Разработка технологии производства ферментного препарата из молока овец, трансгенных по гену химозина крупного рогатого скота

В настоящее время одним из самых перспективных направлений получения трансгенных сельскохозяйственных животных является интегрирование генов, которые обуславливают продуцирование ряда биологически-активных веществ, необходимых в медицине и технологии переработки продуктов сельского хозяйства.

Большинство лекарственных и других крайне важных для человека биологически активных веществ будучи белковыми соединениями не могут быть получены путем химического синтеза. С развитием молекулярной генетики созданы так называемые рекомбинантные микроорганизмы, которые в специальных биореакторах способны производить такие ценные вещества, как инсулин, человеческий гормон роста и др. Однако этот метод дорог. К тому же биологическая активность веществ, полученных с помощью микроорганизмов понижена йли может быть утрачена вовсе. В связи с этим решение проблемы нашли в создании трансгенных животных, в геном которых вводится чужеродный ген, позволяющий затем получать с молоком любые необходимые для человека биологически активные вещества, главным образом медицинского назначения.

В пользу использования молочной железы как места производства чужеродных протеинов могут быть приведены многие аргументы.

Экспрессия чужеродных протеинов в молоко позволяет получать необходимый продукт общепринятым способом, — путем выдаивания и без нанесения какого-либо вреда животным. Протеиновая синтетическая продуктивность молочной железы огромна. Общая концентрация эндогенных молочных протеинов в зависимости от вида лежит в пределах 4−6%, что реально позволяет получать до 10 грамм рекомбинантного протеина из 1 литра молока. Молоко является гигиенически чистым продуктом, поэтому при очистке чужеродного протеина из молока не должно возникать неразрешимых проблем.

Себестоимость фармакологических средств, получаемых от трансгенных животных, примерно в 50−100 раз ниже, чем при использовании клеточных ферментеров, а стоимость на рынке очень высока: один литр молока трансгенного животного дает человеческий белок С стоимостью 10 тысяч долларов, антитромбин -14 тысяч долларов, а от одной овцы получают с молокам за лактацию альфа1-антитрипсин на сумму 250 тысяч долларов.

Исследования в этой области имеют стратегическое значение для народного хозяйства страны, а полученные результаты даже на современном этапе специалисты расценивают как прорыв в биотехнологии.

Наша страна теряет не только приоритет в этой области, но и будет вынуждена в ближайшие годы покупать лекарственные вещества по баснословным ценам и более того не сможет их производить в дальнейшем, так как эти технологии будут запатентованы за рубежом.

Одним из биологически активных белков, в которых нуждается промышленность, является фермент химозин. Химозин (реннин) является основным компонентом в технологии производства сыра, а также творога и белковой пасты. Традиционно его получают из сычугов молочных телят. Однако получаемые в стране препараты молокосвертывающих ферментов отличаются низким содержанием химозина из-за повышения возраста забиваемых телят. В последние годы в нашей стране резко снизился объем заготовок сычугов телят, практически прекратились поставки сычугов ягнят из стран СНГ.

Второе назначение химозина — получение лекарственного препаратаабомина, используемого в гастроэнтерологии и особенно незаменимого в лечении желудочно-кишечных заболеваний детей. Молокосвертывающие белки на основе пепсина, производимые из сычугов взрослых животных, не содержат химозин и не обеспечивают получение сыров высокого качества. Производство сыров длительных сроков созревания вообще невозможно без применения химозина.

В ряде европейских стран налажено производство рекомбинантного химозина, получаемого из бактерий. Вследствие дефицита фермента в России импортный рекомбинантный химозин стал проникать на российский рынок.

Использование химозина бактериального происхождения повышает себестоимость производимого сыра более чем на 10%, а также сопровождается ухудшением качества продукции, о чем свидетельствуют претензии ряда сыроваренных заводов.

Проблема получения химозина может быть решена путем получения его от трансгенных животных, продуцирующих фермент с молоком. Преимущество этого метода — небольшие затраты на получение молока, высокое качество фермента, простота его выделения по сравнению с рекомбинантным бактериальным химозином. Фермент, продуцируемый с молоком, по структуре полностью аналогичен получаемому традиционно из сычугов телят, что и обеспечивает его высокое качество. При получении молокосвертывающих ферментов из молока трансгенных животных практически не требуется очистка, т.к. молоко не содержит посторонних белков, не участвующих в процессе сыроделия.

Целью представленных исследований было доказательство идентичности фермента химозина, выделенного из молока трансгенных овец и разработка оптимальных условий для промышленного получения ферментных молокосвертывающих препаратов, содержащих трансгенный химозин.

Для достижения этих целей нами были поставлены следующие задачи:

1. Изучить возможность активации прохимозина в молоке трансгенных овец и определить оптимальные значения рН для максимального перехода прохимозина в химозин в молоке трансгенных овец.

2. Изучить влияние сроков инкубации сыворотки молока трансгенных овец на ее молокосвертывающую активность при различных значениях рН и температуре.

3. Изучить возможность экстрагирования фермента химозина из молока трансгенных овец путем насыщения раствора №С1 и определить оптимальную концентрацию №С1 для получения максимального количества продукта.

4. Изучить влияние условий хранения на характеристики пастообразной и порошковой форм молокосвертывающего ферментного препарата из молока трансгенных овец.

5. Разработать метод определения присутствия прохимозина в молоке трансгенных овец в условиях сельскохозяйственного производства и изучить динамику экспрессии гена химозина у трансгенных овец в течение лактации.

6. Выделить химозин из молока трансгенных овец с помощью хроматографических методов и исследовать химозин, выделенный из молока трансгенных овец для доказательства его идентичности химозину теленка.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Переход прохимозина в химозин в молоке трансгенных овец начинается при рН 4,0 с максимумом при рН 2,5−1,0.

2. Выделение химозина из сыворотки молока трансгенных овец в производственных условиях возможно путем насыщения ее ИаС1. Выход фермента увеличивается с 3887 тыс. у.е. до 7903−8240 тыс. у.е. с увеличением концентрации №С1 в сыворотке молока с 10 до 2530%, от 30 до 35% соответственно с 7903 до 15 338 тыс. у.е./г.

3. При хранении в течение 30 суток пастообразной ферментной массы, полученной из молока трансгенных овец, молокосвертывающая активность при температуре хранения -5°С практически не изменяется, а при +5°С и +22°С снижается.

4. Активность порошковой формы препарата химозина, полученного из молока трансгенных овец, в случае хранения при комнатной температуре практически не изменилась в течение 6 месяцев хранения.

5. Выделение химозина из молока трансгенных овец с применением ионнообменной и афинной хроматографии и сравнение его с химозином, выделенным из сычугов телят с помощью диск9 электрофореза доказало идентичность трансгенного химозина А-форме химозина теленка.

6. Аминокислотный состав трансгенного химозина соответствует составу химозина теленка.

7. Протеолитическая активность трансгенного химозина по молоку, казеинату натрия и гемоглобину сопоставимы с активностью химозина теленка по этим субстратам.

1. Обзор литературы.

1. Алексеенко Л. П. Современные методы биохимии. — М. — Медицина. -1967.-с. 120.

2. Антипова JI.B. Разработка биотехнологий получения специальных препаратов ферментов из микроорганизмов и животных тканей для обработки сырья мясной и молочной промышленности. М. — 1994. -С. 78−79.

3. Брем Г., Зиновьева Н., Эрнст Л. «Генные фермы» новый путь производства биологически активных протеинов трансгенными животными. // С.-х. биол. — 1993. — 6: 3−27.

4. Брем Г., Кройслих X., Штранцингер Г. Эксперементальная генетика в животноводстве. Москва. — 1996.

5. Гоголевский П. А., Гольдман И. Л., Башкеев Е. Д. и др. Цитологические вопросы технологии получения трансгенных овец. // Докл. РАСХН. -1993.-5: 23−26.

6. Гольдман И. Л., Башкеев Е. Д., Гоголевский П. А. и др. Прогрессивная биотехнология получения трансгенных овец. // Докл. РАСХН. 1993. -9−10: 25−30.

7. Гольдман И. Л., Захарова Е. С., Кадулин С. Г. и др. Химозин новый биотехнологический продукт. // Биотехнология. — 1996. — 12:3−16.

8. Гольдман И. Л., Эрнст Л. К., Брем Г. и. др. Получение трансгенных овецпродуцентов молока, содержащего физиологически активные белки, в условиях племенной фермы. // С.-х. биотех. 1994. — 6: 46−53.

9. Грачева И. М. Технология ферментных препаратов Агропромиздат. -1987.

10. Дурова Ж. И. Исследование возможности применения ферментов из Aspergillus Candidus шт. 11 и Bacillus Mesentericus-renninus в сыроделии.- Автореф. дис. Вологда-Молочное — 1967.

11. Заяс Ю. Ф., Иноземцева М. А., Способ получения сычужного фермента из сычугов телят и ягнят. ВНИИ МП. — 1981.

12. Зиновьева H.A. Получение и молекулярно-генетический анализ трансгенных кроликов с тканеспецифическими для молочной железы генными конструкциями: Автореф. канд. дис. Дубровицы. — 1994.

13. Зиновьева H.A., Безенфельдер У., Брем Г. // Онтогенез. 1996. — Т.27. -N3.-С. 214−217.

14. Каюкова Н. В. Овечье молоко и продукты его переработки. ТСХА1995. 15 С.

15. Коцарев В. Е., Винников Н. И., Белинский В. Е. Производство и переработка овечьего молока. Приложение к журналу «Овцеводство» — М. — Агропромиздат. — 1988. — 56 с.

16. Михайлусь И. А. Влияние различных сред растворения сычужного фермента, полученного от живых телят и убитых животных, на продолжительность свертывания молока. Автореферат на соискание уч. степени к.б.н. — Львов — 1961. — С. 4−15.

17. Прокофьев М. И., Эрнст Л. К., Гольдман И. Л. и др. Получение трансгенных овец, продуцирующих с молоком прохимозин. // Тез. Международной конф., посвященной памяти акад. А. А. Баева. М.1996. -С.241.

18. Романовское овцеводство. М. — 1987.

19. Сеитов 3. Исследование белков, жира молока и фермента реннина. -Автореферат на соискание уч. степени д.б.н. -Алма-ата — 1971. — С. 2633.

20. Соловьева Т. А., Беляев C.B., Степанов В. М. // Химия природных соединений. 1997. — вып.З. — с. 398−403.

21. Степанов В. М., Руденская Г. Н., Янонис В. В. и др. // Биоорганическая химия. 1987. — Т. 4. — № 9., с. 1256−1263.

22. Строган А. Я., Борухов С. И., Боргуш В. Г. и др. Природные и генноинженерные белки сходство и отличия. // Биотехнология. — 1987. -3(3): 325−331.

23. Сунданская JI.B. // Выделение, очистка и изучение свойств реннина телят: Автореферат. Краснодар. — 1980.

24. Теплы М., Машек Я., Гавлова Я. Молокосвертывающие ферменты животного и микробиологического происхождения. М.: Пищевая промышленость. — 1980.

25. Томилин Н. В. Новые системы генетической трансформации соматических клеток млекопитающих. // Биотехнология. 1987. — 3(3): 343−351.

26. Устинов М. Н. Совершенствование технологии сушки препарата сычужного фермента с целью увеличения его выхода. Москва. — 1980. Автореферат.

27. Устинов М. Н., Щедушнова Т. Н., Шпитонкова Л. И. Производство и использование молокосвертывающих ферментных препаратов в СССР и за рубежом. Обзорная информация. М.: АгроНИИТЗИММП. — 1990. 32с.

28. Фомин Д. П. Молочно-маслодельная промышленность 1939. — Т.9. — С 16.

29. Эрд Т. А., Торп A.A., Кольмер М. Й. // Биотехнология 1987. — Т.З. — N3. -С.307−311.

30. Эрнст Л. К., Гальдман И. Л., Зиновьева Н. и др. // Докл. Акад. Наук. -1995. Т.345. — № 4. — С.5.55 -558.

31. Эрнст Л. К., Гольдман И. Л., Кадулин С. Г. Генная инженерия в животноводстве: трансгенные сельскохозяйственные животные, кормовые растения, микроорганизмы рубца. // Биотехнология. 1993 -№ 5 — С.2−14.

32. Югова Л. В., Дорохов В. В. Микробные заменители сычуясного фермента: производство и применение продуктов микробиологических34.