеточной динамики кальциевых потоков, а также в молекулярной диагностике. Было показано успешное использование этого белка как в иммуноанализе для определения ряда биологически активных и диагностически важных веществ так и в гибридизационном анализе для тестирования инфекционных агентов, генетического полиморфизма и генетически-модифицированных продуктов. Однако несмотря на то, что к настоящему времени рекомбинантный акворин производится несколькими зарубежными фирмами, стоимость его достаточно велика, а коммерческих препаратов представляющих собой биоспецифические коньюгаты, пригодные в качестве репортеров для производства диагностикумов не существует. Это существенным образом ограничивает перспективы практического использования акворина.

В нашей стране сотрудниками лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН проводятся многолетние исследования другого фотопротеина — обелина гидроидного полипа ОЬеИа 1оп2188та. После клонирования в 1992 году кДНК обелина и получения рекомбинатного аналога этого белка была поставлена задача его всестороннего исследования в том числе и для определения перспективности создания диагностических систем на его основе.

Потребность в создании аналитических систем нового поколения — высокочувствительных, недорогих и простых для рутинного применения — в нашей стране связана с тем, что зачастую медицинские лаборатории производят диагностику либос помощью морально устаревающих радиоизотопных методов, либо с помощью дорогостоящих импортных систем. Последнее приводит к зависимости отечественного здравоохранения от внешних поставок исостояния мирового рынка, что, в. конечномсчете, отражается на качестве жизни, населения.

Таким образомсформулированная цель исследований — создание биотехнологической основы для использования рекомбинантного Сарегулируемого фотопротеина обелина в качестве репортера для биолюминесцентного микроанализа in vitro и обоснование перспективности и конкурентноспособности биолюминесцентных диагностикумов на базе этого белка — является весьма актуальной.

Для ее достижения было необходимо решить ряд экспериментальных задач и, прежде всего, разработать эффективный способ получения рекомбинантного белка, чтобы обеспечить его доступность для проведения развернутых исследований и возможного практического применения.

Для экспрессии апобелка сотрудниками лаборатории — Б. А. Илларионовым и C.B. Марковой были сконструированы несколько разных штаммов-продуцентов апобелка. Наиболее удачным ' оказался продуцент, сконструированный C.B. Марковой на базе рЕТ системы (Novagen, США) -штамм Е. coli BL21gold (pET19-OL8), который и был использован в данной работе в качестве бактериального источника рекомбинантного белка. В результате проведенных исследований был создан эффективный способ, позволяющий получить высокоочищенный рекомбинантный обелин за относительно короткий промежуток времени — процедура занимает 22−24 часов суммарного времени и может проводиться специалистами технической квалификации. С одного грамма рекомбинантных бактериальных клеток в среднем получается около 25 мг белка высокой очистки. Этого количества достаточно чтобы провести микроанализ в более чем двух тысячах стандартных 96-луночных планшетах.

Разработанный способ позволил наладить мелкооптовое производство этого белка и успешно используется на протяжении почти 10 лет для ополучения не только обелина дикого типа, но и его мутантных вариантов, а также других фотопротеинов и их мутантных форм, полученных на базе той же экспрессирующей системы.

Следующей задачей было получение коньюгатов рекомбинантного обелина с гаптенами и, другими белками, способными образовывать биоспецифические комплексы с анализируемыми молекулами.

Ассортимент современных химических реагентов, предлагаемый рядом фирм (Pierce, Sigma-Aldrich, Uptima и др.) весьма обширен и позволяет выбрать кросс-линкеры, осуществляющие соединение молекул с использованием доступных реакционно-способных групп на их поверхности — -NH2, -SH, -ОН, -СООН. Задачей экспериментатора состоит в том, чтобы подобрать такие условия коньюгирования, которые позволяют максимально сохранить специфическую активность репортерного фермента. Иногда, как это было показано для люциферазы светляка, это становится неразрешимой проблемой. В результате проведенного в работе поиска были найдены условия получения коньюгатов рекомбинантного обелина с минимальными потерями его биолюминесцентной активности, не превышающими 20−30%. При этом был получен набор коньюгатов обелина с различными гаптенами и белками. Как было показано, разработанный универсальный способ получения коньюгатов в принципе позволяет получать коньюгаты с любыми молекулами, обладающими доступными аминогруппами — от аминокислот до иммуноглобулинов.

Другим подходом для получения бифункциональных молекул, обладающих активностью репортерного белка и специфической аффинностью к молекулам-мишеням является конструирование генетически слитых (химерных) белков. С использованием этого подхода в работе был получен функционально активный химерный белок, имеющий в своем составе иммуноглобулин-связывающий фрагмент белка, А и обелин. Этот белок является универсальным биолюминесцентным репортером для определения антител. В принципе, его можно использовать для скрининга аффинности вновь полученных антител на определенный антиген. Показана принциальная возможность его использования* и для определения антигенов с помощью сэндвич-иммуноанализа, если для первичной сорбции в системе используются Fab-фрагменты иммуноглобулинов.

Полученные результаты показывают, что при экспрессии апообелина в виде единой полипептидной цепи с другими полипептидами он не теряет способность формировать активный фотопротеиновый комплекс. Таким образом, показана принципиальная возможность конструирования разнообразных химерных белков, обладающих активностью обелина и биоспецифичностыо добавленных полипептидов (например, миниантител), которые без дополнительных модификаций представляют собой биолюминесцентные репортерные белки.

Модельные эксперименты показали, что полученные химические коньюгаты и генетические химеры стабильны при хранении в растворе и лиофилизированном виде и пригодны для использования как биолюминесцентных метки в твердофазном анализе. Это позволило перейти к решению третьей задачи — экспериментальному обоснованию пригодности полученных биолюминесцентных меток для иммуноанализа в сыворотках. В качестве антигенов были исследованы: онкомаркер альфафетопротеин, тиреотропин и гормон щитовидной железы — тироксин (общий и свободная форма), лютеинизирующий и фолликулостимулирующий гормоны. При этом в случае тиреотропина и тироксина были исследованы не только стандартные и контрольные сыворотки, но и сыворотки пациентов, предоставленные сотрудниками диагностического отделения эндокринологического центра Красноярской краевой больницы. Было показано, что результаты радиоизотопного анализа и биолюминесцентного анализа тиреотропина (34 клинических образца) и свободного тироксина (10 клинических образцов) близки.

Возможность биолюминесцентного определения инфекционных агентов в сыворотках, а также в водной среде была показана на примерах иммуноанализа вируса гепатита В и бактерии Shigella sonnei, а также антител к туберкулезному токсину.

В ходе работ был разработан оригинальныйспосободновременного иммуноанализа двух антигенов в одном образце. В качестве репортеров были использованы мутантные варианты обелина с измененными спектрами биолюминесценции: «фиолетовый», с максимумом при 390 нм и «зеленый», с максимумом при 492 нм. Спектры этих белков имеют низкое перекрывание и это позволяет эффективно разделять их биолюминесцентные сигналы с помощью широкополосных оптических фильтров. Потребность в методах одновременного определения двух мишеней связана с тем, что для правильной диагностики и установлении эффективности назначенной терапии часто необходим одновременный скрининг содержания двух и более веществ. Это особенно характерно для эндокринных заболеваний, где важно не только установить содержание того или иного гормона, но и баланса между ними. Например, для диагностики нарушений функций генеративных органов всегда в паре определяют содержание лютеинизи’рующего (JIT) и фолликуло-стимулирующего (ФСГ) гормоновпри нарушениях работы щитовидной железы всегда в паре определяют ТЗ (трийодтиронин) и Т4 (тироксин), свободные и связанные формы гормонов и т. д. Причем, «раздельное» определение свободных и связанных форм гормонов может вносить существенные искажения в результаты анализа.

В представляемой работе для одновременного определения были исследованы стандартные сыворотки, содержащие смесь лютенизирующего и фолликулостимулирующего гормонов. Полученные результаты показали, что без дополнительной оптимизации условий, при использовании одних и тех же коммерчески доступных антител, значение чувствительности одновременного биолюминесцентного иммуноанализа не уступает таковой раздельного радиоиммуноанализа. При этом одновременный анализ занимает меньшее время и позволяет избежать ошибок разнесенного во времени определения.

Другим предложенным подходом для определения двух антигенов в одном образце является использование в качестве репортеров двух различных биолюминесцентных белков — обелина и целентеразин-зависимой люциферазы Metridia longa. Обнаруженная возможность применениям в качестве «субстрата» Са2±зависимого целентеразин-связывающего белка Renilla muelleri позволяет производить запуск биолюминесцентной реакции обоих репортеров ионами кальция.

Отметим, что в состав традиционного иммунодиагностикума на основе колориметрического выявлениякак правило входят 6−7 компонентов (Таблица), часть из которых является нестабильными или агрессивными соединениями. Процедура анализа включает 4 операции. Состав ИФА набора с применением обелина должен включать только 4 компонента и проводиться с помощью 2-х операций. Таким образом предлагаемые биолюминесцентные диагностикумы на основе обелина по составу и количеству операций существенно проще для рутинного применения. Обелиновый репортер позволяет существенно сократить время анализа, поскольку исключается стадия длительного инкубирования с субстратом, а регистрация биолюминесценции обелина от каждой лунки длится всего 5 сек, т. е. на измерение 96-луночного планшета требуется 8 мин.

Показать весь текст

Список литературы

  1. , Г. И. Альфафетопротеин: биология, биохимия, молекулярная генетика / Г. И. Абелев // Иммунология.- 1994. № 3 — С. 4−10.
  2. , В. С. Получение, свойства и применение кальций-чувствительного фотопротеина из гидроида Obelia longissima. / B.C. Бондарь, Е. С. Высоцкий, И. А. Гамалей, А. Б. Каулин. // Цитология 1991. -Т. 33.-№ 6.-С. 50−58.
  3. , B.C. Физико-химические свойства фотопротеина из гидроидного полипа Obelia longissima / B.C. Бондарь, К. П. Трофимов, Е. С. Высоцкий // Биохимия. 1992. — Т.57. — С. 1481−1489
  4. , B.C. О роли консервативного Cysl58 при образовании активного фотопротеинового комплекса обелина / B.C. Бондарь, К. В. Пуртов, Н. П. Маликова, Л. А. Франк, Б. А. Илларионов // Биохимия. — 2001.-Т. 66.-С. 1245−1251.
  5. , В.В. Высокочувствительный и быстрый метод выявления ДНК-фрагментов с использованием фотопротеина обелина как репортера / В. В. Борисова, И. А Пышная, Д. В. Пышный, Л. А. Франк.// Биоорган, химия. -2008. Vol. 34. — Р. 792−798.
  6. , В.Н. Принципы твердофазного иммуноферментного анализа. // Твердофазный иммуноферментный анализ. Сборник научных трудов. Л. Изд. Института им. Пастера. 1988. 160с. С. 3−27
  7. , O.A. Повышение эффективности гибридизационного анализа путем ограниченной фрагментации ДНК-пробы / O.A. Виноградова, И. А. Пышная, В. Ф. Зарытова, Е. М. Иванова, Д. В. Пышный // Молекуляр. биология 2007. — Т. 41. — № 1. — С. 163−172.
  8. , Е.С. Выделение и очистка Са-зависимого фотопротеина обелина из гидроидного полипа Obelia longissima I Е.С. Высоцкий, B.C. Бондарь, В. Н. Летунов // Биохимия. 1989.-Т.54. — С. 965−973.
  9. , Е.С. Выделение и свойства различных молекулярных форм Ca2 *-активируемого фотопротеина обелина. / Е. С. Высоцкий, B.C. Бондарь, И. И. Гительзон // Докл. АН СССР. 1991. — Т. 321. — С. 214−217.
  10. Ю.Высоцкий, Е.С. Кальций-регулируемые фотопротеины морских кишечнополостных. / Е. С. Высоцкий, C.B. Маркова, J1.A. Франк // Молекуляр. Биология. 2006. — Т.40. — № 3. — С. 404−417.
  11. П.Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак М.: Мир. 2002. — 589 с.
  12. , С.Х. Иммобилизованные олигонуклеотиды как аффинные сорбенты для эндонуклеаз рестрикции. / С.Х.' Дегтярев, П. А. Белавин, И. Г. Шишкина, В. Ф. Зарытова, Л. П. Гаврюченкова, С. Н. Морозов // Биоорган, химия 1989.-Т. 15.-№ 3. — С. 358−362.
  13. , P.A. Методическое руководство по проведению контроля качества наборов реагентов для иммуноферментного анализа. / P.A. Дегранян, Н. Ф. Калита, A.C. Роганов -М.: МЗиМП РФ. 1994.
  14. , Б. А. Клонирование и экспрессия кДНК кальций-активируемого фотопротеина из гидроидного полипа Obelia longissima. / Б. А. Илларионов, C.B. Маркова, B.C. Бондарь, Е. С. Высоцкий, И. И. Гительзон. //Докл. АН. 1992.- Т. 326. -№ 5. -С. 911−913.
  15. H Лавин, «Эндокринология». М.: Практика, 1999. 1128 с.
  16. Щ. Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам. Т. 1. М.: Мир. 1982. 400 с.
  17. Нго, Т. Т. Иммуноферменный анализ / Т. Т. Нго, Г. М. Ленхофф. М.: Мир, 1988.-445 с.
  18. , А.П. Получение комплекса наноалмаз-белок-оксид алюминия. / А. П. Пузырь, B.C. Бондарь, П. И. Белобров, A.A. Букаемский // Докл. РАН.- 20 001 Т. 373.- С. 408−410.
  19. , Д.В. Выявление однобуквенных замен в амплифицированных фрагментах ДНК путем лигирования тандемов коротких олигонуклеотидов в растворе и на твердофазном носителе./ Д.В.
  20. , JI.M. Скобелыдина, Е.Н. Гущина, И. А. Пышная, И. Г. Шишкина, Г. М. Дымшиц, В. Ф. Зарытова, Е. М. Иванова // Молекуляр. биология. -2000. Т.34. — № 6. — С. 984−997.
  21. Ю.М. Сера в белках. М.: Наука. 1977.-302 с.
  22. , JT.A. Са -активируемый фотопротеин обелин и бактериальная люцифераза в иммунологическом микроанализе. / Л. А. Франк, B.C. Бондарь, Н. А. Тюлькова, Е. С. Высоцкий // Препринт № 113Б, Красноярск: Изд-во ИФ СО РАН. 1992. — 22с.
  23. , Л.А. Синтез конъюгатов Са -регулируемого фото протеина обелина с иммуноглобулинами и их использование в качестве меток в иммуноанализе / Л. А Франк, А. И. Петунин, Е. С. Высоцкий // Биоорган, химия. 2004, — Т. 30.- № 4. — С. 364−368.
  24. Л.А. Рекомбинантный фотопротеин обелин гидроидного полипа Obelia longissima: выделение и использование в иммуноферментном анализе. // Дисс. канд. биол. наук. Красноярск. — 1997а). — 97 с.
  25. , Л.А. Са -активируемый фотопротеин обелин как метка в иммуноферментном анализе / Л. А. Франк, Е. С. Высоцкий, А. И. Петунин, А. В. Навдаев. // Иммунология.-1997. -№ 1. С. 55−57.
  26. Actor, J.K. A flexible bioluminescent-quantitative polymerase chain reaction assay for analysis of competitive PCR amplicons. / J.K. Actor, J.R. Limor, R.L. Hunter//J. Clin. Lab. Anal. 1999. — Vol. 13.-P. 40−47.
  27. Actor, J.K. Bioluminescent quantitation and detection of gene expression during infectious disease. / J.K. Actor // Comb. Chem. High Throug. Screen. -2000.-Vol. 3.- P. 277−288.
  28. Ahmed, F.E. Detection of genetically modified organisms in food. / F. E Ahmed // Trends in Biotechnol. 2002 — Vol. 20. No.5. -. P. 215−223
  29. Adamczyk, M. Dual analyte detection using tandem flash luminescence / M. Adamczyk, J.A. Moore, K. Shreder // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002. — Vol. 12.-P. 395−398.
  30. Alard, P. A versatile ELISA-PCR assay for mRNA quantitation from a few cells. / P. Alard, O. Lantz, M. Sebagh, C.F. Calvo, D. Weill, G. Chavanel, A. Senik, B. Charpentier // Biotechniques.— 1993 -Vol. 15. -No.4.-P. 730−737.
  31. Allen D. G Aequorin luminescence: relation of light emission to calcium concentration—a calcium-independent component. / D.G. Allen, J.R. Blinks, F.G. Prendergast // Science 1977. — Vol. 195 (4282). — P. 996−998.
  32. Altmann, F. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins / F. Altmann, E. Staudacher, I. B. Wilson, L. Marz. // Glycoconj. J.- 1999.-Vol. 16.-P. 109−123.
  33. Belogurova, N.V. Spectral components of bioluminescence of aequorin and obelin / N.V. Belogurova, N.S. Kudryasheva, R.R. Alieva, A.G. Sizykh // J. Photochem. Photobiol. B. 2008. — Vol. 92. — P. 117−122:
  34. Bieniarz, C. Extended length heterobifunctional coupling agents for protein conjugations / C. Bieniarz, V. Husain, G. Barnes, C.A. King, C.J. Welch. // Bioconjugate Chem. -1996 Vo. 6 — P. 88−95.
  35. Blinks, J.R. Measurement of Ca++ concentrations in living cells / J.R. Blinks, W.G. Wier, P. Hess, F.G. Prendergast // Prog. Biophys. Mol. Biol. 1982. -Vol. 40.-P. 1−114.
  36. Blinks, J.R. Intracellular Ca2+ measurements / J.R. Blinks. // The Hart and Cardiovascular System. Eds. Fozzard H.A. et al. Raven Press, New York, -1986.-P. 671−701.
  37. Borisova, V. V. Recombinant Metridia luciferase isoforms: expression, refolding and applicability for in vitro assay. / V. V. Borisova, L. A. Frank, S. V. Markova, L. P. Burakova, E. S. Vysotski // Photochem. Photobiol. Sci.2008.-Vol. 7.-P. 1025−1031
  38. Campbell, A.K. Extraction, partial purification and properties of obelin, the calcium-activated luminescent protein from hydroid Obelia geniculata. / A.K. Campbell. 11 Biochem. J. 1974. -Vol. 143. — P. 411−418
  39. Casadei, J. Characterization of a chimeric aequorin molecule expressed in myeloma cells. / J. Casadei, M.J. Powell, J.H. Kenten // J. Biolumin. Chemilumin. 1989. — Vol. 4. — P. 346−350.
  40. Casadei, J. Expression and secretion of aequorin as a chimeric antibody by means of a mammalian expression vector. / J. Casadei, M. J. Powell, J. H. Kenten. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. — Vol. 87. — P. 2047−2051
  41. Gingeras, T.R. Fifty years of molecular (DNA/RNA) diagnostics. / T.G. Gingeras, R. Higuchi, L.J. Kricka, Y.M.D. Lo, C.T. Wittner. // Clin. Chem. 2005.-Vol. 51.-P. 661−671.
  42. Cormier, M.J. The enzymology and molecular biology of the Ca" -activated photoprotein, aequorin. / M.J. Cormier, D.C. Prasher, M. Longiaru, R.O. McCann. // Photochem.Photobiol. -1989. Vol. 49. — P. 509−512.
  43. Christopoulos, T.K. Expression immunoassay. Antigen quantitation using antibodies labeled with enzyme-coding DNA fragments. / T.K. Christopoulos, N.H.L. Chiu // Anal. Chem. 1995. — Vol 67.- P. 4290−4294.rj T
  44. Deng, L. Structural basis for the emission of violet bioluminescence from a W92 °F obelin mutant / L. Deng, E.S. Vysotski, Z.-J. Liu, S.V. Markova, N.P. Malikova, J. Lee, B.-C. Wang // FEBS Lett. 2001. — Vol. 506. -P. 281−285.
  45. Deo, S.K. Bioluminescence detection of proteolytic bond cleavage by using recombinant aequorin. / S.K. Deo, J.C. Lewis, S. Daunert // Anal. Biochem -2000.- Vol. 281.-P. 87−94.
  46. Deo, S.K. C-terminal and N-terminal fusions of aequorin with small peptides in immunoassay development. / S.K. Deo, J.C. Lewis, S. Daunert // Bioconjugate Chem. -2001.- Vol. 12. P. 378−384.
  47. Deo, S.K. An immunoassay for Leu-enkephalin based on a C-terminal aequorin-peptide / S.K. Deo, S. Daunert. // Anal. Chem. 2001a).- Vol. 73. -P. 1903−1908.
  48. Doleman, L. Bioluminescence DNA hybridization assay for Plasmodium falciparum based on the photoprotein aequorin / L. Doleman, L. Davies, E.A. Moschou, L. Rowe, S. Deo, S. Daunert // Anal. Chem. 2007. — Vol. 79. — P. 4149−4153.
  49. Drake, D. R. Patterns of expression of viral and cytokine gene transcripts during mouse polyoma virus infection. / D. R. Drake, L. Knoepp, J. K. Actor,
  50. A. E. Lukacher. // Comb. Chem. High Throug. Screen. 2000. — Vol. 3. — P. 329−341.
  51. Elenis, D.S. Quadruple-analyte chemiluminetric hybridization assay. Application to double quantitative competitive polymerase chain reaction. / D.S. Elenis, P.C. Ioannou, T.K. Christopoulos. // Anal. Chem. 2007 — Vol. 79. — No. 24. — P. 9433−9440.
  52. Elenis, D.S. Advances in molecular techniques for detection of genetically modified organisms. / D.S. Elenis, D.P. Kalogianni, K. Glynou, P.C. Ioannou, T.K. Christopoulos. // Anal. Bioanal. Chem. -2008. Vol. 392. — P. 347−354.
  53. Erikaku, T. Bioluminescent immunoassay using a monomeric Fabphotoprotein aequorin conjugate / T. Erikaku, S. Zenno, S. Inouye // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. — Vol. 174.-No. 3.-P.1331−1336.
  54. Fagan, T.F. Cloning, expression and sequence analysis of cDNA for the Ca2±binding photoprotein, mitrocomin / T.F. Fagan, Y. Ohmiya, J.R. Blinks, S. Inouye, F.I. Tsuji. //FEBS Lett. 1993. — Vol. 333. — P. 301−305.
  55. Ford, C. F. Fusion tails for the recovery and purification of recombinant proteins. / C. F. Ford, I. Suominen, C.E. Glatz // Protein Expr. Purif. — 1991. — Vol. 2.-P. 95−107.
  56. Feltus, A. Interaction of immobilized avidin with an aequorin-biotin conjugate: an aequorin-linked assay for biotin / A. Feltus, S. Ramanathan, S. Daunert // Anal. Biochem. 1997. — Vol. 254. — P. 62−68
  57. Feltus, A. Detection of biotin in individual sea urchin oocytes using a bioluminescence binding assay / A. Feltus, A.L. Grosvenor, R.C. Conover, K.W. Anderson, S. Daunert//Anal. Chem. -2001. Vol. 73. -P. 1403−1407
  58. Frank, L.A. Use of proZZ-obelin fusion protein in bioluminescent immunoassay. / L.A. Frank, V.A. Illarionova, E.S. Vysotski // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996.- Vol. 219. — P. 475−479.
  59. Frank, L.A. Bioluminescent immunoassay of thyrotropin and thyroxine using obelin as a label / L.A. Frank, A.I. Petunin, E.S. Vysotski. // Anal. Biochem. -2004. Vol. 305. — P. 240−246.
  60. Frank, L. Bioluminescent signal system: bioluminescence immunoassay of pathogenic organisms. / L. Frank, S. Markova, N. Remmel, E. Vysotski, I. Gitelson // Luminescence. 2007. — Vol. 22. — P. 215−220.
  61. Friedhoff, P. Quantitative polymerase chain reaction with oligodeoxynucleotide ligation assay/enzyme-linked immunosorbent assay detection. / P. Friedhoff, M. Hahn, H. Wolfes, A. Pingoud // Anal. Biochem. -1993.-Vol. 15.-P. 9−16.
  62. Galvan, B. Bioluminescence hybridization assays using recombinant aequorin. Application to the detection of prostate-specific antigen mRNA. / B. Gal van, T.K. Christopoulus // Anal. Chem. 1996. — Vol. 68. — P. 3545−3550.
  63. Glynou, K. Affinity capture-facilitated preparation of aequorin-oligonucleotede conjugates for rapid hybridization assays. / K. Glynou, P.C. Ioannou, T.K. Christopoulus. // Bioconjugate Chem. 2003.- Vol. 14. — P. 1024−1029.
  64. Glynou, K. One-step purification and refolding of recombinant photoprotein aequorin by immobilized metal-ion affinity chromatography. / K. Glynou, P. C. Ioannou, T. K. Christopoulos // Protein Expr. Purif. 2003a). — Vol .27. — P 384−390.
  65. Gorokhovatsky, A. Y. Cell-free bioluminescent screening of translation inhibitors. / A. Y. Gorokhovatsky, L.A. Shaloiko, V.S. Bondar, E.S. Vysotski, E.E. Maximov, H. von Doehren, Y.B. Alakhov // Biotechnol. Appl. Biochem. 1998. — Vol. 27. — P. 259−263.
  66. Green, N.M. Spectrophotometric determination of avidin and biotin / N.M. Green // Meth. Enzym. 1970. — Vol. 18 — P. 418−424.
  67. Guenthner, P.C. Quantitative, competitive PCR assay for HIV-1 using a microplate-based detection system. / P.C. Guenthner, C.E. Hart // Biotechniques. 1998. — Vol. 24. — P. 810−816.
  68. Hastings, J.W. Total quantum flux of isotopic sources / J.W. Hastings, G. Weber //J. Opt. Soc. Am. 1963.-Vol. 53.-P.1410−1415.
  69. Hastings, J.W. Calcium-triggered light emission in Renilla. A unitary biochemical scheme for coelenterate bioluminescence / J.W. Hastings, J.G.
  70. Morin // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1969. Vol. 37. No. 3. — P. 493 438.
  71. Hastings, J.W. Bioluminescence / J.W. Hastings // In «Cell Physiology». 3rd edition. Ed.: N. Sperelakis. Academic Press. NY. 2001. — P. 1115−1130.
  72. Head, J.F. The crystal structure of the photoprotein aequorin at 2.3 angstrom resolution. / J.F. Head, S. Inouye, K. Teranishi, O. Shimomura. // Nature. -2000. Vol. 405. — P. 372−376.
  73. Hirano, T. Revision of the structure of the light-emitter in aequorin bioluminescence / T. Hirano, I. Mizoguchi, M. Yamaguchi, F.-Q. Chen, M. Ohashi, Y. Ohmia, F.I. Tsuji // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1994.- P. 165−167.
  74. Hockney, R.C. Recent developments in heterologous protein production in Escherichia coli / R.C. Hockney // Trends Biotechnol. 1994 — Vol. 12. — No. 11.-P. 456−463
  75. Ho, J. A. Application of liposomal bioluminescent label in the development of a flow injection immunoanalytical system. / J.A. Ho, M.-R. Huang // Anal. Chem. 2005. — Vol. 77. — P. 3431 -3436.
  76. Hori, K. Structure and chemical synthesis of a biologically active form of Renilla (Sea Pansy) luciferin. / K. Hori, M.J. Cormier. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1973.-Vol. 70.-P. 120−123.
  77. Hori, K. Renilla luciferin as the substrate for calcium induced photoprotein bioluminescence. Assignment of luciferin tautomers in aequorin and mnemiopsin / K. Hori, J.M. Anderson, W.W. Ward, M.J. Cormier // Biochemistry 1975. — Vol. 14. — P.2371−2376.
  78. Hori, K. Sructure of native Renilla reniformis luciferin. / K. Hori, H. Charbonneau, R.C. Hart, M.J. Cormier//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. -Vol. 74. — P. 4285−4287.
  79. Inouye S. Overexpression and purification of the recombinant Ca -binding photoprotein, aequorin / S. Inouye, S. Aoyama, T. Miyata, F.I. Tsuji, Y. Sakaki. // J. Biochem. 1989. — Vol. 105 .- P .473−477
  80. Inouye, S. High-level expression and purification of apoaequorin./ S. Inouye,
  81. S. Zenno, Y. Sakaki, F.I. Tsuji. // Protein Expr.Purif.-1991.-Vol.2.-P.122−126.i
  82. Inouye, S. Cloning and sequence analysis of cDNA for the Ca -activated photoprotein, clytin / S. Inouye, F.I. Tsuji. // FEBS Lett. -1993. Vol. 315. -P. 343−346.
  83. Inouye, S. Soluble protein expression in E. coli cells using IgG-binding domain of protein A as a solubilizing partner in the cold induced system / S. Inouye, Y. Sahara. // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2008. — Vol. 376 — P. 448−453.
  84. Inouye, S. Cloning, expression, purification and characterization of an isotype of clytin, a calcium-binding photoprotein from the luminous hydromedusa Clytia gregarium. / S. Inouye // J. Biochem. 2008a).- Vol. 143.- No. 5 — P. 711−717.
  85. Inouye, S. Recombinant aequorin with a reactive cysteine residue for conjugation with maleimide-activated antibody. / S. Inouye, J. Sato // Anal. Biochem. 20 086). — Vol. 378.- No. 1. — P. 105−107.
  86. Jackson, R.J. Lumonometry: a novel bioluminescent immunoassay enhances the quantitation of mucosal and systematic antibody responses / R.J. Jackson, K. Fujihashi, H. Kiyono, J.R. McGhee // J. Immunol. Meth. 1996. — Vol. 190.-P. 189−197.
  87. Jaenicke, R. Folding proteins. / R. Jaenicke, R. Rudolph // In: Protein structure: a practical approach. Ed.: T.E. Creighton. IRL Press. Oxford. — 1995. -P. 191−223.
  88. Jones, K. Glowing jellyfish, luminescence and a molecule called coelenterazine. / K. Jones, F. Hibbert, M. Keenan // Trends Biotechnol. -1999. -Vol. 17.-P. 477−481.
  89. Jue, R. Addition of sulfhydryl groups to Esherichia coli ribosomes by protein modification with 2-iminothiolane (methyl 4-mercaptobutyrimidate). / R. Jue, J.M. Lambert, L.R. Pierce, R.R. Traut. // Biochemistry. 1978. — Vol. 17. — P. 5399−5406.
  90. Kakoi, H. Synthesis of 2-amino-3-benzyl-5-(p-hydroxyphenyl) pyrazine. / H. Kakoi // Chem. Pharm. Bull. 2002. -Vol. 50. — P. 301−302.
  91. Keenan, M. Highly efficient and flexible total synthesis of coelenterazine / M. Keenan, K. Jones, F. Hibbert// Chem. Commun. -1997. P. 323−324.
  92. Keenan, M. Highly efficient and flexible total synthesis of coelenterazine / M. Keenan, K. Jones, Hibbert F. // J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1997. — P. 323−324.
  93. Khanna, M. Multiplex PCR/LDR for detection of K-ras mutations in primary colon tumors. / M. Khanna, P. Park, M. Zirvi, W. Cao, A. Picon, J. Day, P. Paty, F. Barany. // Oncogene. 1999. — Vol. 18. — P. 27 — 38.
  94. Kishi, Y. Cypridina bioluminescence III. Total synthesis of Cypridina luciferin. / Y. Kishi, T. Goto, S. Inoue, S. Sagiura, H. Kishimoto. // Tetrahedron Lett. -1966. Vol. 29. — P. 3445−3450.
  95. Konstantinou, J. Genotyping of single nucleotide polymorphisms by primer extension reaction and dual-analyte bio/chemiluminometric assay / J. Konstantinou, P.C. Ioannou, T.K. Christopoulos // Anal. Bioanal. Chem. -2007. Vol. 388. — P. 1747−1754.
  96. Kopp, P. Perspective: genetic defects in the etiology of congenital hypothyroidism / P. Kopp // Endocrinology. 2002. — Vol. 143. — P. 20 192 024.
  97. Kricka, L.J. Clinical and biochemical applications of luciferases and luciferins. / L.J. Kricka. // Anal. Biochem. 1988. — Vol. 175. — P. 14−21.
  98. Krotkiewski, M. Thyroid hormones in the pathogenesis and treatment of obesity / M. Krotkiewski // Eur. J. Pharmacol. 2002. — Vol. 440. — P. 85−98.
  99. Kurose, K. Bioluminescence of the Ca2±binding photoprotein aequorin after cysteine modification / K. Kurose, S. Inouye, Y. Sakaki, F. Tsuji // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1989.-Vol. 86.-No. l.-P. 80−84.
  100. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4 / U.K. Laemli // Nature. 1970. — Vol. 227. — P. 680−685
  101. Laios, E. Enzyme-amplified aequorin-based bioluminometric hybridization assays / E. Laios, P.C. Ioannou, T.K. Christopoulus // Anal. Chem 2001. — Vol. 73.-P. 689−692.
  102. Laios, E. Novel hybridization assay configurations based on in vitro expression of DNA reporter molecules. / E. Laios, P.C. Ioannou, T.K. Christopoulus // Clin. Biochem. 1998. -Vol. 31. — P. 151−158.
  103. Langone, J.J. Protein A of Staphylococcus aureus and related immunoglobulin receptors produced by streptococci and pneumonococci. / J.J. Langone // Adv. Immunol. 1982. — Vol. 32. -P. 157−252.
  104. Law, G.H.E. Mutagenesis of solvent-exposed amino acids in Photinus pyralis luciferase improves thermostability and pH-tolerance / G.H.E. Law, O.A. Gandelman, L. C Tisi, C.R. Lowe, J.A.H. Murray // Biochem.J. 2006. — Vol. 397.-P. 305−312.
  105. Lewis, J.C. Bioluminescence and secondary structure properties of aequorin mutants produced for site-specific conjugation and immobilization (part I) / J.C. Lewis, J.J. Lopez-Moya, S. Daunert // Bioconjugate Chem. — 2000a). -Vol. 11.-P. 65−70.
  106. Lewis, J.C. Photoproteins as luminescenct labels in binding assay./ J.C. Lewis, S. Daunert // Fresenius J. Anal. Chem. 2000. — Vol. 366.- P. 760−768.
  107. Liu, Z.J. Structure of the Ca2±regulated photoprotein obelin at 1.7 A resolution determined directly from its sulfur substructure. / Z.J. Liu, E.S. Vysotski, C.J. Chen, J.P. Rose, J. Lee, B.C. Wang // Protein Sci. 2000. — Vol. 9.-P. 2085−2093.
  108. Loening, A.M. Consensus guided mutagenesis of Renilla luciferase yields enhanced stability and light output / A.M. Loening, T.D. Fenn, A.M. Wul, S.S. Gambhir // Protein Eng. Des. Sei. 2006. — Vol. 19. — P. 391−400
  109. Lomzov, A.A. Influence of Na2+ and Mg2+ ions on terminal stability of oligonucleotide duplexes / A.A. Lomzov, D.V. Pyshnyi // J. Biomol. Struct. Dyn. 2007. — Vol. 24. — No. 6. — P. 679−680.
  110. Malikova, N.P. Structural tuning of obelin bioluminescence by mutations of Trp92 / N.P. Malikova, G.A. Stepanyuk, L.A. Frank, S.V. Markova, E.S.Vysotski, J. Lee. // FEBS Letters. 2003. — Vol. 554. — P. 184−188.
  111. Manukhov, V. Folding and refolding of thermolabile and thermostable bacterial luciferases: the role of DnaKJ heat-shock proteins / V. Manukhov, G.E. Eroshnikov, M.Yu. Vyssokikh, G.B. Zavilgelsky // FEBS Letters. 1999. -Vol. 448.-P. 265−268.
  112. Markova, S.V. Cloning and expression of cDNA for a luciferase from the marine copepod Metridia longa / S.V. Markova, S. Golz, L.A. Frank, B. Kalthof, E.S. Vysotski. // J. Biol. Chem. 2004. — Vol. 279. — P. 3212−3217.
  113. Martin, C.S. Quantitation of PCR products with chemiluminescence./ C.S. Martin, L. Butler, I. Bronstein // Biotechniques 1995. — Vol. 18. — No.5. — P. 908−913.
  114. Matveev, S.V. Obelin mRNA — a new tool for studies of translation in cellfree systems. / S.V. Matveev, B.A. Illarionov, E.S. Vysotski, V.S. Bondar, S.V. Varkova, Y.B. Alakhov. // Anal. Biochem. 1995. — Vol. 231. — P. 34−39.
  115. Mavropoulou, A.K. High-throughput double quantitative competitive polymerase chain reaction for determination of genetically modified organisms. / A.K. Mavropoulou, T. Koraki, P.C. Ioannou, T.K. Christopoulos //Anal. Chem.-2005.-Vol. 77.-P. 4785−4791.
  116. Morin, J.G. Biochemistry of the colonial hydroids and other coelenterates. / J.G. Morin, J.W. Hastings // J. Cell. Physiol. 1971. Vol. 77.- No. 3. — P. 305 311.
  117. Morin, J.G. Coelenterate bioluminescence. / J.G. Morin, // In: Coelenterate Biology: Reviews and New Perspectives. Eds: L. Muscatine, H.M. Lenhoff. Acad. Press. NY. 1974. — P. 397−438.
  118. Morrison, C. The impact of the PCR plateau phase on quantitative PCR. / C. Morrison, F. Gannon // Biochim. Biophys. Acta. 1994. — Vol. 1219. — P. 493 498.
  119. Musicki, B. Structure of the functional part of photoprotein aequorin. / B. Musicki, Y. Kishi, O. Shimomura. // J. Chem.Soc. Chem. Commun. 1986. -P. 1566−1568.
  120. Nilsson B, Forsberg G, Hartmanis M. Expression and purification of recombinant insulin-like growth factors from Escherichia coli. // Methods Enzymol.-1991.-Vol. 198.-P. 3−16.
  121. Nomura, M. A C-terminal proline is required for bioluminescence of the Ca2+ binding photoprotein, aequorin./ M. Nomura, S. Inouye, Y. Ohmiya, F.I. Tsu i.// FEBS Lett. 1991. — Vol. 295. — P. 63−66
  122. Ohmiya, Y. Two excited states in aequorin bioluminescence induced by tryptophan modification / Y. Ohmiya, M. Ohashi, Tsuji F.I. // FEBS Lett. -Vol. 301.-P. 197−201.
  123. Piatak, M. Jr. Quantitative competitive polymerase chain reaction for accurate quantitation of HIV DNA and RNA species. / M.Jr. Piatak, K.C. Luk, B. Williams, J.D. Lifson//Biotechniques. 1993. — Vol. 14.-P. 70−81.
  124. Prasher, D.C. Sequence comparison of complementary DNAs encoding aequorin izotypes / D. C Prasher, R.O. McCann, M. Longiaru, M.J. Cormier. // Biochemistry. 1987.-Vol. 26.-No. 5.-P. 1326−1332.
  125. Prendergast, F.G. Bioluminescence illuminated / F. G Prendergast F.G. // Nature. 2000.- Vol. 405. — P. 291−293.
  126. Reading, N.S. Engineering a disulfide bond in recombinant manganese peroxidase results in increased thermostability / N.S. Reading, S.D. Aust // Biotechnol. Prog. 2000. — Vol. 16. — P. 326−333.
  127. Rudolf, R. In vitro folding of inclusion body proteins / R. Rudolf, H. Lilie // The FASEB Journal. 1996. — Vol. 10. — P. 49−56.
  128. Sgoutas, D.S. AquaLite bioluminescence assay of thyrotropin in serum evaluated / D.S. Sgoutas, T.E. Tuten, A.A. Verras, A. Love, E.G. Barton. // Clin. Chem.- 1995.-Vol. 41.-No. 11.-P. 1637−1643.
  129. Shimomura, O. Extraction and properties of halistaurin, a bioluminescent protein from the hydromedusan, Halistaura. / Shimomura O., Johnson F.H., Saiga Y. // J. Cell. Comp. Physiol. 1963. — Vol. 62 — P. 9−15.
  130. Shimomura, O. Partial purification and properties of the Chaetopterus luminescence system / O. Shimomura, F.H. Johnson. // In: Bioluminescence in Progress. Eds: F.H. Johnson, Y. Haneda. Princeton University Press. Princeton. NJ. — 1966. — P.495−521/
  131. Shimomura, O. Properties of the bioluminescent protein aequorin. / O. Shimomura, F.H. Johnson // Biochemistry. 1969. — Vol: 8. — P. 3991−3997.
  132. Shimomura, O. Mechanism of the luminescent intramolecular reaction of aequorin / O. Shimomura, F.H. Johnson H. Morise// Biochemistry. — 1974. — Vol. 13.-P. 3278−3286/
  133. Shimomura, O. Regeneration of the photoprotein aequorin. / O. Shimomura, F.H. Johnson//Nature. 1975. — Vol. 256. — P. 236−239.
  134. Shimomura, O. Chemical nature of bioluminescence systems in Coelenterates. / O. Shimomura, F.H. Johnson // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1975a).-Vol. 72.-P. 1546−1549.
  135. Shimomura, O. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin / O. Shimomura, F.H. Johnson // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1978.-Vol. 75.-P. 2611−2615.
  136. Shimomura, O. Recombinant aequorin and recombinant semi-synthetic aeguorins. Cellular Ca~ indicators. / O. Shimomura, S. Inouey, B. Musicki, Y. Kisho//Biochem. J. 1990. — Vol. 270. — No. 1. — P. 309−312.
  137. Shimomura, O. A short story of aequorin / O. Shimomura. // Biol. Bull.1995.-Vol. 189 .-P. 1−5.
  138. Shimomura, O. Cause of spectral variation in the luminescence semisynthetic aequorins / O. Shimomura // Biochem. J. 1995a). — Vol. 306. — P. 537−543.
  139. Shimomura, O. Light-emitters involved in the luminescence of coelenterazine. / O. Shimomura, K. Teranishi. // Luminescence. — 2000. —Vol 15.-P. 51−58.
  140. Siddiqi, A.M. Evaluation of electrochemiluminescence- and bioluminescence-based assays for quantitating specific DNA. / A.M. Siddiqi, V.M. Jennings, M.R. Kidd, J.K. Actor, R.L. Hunter // J. Clin. Lab. Anal.1996.-Vol. 10.-P. 423−431.
  141. Singh, S.M. Solubilization and refolding of bacterial inclusion body proteins / S.M. Singh, A.K. Panda // J. Biosci. Bioeng. 2005 — Vol. 99 — P. 303−310.
  142. Smith, D.F. Recombinant aequorin, a bioluminescent signal for molecular-diagnostics / D.F. Smith, N.L. Stults, M.J. Cormier, J.K. Actor // J. Clin. Ligand Assay 1999.-Vol. 22.-P. 158−172.
  143. Song, X. Quantitation of Chlamidia trachomatis 16S rRNA using NASBA amplification and a bioluminescent mirotiter plate assay I X. Song, B.K. Coombes, J.B. Mahony // Comb. Chem. High Throug. Screen. 2000. — Vol. 3.-P. 303−313.
  144. Taniguchi, A. Competitive RT-PCR ELISA: a rapid, sensitive and nonradioactive method to quantitate cytokine mRNA / A. Taniguchi, H. Konsaka, D.A. Carson//J. Immunol. Meth. 1994. — Vol. 169. — P. 101−109.
  145. Tannous, B.A. Combined flash and"glow-type chemiluminescent reaction for high-througput genotyping of biallelic polymorphism./ B.A. Tannous, M.
  146. Verhaegen, T.K. Christopoulos, A. Kourakli // Anal. Biochem. 2003.- Vol. 320. — P. 266−272.
  147. Tatsumi, H. Construction of biotinylated firefly luciferases using biotin acceptor peptides / H. Tatsumi, S. Fukuda, M. Kikuchi, Y. Koyama. // Anal. Biochem. 1996. — Vol. 243. — P. 176−180.
  148. Teranishi, K. Luminescence of imidazol, 2-a.pyrazin-3(7H)-one compounds. / K. Teranishi. // Bioorganic Chem. -2007. Vol. 35. — P. 82−111.
  149. Tsuji, F.I. Molecular evolution of the Ca~ -binding photoproteins of the Hydrozoa. / F.I. Tsuji, Y. Ohmia, T.F. Fafan, H. Toh, S. Inouye. // Photochem. Photobiol. 1995. — Vol. 62. — No. 4 — P. 657−661.
  150. Tsuzuki, K. Thermostable mutants of the photoprotein aequorin obtained by in vitro evolution / K. Tsuzuki, L. Tricoire, O. Courjean, N. Gibelin, J. Rossier, B. Lamboler. //J. Biol. Chem. 2005. — Vol. 280. — P. 34 324−34 331.
  151. Verhaegen, M. Bacterial expression of in v/vo-biotinylated aequorin for direct application to bioluminometric hybridization assays / M. Verhaegen, T.K. Christopoulos // Anal. Biochem. 2002. — V. 306. — P. 314−322.
  152. Verhaegen, M. Recombinant Gaussia luciferase. Overexpression, purification and analytical application of a bioluminescent reporter for DNA hybridization. / M Verhaegen, T.K. Christopoulos. // Anal Chem. 2002a). Vol. 74. — P. 4378−4385.
  153. Vysotski, E.S. Mn2±activated luminescence of photoprotein obelin. / E.S. Vysotski, C.P. Trofimov, V.S. Bondar, L.A. Frank, S.V. Markova, B.A. Illarionov // Arch. Biochem. Biophys. Vol. 315. — 1995. — P. 92−99.
  154. Vysotski, E.S. Ca~ -regulated photoproteins: Structural insight into the bioluminescence mechanism / E.S. Vysotski, J. Lee // Acc. Chem. Res. 2004. -Vol. 37.-P. 405−415.
  155. Ward, W.W. Extraction and purification of calcium-activated photoproteins from the ctenophores Mnemiopsis sp. and Beroe ovata / W.W. Ward, H.H. Seliger // Biochemistry. 1974.- Vol. 13. No. 7. — P. 1491−1499.
  156. Wiesner, R.J. Quantitative PCR. / R.J. Wiesner, B. Beinbrech, J.C. Riiegg // Nature. 1993. — Vol. 366. — P. 416−423.
  157. White, S.R. Signal amplification system for DNA hybridization assays based on in vitro expression of a DNA label encoding apoaequorin / S.R. White, T.K. Christopoulos // Nucl. Acids Res. 1999. — Vol. 27. — No. 19. P. e25.
  158. White, S.R. Expression immunoassay. / S.R. White, N.H.L. Chui, T.K. Christopoulos // Methods. 2000. — P. 24−32.
  159. Wilchek, M. Avidin-biotin technology ten years on: has it lived up to its expectation? / M: Wilchek, E.A. Bayer // TBS. 1989. -Vol. 14. — No. 10. — P. 408−412.
  160. Zatta, P.F. A new bioluminescent assay for studies of protein G and protein A binding to IgG and IgM. / P.F. Zatta // J. Biochem. Biophys. Meth. 1996. -Vol. 32.-P. 7−13.
  161. Zenno, S. Bioluminescent immunoassay using a fusion protein and the photoprotein aequorin / S. Zenno, S. Inouye // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990. -Vol. 171.-P. 169−174.
  162. Xiao,' L. Quantitation of RT-PCR amplified cytokine mRNA by aequorin-based bioluminescence immunoassay / L. Xiao, C. Yang, C.O. Nelson, B.P. Holloway, V. Udhayakumar, A. A Lai. // Immunol. Methods. 1996. — Vol. 199.-P. 139−147.
Заполнить форму текущей работой

На отлично!