Линейные прокариотические репликоны с ковалентно замкнутыми теломерами: молекулярная генетика и механизм репликации ДНК бактериофага N15

До недавнего времени общепринятым было представление о том, что эукариотические организмы имеют линейные хромосомы, а бактериальные геномы представляют собой кольцевые молекулы. Однако, в течение последних двадцати лет это правило перестало быть универсальным, поскольку линейные плазмиды и хромосомы были обнаружены в различных прокариотических организмах.

Проблема полной репликации концов линейной ДНК была сформулированна в начале 1970;х годов в работах Ватсона (Watson, 1972) и Оловникова (Olovnikov, 1973). Она связана с неспособностью ДНК-полимераз инициировать полимеризацию de novo, т. е. помимо матрицы полимеразе необходим также предсуществующий 3' - конец, с которого начинается полимеризация. Последующие исследования показали, что концы (теломеры) линейных молекул ДНК действительно реплицируются с помощью специальных механизмов. Существуют различные решения проблемы репликации теломер (см. Рис. 1): во-первых, использование специального механизма увеличения длины теломерных районов (теломераза эукариот, см. обзоры Collins, 1996; Biessmann et al., 1997), во-вторых, инициация синтеза ДНК с помощью белков, ковалентно присоединенных к 5' - концам (Salas, 1991), в-третьих, за счет использования ковалентно замкнутых теломер (Cavallier-Smith, 1974; Bateman, 1975). Репликоны со шпилечными теломерами были обнаружены у различных эукариотических организмов и вирусов, такую структуру ДНК имеют, в частности, поксвирусы (Geshelin and Berns, 1974), иридопоксвирусы, некоторые митоходриальные ДНК, вирусы Chlorella (Hinnebusch and Tilly, 1993).

Известны два структурно различных типа линейных бактериальных репликонов: имеющие ковалентно замкнутые «шпилечные» теломеры и содержащие белки, ковалентно присоединенные к 5' концам ДНК. Примерами репликонов второго типа являются линейные хромосомы и плазмиды бактерий рода Streptomyces (Qin and Cohen, 1998; Huang et al., 1998). Первым обнаруженным линейным репликоном со шпилечными теломерами у прокариот является умеренный бактериофаг N15, который в лизогенном состоянии не интегрируется в хромосому Е. coli (V.Ravin and Shulga, 1970), а представляет собой линейную плазмиду с ковалентно замкнутыми теломерами. (Сварчевский и Рыбчин, 1984). Позднее было установлено, что аналогичную структуру ДНК имеют линейные хромосомы и плазмиды спирохет рода Borrelia (Barbour and Garon, 1987; Fraser et al., 1997), одна из хромосом Agrobacterium tumefaciens (Allardet.

Servent et al., 1993; Goodner et al., 1990), а также профаги умеренных бактериофагов PY54 (Hertwig et al., 2003) и фК02 (Casjens et al., 2004).

В то же время, молекулярные механизмы репликации и стабильного наследования линейных прокариотических репликонов весьма ограничены. Основное внимание в настоящей работе посвящено изучению этих проблем на примере умеренного бактериофага N15. Тот факт, что хозяином фага N15 является Е. coli классический объект, для работы с которым создано большинство известных методов молекулярной генетики и генетической инженерии прокариот, и чья генетика относительно хорошо изучена, позволяет использовать фаг N15, как удобную экспериментальную модель для изучения всех прокариотических «шпилечных» репликонов.

Увеличение длимы юломер

Л/" еяомер""" инициация сите"" е помощь га белков мовалеитио ««мкну!ые теломеры репликация О обрсюваниа |еяомер

Рисунок 1. Механизмы репликации линейных молекул.

Для случая ковалентно замкнутых теломер приведена одна из возможных моделей репликации.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

.

Основная цель работы состояла в изучении особенностей молекулярной генетики, в том числе механизма репликации ДНК N15, анализе того, как обычные механизмы репликации и стабильного наследования бактериальных репликонов адаптируются к лииейной конформации ДНК, исследованию механизмов эволюции линейных фагов-плазмид и происхождения линейной ДНК у прокариот.

При этом были поставлены следующие основные задачи:

1. Определение полной структуры генома бактериофага N15.

2. Исследование механизмов установления и поддержания лизогенного состояния.

3. Идентификация и анализ механизмов стабильного наследования плазмидного профага.

4. Идентификация и характеристика фермента, обеспечивающего образование ковалентно замкнутых теломер.

5. Идентификация и характеристика генов и сайтов, обеспечивающих репликацию ДНК N15.

6. Создание модели репликации ДНК линейной плазмиды N15.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Основной целью настоящей работы является изучение особенностей молекулярной генетики и механизма репликации ДНК бактериофага N15. Поэтому в «Обзоре литературы» основное внимание будет уделено вопросам репликации ДНК у бактерий, в первую очередь репликации плазмид, механизмам сегрегационной стабильности бактериальных плагмид и хромосом, а также результатам исследований молекулярной генетики бактериофага N15, ранее полученным в работах других авторов.

1. Репликация кольцевых бактериальных плазмид.

Плазмиды являются автономно реплицирующимися экстрахромосомиыми элементами. Они были обнаружены в организмах, представляющих все три класса живых существ: Archaea, Bacteria, и Eukarya (Woese et al., 1990). Плазмиды могут содержать существенную долю общей генетической информации организма, которая достигает 25% у некоторых преставителей Archaea (Holmes et al., 1995; Zillig, et al., 1994). Плазмиды могут включать и переносить гены за счет рекомбинации или транспозиции, таким образом способствую генетическому обмену в бактериальных популяциях.

Характерной чертой плазмид является то, что их репликация является автономной и контролируемой. Известны три принципиальных механизма репликации кольцевых плазмид, а именно, тета-механизм, вытеснение цепи и механизм катящегося кольца (RC). История исследований репликации плазмид привела к идеи о том, что тета-репликация чаще встречается в грам-отрицательных бактериях, в то время как RC-репликоны более характерны для грам-положительных бактерий. Впоследствии эта точка зрения не подтвердилась, но, тем не менее, большая часть информации о механизмах тета-репликации получена в результате изучения репликонов грам-отрицательных бактерий, в то время как информация о RC-плазмидах основана на данных, полученных для грам-положительных микробов. Механизм вытеснения цепи характерен для плазмид IncQ семейства.

Как правило, плазмиды содержат так называемый «существенный район», необходимый для их репликации и контроля числа копий, а также гены, которые могут рассматриваться как «несущественные» (ля поддержания плазмиды), — кодирующие функции копъюгативного переноса, устойчивость к антибиотикам и тяжелым металлам, и др. Существенный район плазмид содержит три функциональных элемента: (1) сайт инициации репликации (ori), (2) ген (ы), кодирующие белок (и), участвующие в инициации репликации (обычно называемый Rep), хотя известны и плазмиды, их не имеющие, (3) плазмидные гены, контролирующие репликацию. В случае, если плазмида кодирует Rep белок, то ее ori сайт содержит специфические сайты его связывания.

1.1 Тета-механизм репликации.

Тета-механизм репликации предполагает пероначальное расплетение цепей ДНК, синтез РНК-праймера (pRNA) и инициацию синтеза ДНК путем его расширения (Kornbcrg and Baker, 1992). Синтез ДНК является непрерывным по одной цепи (ведущей) и прерывающимся по отстающей цепи, хотя синтез обеих цепей происходит координировано (см. обзоры Kelman and 0'DonnelI, 1995 и Zavitz and Marians 1991). Репликация может инициироваться с одного или нескольких оп-сайтов и быть одно-или двунаправленной. Интермсдиаты, образующиеся в процессе репликации, имеют вид греческой буквы 0, что и дало название этому механизму репликации. Практически все плазмиды, использующие тета-механизм репликации, кодируют собственные Rep белки. Некоторые репликоны могут зависить от бактериальной ДНК-полимеразы I (DNA Poll), необходимой на ранних стадиях инициации синтеза ведущей цепи.

1.1.1. Сайты инициации репликации.

Большинство плазмид, реплицирующихся по тета-механизму, кодирут собственные Rep белки и, соответственно, содержат сайты его связывания в пределах оп-района. Другими характерными чертами оп-сайтов являются (1) наличие АТ-богатого района, в котором происходит первоначальное расплетение нитей и сборка репликационного комплекса, и (2) один или несколько сайтов связываняи бактериального инициаторного белка DnaA (dnaA-сайты) (Bramhill and Kornberg 1988, Kornberg, and Baker 1992). Множественные сайты Dam метилирования присутствуют в сайте инициации репликации хромосомы Е. coli, oriC, а также многих плазмид, например PI (Brendler et a!., 1991ab) и pSClOl (Bramhill and Kornberg. 1988). Сайты инициации репликации могут также содержать сайты связывания бактериальных структурных регуляторных белков IHF (integration host factor) и/или FIS (factor for.

Плаз мида Структура оп-сайта PPSIOi-^m-^-HL.

Р1.

GtC А*Т гврАРО.

Последовательность сайта связывания Rep-белка.

GGGmAMQ33GACAGATTCA pSCIOI а*Т о+с.

И пFF1PR.

ATGTG (T/C)GCTGGAGGGA (A/D (A/G) с> герАРО.

А*Т гврАРО.

T/C)T (T/C)CCAGATCGTCTTAAATGT.

RK2/RP4. НИ W-*-!-*-!*-!-^ TGACA{G/C)(A/T)TGAGGGG (G/A){G/C).

А+Т G*C enhancer.

R6K C=Z>J-ц I-*•!¦*" ¦ A (A/G)(A/C)CATGAG (G/A)GCTTACGT (T/G).

ORIY) A+T.

R1.

1 2 O-sit*.

-//H.

A+T «.

Py Pu (T/G) TTAAATG feporl.

ColE2-type «pAP^AncAP раз.

TGAGACCAGATAA-GCCT-TATCAGATAACAGCGCC.

C0IE1.

RNAU pO О RNAI P ori pa4 • ¦

Рисунок 2. Сайты инициации репликации некоторых плазмид, реплицирующихся по тета-механизму.

Прямоугольники со стрелками, — сайты связывания Rep белка (итероны), светлые стрелки над картами, — инвертированные повторы, имеющие гомологию с итеронамичерные треугольники, — повторы в АТ-богатых районахсветлые прямоугольники под картой, — промоторычерные прямоугольники, — DnaA сайтысветлые прямоугольники, — IHF сайтычерные кружки, — сайты Damметилированияpas — сайт сборки праймосомы. inversion stimulation). Эти факторы обеспечивают пространственную близость различных компонентов ori-сайта или нескольких оп-сайтов одной плазмиды (напр. R6K). Эти сайты являются существенными компонентами сайта инициации репликации, поскольку они необходимы для правильной сборки репликационного комплекса (Dellis and Filutowicz 1991, Dellis et al., 1992, Stenzel el al., 1991). Сайты связывания структурных белков также присутствуют в oriC сайте Е. co! i (Woelker and Messer 1993). i) Структура oriC сайта и инициация репликации Е. coli.

Размер минимального фрагмента, обеспечивающего автономную репликацию хромосомы, составляет 258 нуклеотидов. Этот район содержит сайты связывания инициаторного белка DnaA (DrmA-сайты). АТ-богатую область, содержащую три последовательности длиной в 13 нуклеотидов, включающие сайт Dam — метилирования GATC (Рис. 3). OriC содержит сайты связывания белков IMF и F1S. Оба белка, по-видимому, помогают инициатору DnaA раскручивать ДНК, oriC.

А).

13 bp repeats (AT богатый район).

DnaAсайты.

В) С «^ЧЗ-твгв первоначальный комплекс Шсверхелнра птовэнмая.

DnaB.

РисунокЧ. Структура oriC сайта (А) И последовательность событий, приводящих к инициации репликации (В).

Сборка инициаторного комплекса начинается с взаимодействия белка DnaA с DnaA-сайтами, что приводит к образованию компактной эллиптической структуры, содержащей ~20 мономеров DnaA, вокруг которой «обернута» ДНК oriC. На следующем этапе происходит частичное расплетение АТ-богатых 13-нуклеотидных повторов, что приводит к образованию «открытого комплекса». При 37 °C и выше DnaA может обеспечивать расплетение ДНК самостоятельно, при более низких температурах требуется участие белков HU или IHF. На следующем этапе в состав открытого комплекса включается ДНК-хеликаза DnaB. Этот белок, взаимодействует с однонитевым расплетенным участком и входит в состав препраймирующего комплекса 1 в виде гексамера, образовавших комплекс с шестью белками DnaC, каждый из которых связывает молекулу АТР. Освобождение DnaC из комплекса происходит в результате гидролиза АТР, следствием чего является активация DnaB. В результате образуется препраймирующий комплекс 2.

На следующем этапе (праймирующий комплекс) DnaB взаимодействует с DnaG-праймазой, которая играет ключевую роль в правильной сборке репликационного комплекса на оп’С. DnaB и DnaG обеспечивают сопряжение функционирования двух рспликативных вилок, движущихся в противоположные стороны. Предполагается, что во время координированной сборки двух репликативных вилок в одной из них синтезируется праймер, который становится затравкой при синтезе ведущей цепи другой рспликативной вилкой, движущейся в противоположном направлении.

При образовании рсплисомы в каждой репликативной вилке происходит АТР-зависимое формирование димерного комплекса холофермента ДНК-полимеразы III, связанного с З'-концами праймеров. Вслед за этим происходит координированная элонгация праймеров, сопровождаемая двунаправленным синтезом ведущих и отстающих цепей ДНК (см. ниже).

И) Плазмидные оп-сайты, содержащие итероны.

Во многих случаях сайты инициации репликации содержат итероны, — прямые повторы последовательности, являющейся сайтом связывания плазмидного Rep белка. Итероны не только необходимы для инициации репликации, но и являются ключевыми элементами контроля частоты инициации (см. обзор del Solar et al., 1998). Итероны присутствуют в ori-сайтах многих плазмид, например: PI (Abeles, et al., 1995), F (Murotsu et al., 1991, Tolun, and Helinski. 1981), pSClOl (Churchward et al., 1983), R6K (Germino, and Bastia 1983ab, Novick, 1987, 1989), Rtsl (Kamio, and Terawaki. 1983), pColIV-КЗО (Pdrcz-Casal, et al., 1989), RK2/RP4 (Pansegrau et al., 1995, Stalker et al., 1981), pCUl (Kozlowski et al., 1987), pSa (Tait et al., 1983), pPSlO (Ferndndez-Tresguerres et al., 1995, Giraldo et al., 1992, Nieto et al., 1992). Отметим, однако, что итероны не являются специфической чертой тета-репликонов, но обнаруживаются также в ori-сайтах плазмид, реплицирующихся по механизму вытеснения цепи или катящегося кольца (Lee et al., 1989, Lin, and Meyerl986, Scholz et al., 1989). Итероны были обнаружены также вне ori-сайтов плазмид PI, F, RK2, R6K, Rtsl, и pCollV-КЗОэти итероны не требуются для инициации репликации, но играют важную роль в регуляции частоты ее инициации.

Итероны могут располагаться один за другим или находится на определенном расстоянии друг от друга. Обычно это расстояние кратно 11 нуклеотидам (т.е. длине поворота двойной спирали ДНК), что обеспечивает расположение Rep белков вдоль одной линии.

Hi) oriсайт плазмиды R1.

Инициация репликации плазмиды R1 зависит от кодируемого ею Rep белка. Минимальный oriсайт (oriR) длиной 188 нт (Masai et al., 1983) включает: DnaA-сайт длиной 9 нт, последовательность длиной около 100 нт, с которой связываются RepA, а также АТ-богатый район. Отметим, что dnaA сайт не является абсолютно необходимым для репликации R1 (Ortega-Jimenez et al., 1992). iii) ori• сайт плазмиды ColEl.

Плазмида ColEl является типичным представителем небольших многокопийных плазмид, реплицирующихся по тета-механизму. В отличие от Rl, ColEl не имеет плазмидного инициатора, но использует бактериальную DNA Poll для инициации репликации. Сайт инициации репликации включает район, обеспечивающий синтез RNA1I, праймера ведущей цепи (Tomizawa et al., 1975, Tomizawa, 1975), последовательности, необходимые для образования комплекса между ДНК и РНК И (Itoh, and Tomizawa 1980, Masukata, and Tomizawa 1990), последовательности, обеспечивающие процессинг этого комплекса РНК-зой Н, образующей 3'-конец, необходимый ля инициациисинтеза лиирующей цепи (Hillenbrand, and Staudenbauer 1982, Itoh, and Tomizawa. 1980), сайт сборки праймосомы pas (ssiA) обеспечивающий связывание DnaB хеликазы и DnaG праймазы ля инициации синтеза отстающей цепи (BOldicke et al., 1981, Masukata. and Tomizawa. 1990, Nomura, and Ray 1980), последовательность терминатора синтеза отстающей цепи, terH (DasGupta et al., 1987, Mindcn and Marians. 1985). Электронно-микроскопический анализ репликативных интермсиатов ColEl показал, что репликация является однонаправленной (DasGupta et al., 1987, Minden and Marians, 1985).

1.1.2. Репликациоппый аппарат E. coli.

Практически все плазмиды используют для своей репликации все или большую часть репликационного аппарата хозяйской клетки. Поэтому первоначально будет рассмотрен аппарат репликации ДНК Е. coli. (см. обзор Benkovitch et al., 2001).

Ключевым компонентом репликационного аппарата Е. coli является холофсрмент ДНК-полимеразы III, состав которого указан в таблице. 1. Холофермент состоит из 10 субъединиц. Минимальный фермент (as0) включает, соответственно, полимеразную единицу, 3'- 5' экзонуклеазу. и вспомогательный пептид. Второй компонент, т — белок, являющийся продуктом гена dnaX, связывает asG субъеиницы с образованием димерной структуры (as0)2T2. С-концевой домен тбелка обеспечивает связывание альфа-белка и DnaB — хеликазы. Третьим компонентом является у — комплекс, обеспечивающий сборку и димеризацию холофермента ДНК-полимеразы. Комбинация этих трех компонентов приводит к образованию полимеразы, имеющей структуру (as0)2T2 угбб’хч*. обладающего низкой процессивностью в отсутствие Р — субъединицы. Добавление двух р — субъединиц приводит к образованию холофермента ДНК-полимеразы 111, имеющего молекулярную массу около 900кД. Белок «скользящего зажима», Р, представляет собой димер, свободно перемещающийся вдоль ДНК в обеих направлениях. Рентгеноструктурный анализ этого белка показал, что «скользящий зажим» действительно представляет собой кольцо, центральное отверстие которого имеет диаметр 35А, что остаточно для того, чтобы через него проходила двунитевая ДНК.

Наряду с ДНК — полимеразой III, в репликации принимают участие ряд других белков. DnaG праймаза обеспечивает синтез РНК-праймеров, необходимых для репликации отстающей цепи. Этот фермент узнает послеовательности 5'-CTG-3' в однонитевой ДНК и синтезирует праймеры длиной 8−12 нуклеотидов. DnaB является основной хеликазой, обеспечивающая расплетание нитей ДНК. Рентгеноструктурный анализ показал, что гексамеры этого белка образуют кольцевые структуры, движение которых вдоль ДНК, вероятно, и приводит к расплетению нитей. Белок DnaC, обеспечивает взаимодействие хсликазы и праймазы с ДНК, находящейся в комплексе с SSB-белком. SSB-белок образует тетрамерные структуры, связывающиеся с однонитевой ДНК, %- субъединицей холофермента ДНК-полимеразы III, а также DnaG. SSB необьодим для координированного синтеза ведущей и отстающей цепей. Помимо DnaB, DnaG и SSB, для сборки праймосомы необходимы продукты генов dnaC, dnaT (protein i), priA (protein rC), priB (protein n) и priC (protein n'). Последовательная сборка этих семи белков обеспечивает формирование праймосомы, необходимой для синтеза фрагментов Оказаки. Последующее удаление РНК-праймеров осуществляется ДНК-полимеразой I и РНКзой Н, оставшиеся однонитсвые разрывы «зашиваются» ДНК-лигазой.

Во время репликации ДНК ее дочерние синтезирующиеся цепи расходятся из точки репликации, образуя Y-подобную структуру, называемую репликативной вилкой. Модель репликативного комплекса Е. coli представлена на Рис 4. Координированная репликация ведущей и отстающей цепей обеспечивается за счет димерности ДНК-полимеразных комплексов. Один комплекс осуществляет непрерывный синтез ведущей цени ДНК, а второй — синтез фрагментов Оказаки отстающей цепи. В соответствии с этой моделью, ДНК-хеликаза перемещается в репликативной вилке впереди ДНК-полимеразы и расплетает цепи родительской ДНК, причем SSB-белок связывается с образующимися одноцепочечными участками, облегчая процесс расплетения.

Таблица 1. Состав холофермента ДНКполимеразы III Е. coli.

Субъе Масса Функция Контакты в Примечания диница (кД) субстуктурах, а 130 ДНК-полимераза U-E-0 Pol HI (аОе),.

8 27.5 3', 5' экзонуклеаза минимальный.

0 8.6 активизация экзонуклеазы фермент.

X 7.1 Сборка и димеризацию холофермента ДНК-полимеразы,. а-е-0 0еа-у-|-аеО У-У.

У 47.5 А’ГФ-зависимое связывание «скользящего зажима» /" у-Комплекс. ДНК.

5 38.7 вспомогательный белок, / зависимая связывается с Р / X-5 АТРаза,.

5' 36.9 вспомогательный белок, стимулирует АТФ-зную активность у обеспечивает связывание затравки с г 16.6 вспомогательный белок, связывание SSB матрицей, стимулирует.

V 15.2 вспомогательный белок ДНКполимеразу. р 40.6 образование «скользящего зажима» «скользящий зажим» направление движения Ог. а В.

Реп лик ационн ая вилка.

DnaB *еликэзэ.

Праймазэ направление движения реплмкационной вилки направление синтеза ведущей цепи направление синтеза отстающей цепи.

SSB.

Рисунок 4. Структура репликационного комплекса Е. coli.

1.1.3. Инициация и элонгация репликации, зависящая от тазмидных Rep белков.

Инициация репликации требует сборки реплика пион, но го комплекса в составе холофермента ДНК-лолимеразы Ш. DnaB хеликазы и DnaG праймазы в сайте инициации репликации. Большинство плазмид, реплицирующихся по тета-механизму, требуют кодируемого плазмидой Rep белка и бактериального DnaA для инициации репликации. Плазмидный ori сайт обычно включает не только сайты связывании этих белков, но также и ATбогатый район, содержащий прямые повторы, аналогичные 13 -нуклеотидным элементам в oriC. Этот район обеспечивает локальное расплавление ДНК. Связывание Rep белка с соответствующими последовательностями в oriсайте приводит к образованию первоначального комплекса, аналогичного образуемому под действием DnaA в oriC. Комплекс Rep-ДНК, в сочетании с DnaA, обеспечивает перенос DtiaB-DnaC комплекса в ori и расплетание АТ-богатого участка. Структурная организация инициаторного комплекса может происходить более эффективно в присутствии бактериальных факторов HU, IHF и F1S. Процесс сборки инициаторного комплекса был исследован для нескольких плазмид. a) Плазмида pSClOl.

RepA, инициаторный белок плазмиды pSClOl, присутствует в клетке в виде мономеров или димеров, соотношение которых определяет эффективность репликации (Ingmer et al., 1995). И мономеры и димеры обладают функциональной активностью, но играют различные роли: в то время как мономеры связываютяс с итеронами в оп-сайте, инициируя репликацию, димеры связываются с соседним сайтом, представляющим собой инвертированный повтор, тем самым репрессируя транскрипцию гена герА (Manen etal., 1992). Помимо RepA, инициация репликации pSClOl требует DnaA и 1HF (Hasunuma, and Sekiguchi 1977, Gamas etal., 1986, Stenzel, et al., 1987). Связывание IHF вызывает изгиб ДНК (Stenzel, et al., 1987), облегчающий взаимодействие между отдельными молекулами DnaA, связанными с DnaA-сайтами (Stenzel, et al., 1991). Связывание RepA с ог/-районом стабилизирует эти контакты (Stenzel, et al., 1991). b) Плазм ида PI.

Репликация фага-плазмиды PI зависит, как ш vivo, так и in vitro, от инициаторного белка RepA (Abeles et al., 1984, Wickner S. and Chattoraj 1987) и бактериального белка DnaA (Hansen, and Yarmolinskyl986, Wickner S. and Chattoraj 1987). Образование инициаторного комплекса происходит при участии мономерных форм RepA (Wickner et al., 1991), связывание которых с ДНК стимулируется шаперонами теплового шока. Эти белки способствуют диссоциации димеров RepA на мономеры, которые связываются с 5 итеронами в о/7-сайте (DasGupta et al., 1993, Wickner et al., 1991). Однако, имеются данные о том, что шапероны необходимы ял активации мономеров RepA (Chattoraj et al., 1996, Dibbens et al., 1997, Pak and Wickner 1997). Один RepA не обеспечивает локальное расплавление ДНК, которое вызывается или стимулируется DnaA, который также стимулирует ДНК-связывающую активность RepA (Mukhopadhyay et al., 1996). Oriсайт PI содержит 5 сайтов DnaA, хотя одного сайта достаточно для инициации репликации (Abeles et al., 1990, Brendler et al, 199lab), локальное расплавление ДНК наиболее эффективно, если присутствуют все сайты. Ориентация DnaA-сэйтов предполагает, что DnaA-зависимое связывание DnaB преимущественно происходит на одной цепи ДНК, что может являться причиной однонаправленности репликации ДНК PI (Mukhopadhyay et al., 1993). Эффективная репликация PI требует также метилирования пяти GATC сайтов, присутствующих в ori-районе. Эти GATC сайты представляют собой гептамерный повтор, отделенный от сайта связывания RepA GC-богатым спейсером (Abeles and Austin 1987, 1988, Brendler eta!., 1995). c) Плазмида RK2.

Кодируемый плазмидой инициаторный белок TrfA (Konieczny et al., 1997) связывается с пятью 17-нуклеотидными итеронами. Это взаимодействие вызывает локальное расплавление ДНК в районе АТ-богатого участка. Связывание DnaA с четырьмя сайтами, присутствующими в этом районе, также требуется для инициации репликации. DnaA и TrfA необходимы для связывания DnaB с ori-сайтом. d) Плазмида R1.

Репликация плазмиды R1 in vivo и in vitro зависит от инициаторного белка, RepA (Diaz et al., 1981, Kollck et al., 1987, Masai et al., 1987, Uhlin and NordstrSm 1978). В отличие от описанных выше случаев, oriR не содержит итеронов. RepA, вероятно в форме димера, связывается с двумя палиндромными последовательностями (Giraldo, and Diaz. 1992). После образования первичного комплекса repA-oriR, дополнительные молекулы RepA связываются с участком между этими палинромами, что приводит к расплавлению АТ-богатого участка (Masai and Arai 1988.). Репликация ДНК R1 in vitro требует участия DnaA (Masai and Arai. 1987, Ortega-Jimdnez et al., 1992), однако DnaA не является необходимым in vivo (Bernander et al., 1991, Tang et al., 1989). Репликация in vivo в отсутствие DnaA является низкоэффективной, однако, мутанты с повышенным уровнем экспрессии герА реплицируются более эффективно (Bernander et al., 1991). Эти результаты свидетельствуют о важной роли RepA в активации oriсайта и позволяют предположить, что RepA обеспечивает локальное расплавление ДНК и связывание DnaB-DnaC-комплекса.

1.1.4 Репликация фага-плазмиды Р4.

Репликационный белок альфа фага-плазмиды Р4 обеспечивает двунаправленную тета-репликацию его ДНК, инициируемую на сайте oril (Krevolin et al., 1985). Другной сайт, err, располдоженный на расстоянии примерно 4500 нт от oril, необходим in cis для репликации ДНК Р4 (Flensburg and Calendar, 1987; Tocchetti et al., 1999). Репликация зависит как от фаговых, так и от бактериальных генов. Для элонгации необходимы бактериальные белки SSB и ДНК-полимераза Ш, в то время как инициаторные белки DnaA, а также хеликаза DnaB, белок DnaC, праймаза DnaG, а также вспомогательная хеликаза Rep Е. coli, не требуются (Lindqvist and Six, 1971; Barrett et al., 1972; Bowden et al., 1975; Krevolin and Calendar, 1985; Diaz Orejas el al., 1994). Все эти функции обеспечиваются продуктом фагового гена a (Flensburg and Calendar, 1987; Ziegelin el al., 1993). Альфа-белок, длиной 111 аминокислот, содержит несколько функциональных доменов: (1) N-концевой домен обладает праймазной активностью. Этот район содержит консервативный мотив EGYATA, характерный для многих праймаз конъюгативных плазмид (Strack el al., 1992; Ziegelin el al., 1993). Будучи изолированным, этот домен сохраняет праймазную активность и может комплементировать мутацию в праймазном домене альфа-белка (Ziegelin el al., 1995). (2) Середина и С-концевой район альфа-белка обладают хеликазной активностью и содержат мотив, характерный для связывания нуклеотидов типа A (Strack et «/., 1992; Ziegelin el al., 1995, 1997b). (3) Сконцевой фрагмент альфабелка обладает ДНК-связывающей активностью (Ziegelin et al., 1995). Белок связывается с декамерными последовательностями, присутствующими в oril и err сайтах.

Сайт инициации репликации oril состоит из двух частей: собственно oril и err сайта. Оба этих сайта содержат несколько прямых и инвертированных повторов декамерной последовательности (GGTGAACAGA/T), итеронов типа I, с которыми связывается альфа-белок (Krevolin et «/., 1985; Flensburg and Calendar, 1987; Ziegelin et al., 1993; Tocchetti et al., 1998). Более того, оба сайта содержат АТ-богатые участки. С помощью комплсментационного теста было установлено, что минимальный сайт oril включает район длиной 123 нт, содержащий шесть итеронов 1 типа (Tocchetti et al., 1999).

Эти итероны также присутствуют в err, альфа белок связывается с ними, но инициация репликации с этого сайта не наблюдалась ни in vivo, ни in vitro (Krevolin et al., 1985; Diaz Orejas et al., 1994). Crr включает два АТ-богатых повтора длиной 123 нуклеотида, каждый из которых содержит пять итеронов типа 1. Отсутствие одного из повторов снижает эффективность репликации тв 10 раз (Flensburg and Calendar, 1987; Tocchetti et al., 1999). В геноме P4 oril и crr находятся на расстоянии 4500 нт друг от друга, но это расстояние может быть сокращено до 100 нт без нарушения репликации (Flensburg and Calendar, 1987). Однако, относительная ориентация этих элементов существенна (Christian, 1990).

Во многих случаях было показано, что Rep белки связываются с несколькими сайтами, что вызывает образование петель на ДНК или межмолекулярные взаимодействия за счет белок-белковых взаимодействий (del Solar, 1998). Формирование подобных комплексов (handcuffingMcEachern et al., 1989) может ингибировать репликацию и контролировать число копий плазмиды. Взаимодействие альфа-белков, связанных с oril и err, наблюдалось in vitro (Ziegelin et al., 1993; Ziegelin and Lanka, 1995). Однако, в отличие от описанной выше ситуации, err играет позитивную роль в инициации репликации.

Эксперименты, имеющие целью локализовать cis — и transдействующие факторы, существенные для репликации Р4, привели к идентификации второго репликона в геноме Р4 (Tocchetti etal., 1998). Второй репликон, orill, также зависит от альфа-белка, но состоит из двух компонентов — ori2 и err сайтов. Сайт ori2 расположен внутри гена, кодирующего альфа-белок, примерно на границе праймазного и хеликазного доменов (Ziegelin et al., 1993; Tocchetti et al., 1999). Это позволяет предположить, что многофункциональный альфа-белок является результатом слияния двух генов, кодирующих праймазу и хеликазу, разделенный сайтом инициации репликации. Множественные сайты инициации репликации были описаны в различных прокариотических репликонах, например, плазхмиде R6K и фаге Т7 (Crosa, 1980; lnuzuka et al., 1980; Tamanoi et al., 1980). Обычно, основной оп'-сайт обеспечивает более чем 90% случаев инициации репликации, в то время как вспомогательный ori не функционирует. Это справедливо также и для Р4, в котором вторичный оп-сайт становится активным только в отсутствие oril. Как праймазная, так и хеликазная активности альфа-белка требуются для репликации с orill. ori2 не содержит итеронов типа 1 и не связывает альфа-белок. Более того, в ог/2 отсутствуют сайты связывания DnaA. Это предполагает, что репликация, инициируемая с oril и orill, может происходить по различным механизмам.

1.2 Репликация по механизму вытеснения цепи (Strand Displacement Replication).

Наиболее хорошо изученным примером плазмид, реплицирующейся по механизму вытеснения цепи, являются плазмиды семейства IncQ, прототипом которого является RSF1010. Репликация ее ДНК требует трех кодируемых плазмидой белков (Scherzinger et al., 1991, Sakai and Komano 1996).

1.2.1 Сайт инициации репликации.

Сайт инициации репликации RSF1010 был определен как минимальный район, обеспечивающий двунаправленную репликацию репликацию плазмиды в случае, если репликационные белки (RepA, RepB, и RepC) экспрессируются in trans (Scherzinger et al., 1991). Этот район содержит точку инициации репликации, в соответствие с результатами электронно-микроскопического анализа репликативных интермедиатов, как in vivo, так и in vitro (de Graaff et al., 1978, Scherzinger et al., 1991). Минимальный оп-район содержит три итерона длиной 20 нуклеотидов, район длиной 174 нт, содержащий G/C-райои длиной 28нт и АТ-богатый участок длиной 31 нт. Помимо этих элементов, ori содержит два небольших палиндрома, содержащих сайты ssiA и ssiB. Итероны являются сайтами связывания RepC (Haring and Scherzinger 1989, Haring et al., 1985). Ssi — сайты специфически узнаются праймазой RepB, инициирующей непрерывную репликацию с этих сайтов (Higashi et al., 1994, Honda etal., 1989, 1991).

1.2.2. Repбелки.

Как было отмечено выше, репликация RSF1010 обеспечивается совместным действием трех кодируемых плазмидой белков, RepA, RepB, RepC, обладающими, соответственно, активностями ДНК-хеликазы, праймазы и связывания с ori-сайтом (Haring and Scherzinger 1989, Sakai and Komano 1996). RepC, — димер, состоящий из двух 31кД субъединиц, специфически взаимодействует с итеронами в ori-сайте (Haring and Scherzinger 1989, Haring et al., 1985) и, вероятно, с RepA (Honda et al., 1991, Scherzinger et al., 1991, Tanaka et al., 1994). RepA является гексамером (субъединицы ЗОкД) и обладает активностями оц-ДНК-зависимой АТФазы и ДНК-хеликазы. Белок RepB обладает праймазной активностью.

RepC.

RepB 4.

G+C A+T.

Herons.

SSiA -<�— ssiff w.

RepC.

RepA 3.

Рисунок 5. Механизм репликации плазмиды RSF1010. a) Структура сайта инициации репликации. b) Модель инициации репликации RSF1010.

1.2.3 Механизм репликации.

Репликация плазмиды RSF1010 не зависит от бактериальных белков DnaA, DnaB, DnaC, и DnaG, функции которых выполняются плазмидгыми RepA, RepB, и RepC белками (Frey and Bagdasarian 1989, Haring and Scherzingerl989). Репликация инициируется на сверхспирализованной матрице (Diaz, and Staudenbauer 1982, Scherzinger et al., 1991). ДНК-полимераза Ш и SSB необходимы для репликации. Общая схема репликации, предложенная в работе (Scherzinger et al., 1991), приведена на Рис. 5. Первым этапом является связывание RepC с итеронами с сайте инициации репликации.

RepA хеликаза связывается с Lцепью (цепь ДНК, содержащая 10 из 11 генов RDF1010), перемещается в направлении 5*-3 локально расплавляет ДНК и активирует ssi-сайты (Scholz et al., 1989). В альтернативной модели, связывание RepC с итернами активирует ssi-сайты. На следующем этапе праймаза RepB связывается с ssi, что приводит к сборке репликационного комплекса и старту репликации (Miao et al., 1993). Репликация на каждом из ssi сайтов инициируется независимо и происходит непрерывно, вследствие того, что RepA вытесняет нереплицированную материнскую нить. Хеликазная активность RepA необходима в ходе элонгации и этот белок не может замещаться бактериальной хеликазой DnaB. Конечными продуктами репликации являются одноцепочечное вытесненное кольцо и двунитевая кольцевая молекула. Сайты ssi затем используются для синтеза комплиментарной нити, в результате чего одноцепочечная кольцевая молекула преобразуется в двунитевую форму, что завершает репликацию.

1.2 Репликация по механизму катящегося кольца.

Репликация по механизму катящегося кольца является однонаправленной и по своей природе ассимметричной, поскольку синтез ведущей и отстающей цепей происходят независимо (см. обзоры del Solar et al., 1993, Espinosa et al., 1995, Gruss and Ehrlich 1989., Khan, 1996, 1997, Novick, 1989). Характерной чертой этого механизма репликации является то, что новая реплицированная ведущая цепь остается ковалентно связанной с той же родительской цепью.

Существующая модель репликации по механизму катящегося кольца включает несколько этапов (Рис. 6). Репликация инициируется кодируемым плазмидой Rep-белком, который вносит однонитевой разрыв в (+) нить, в районе, называемом double-stranded origin (dso). Образующийся З'-ОН конец используется как праймер для инициации синтеза ведущей цепи, который протекает при участии бактериальных белков (как минимум, ДНК-полимеразы Ш, SSB и хеликазы). Элонгация начиная с 3-ОН конца, сопровождающаяся вытеснением родительской (+) цепи, продолжается до тех пор, пока реплисома не достигнет dso-сайта. В этот момент Rep белок выполняет реакцию разрыва и соединения цепей, в результате чего освобождается однонитевая кольцевая молекула и двунитевая дочерняя молекула ДНК. В отличие от механизма вытеснения цепи, репликация по механизму катящегося кольца приводит к тому, что только одна цепь ДНК присутствует в составе однонитевого интермедиата (Gruss and Ehrlich 1989, te Riele et al., 1986). На завершающей стадии родительская однонитевая молекула преобразуется в двухцепочечную форму бактериальными белками, инициирующими репликацию в районе, называемом single-strand origin (550), физически отличном от dso. п О к. >ч о> <1 о.

Pol 111.

Helicose.SSB.

Rep.

Pi.

Poll sso.

Pol III P a < z сс sso.

Рисунок 6. Модель репликации по механизму катящегося кольца. Новая синтезированная цепь показана пунктирной линией.

2. Механизмы сегрегационной стабильности бактериальных плазмид.

Правильное распределение реплицированных хромосом между дочерними клетками перед делением (partitioning) является жизненно важным процессом для бактериальной клетки. Первая модель этого процесса была предложена Жакобом (Jacob et al. 1963) как часть «гипотезы репликона». Эта модель предполагала, что хромосомы присоединяются к определенным точкам клеточной оболочки таким образом, что рост клетки «растаскивает» реплицированные хромосомы. Однако, открытие класса мутантов Escherichia coli, репликация которых протекает нормально, а сегрегация хромомосом нарушена, предполагает существование активного механизма сегрегации хромосом (Hiraga, 1992).

В то время как для высококопийных плазмид даже случайное распределение между дочерними клетками практически исключает образование бесплазмидных клеток (если число копий плазмиды равно п, то скорость ее потери на генерацию составит 1 / 2″), стабильное наследование низкокопийных плазмид требует особых механизмов. Известны два таких принципиальных механизма: активное распределение реплицированных молекул между дочерними клетками при делении (сегрегационная стабильность, = partitioning) и пост-сегрегационный киллинг дочерних клеток, не содержащих плазмиду. Последний механизм (Gerdes et al., 1997) основан на коэкспрессии двух генов, содержащихся на плазмиде, — стабильного токсина и нестабильного антитоксина. Не получившая плазмиду дочерняя клетка в этом случае будет инактивирована токсином. Этот механизм менее выгоден для популяции, чем сегрегационная стабильность, и, как правило, является вспомогательным. Так, плазмиды PI и F, наследование которых обеспечивается за счет механизма сегрегационной стабильности, используют пост-сегрегационный киллинг как «дополнительный контроль», исключающий образование бесплазмидных клеток в случае если основной механизм по каким то причинам не сработал. В этой части обзора литературы будут рассмотрены общие принципы функционирования механизма сегрегационной стабильности низкокопийных плазмид.

2.1 Бактериофаги PI и Р7.

Наиболее хорошо изученным примером системы сегрегационной стабильности является par системы бактериофагов Р1 и Р7. Эти фаги являются родственными, содержат протяженные участки гомологии (см. Yun and Yanpnek, 1977), а в лизогенном состоянии не интегрируются в хромосому Е. coli, а представляют собой кольцевые низкокопийные плазмиды. Все компоненеты системы сегрегационной стабильности локализованы в одном локусе, par (Austin and Abeles, 1983a, bLudtke et al., 1989). Этот локус включает авторегулируемый оперон, состоящий из двух генов, рагА и parB, а также слу-действующий сайт parS, следующий за геном рагВ. Структура par локуса показана на Рис. 7.

С/з-активный сайт, parS, является сайтом связывания ParB. ParS и сайты связывания ParB/SopB белков в других плазмидах расматриваются как «центромеро-подобные», поскольку они являются сайтами, связываясь с которыми белки аппарата сегрегационной стабильности осуществляют транспорт плазмид, т. е. их функция аналогична функции центромер в митозе эукариот. РагВ и возможно РагА в этом случае являются «мостиками», связывающими плазмидную ДНК и клеточный транспортный аппарат.

Бактериофаг Р1.

Плазмида RK2.

AUC U.п.

ШЛЕЯ-—НЕГ" i—Tof-М—й.

WUB Ш! фТО.

Плазмида R761 оС=Н «IG-LKHZE.

IH О b kfrA vpfUJ J.

1'J t].

Рисунок 7. Сравнение локусов сегрегационной стабильности плазмид F, RK2, R751 и бактериофага Р1.

Гомологи par, А выделены светло-серым, гомологи рагВ — темно серым. Для Р1 и F структура сайтов связывания ParB/SopB показана более подробна: черные стрелки указывают повторы, а прямоугольники — сайты связывания IHF. Сайты связывания КогВ в RK2 и R751 показаны как серые кружки.

ParS включает два типа последовательностей, узнаваемых ParB (Davis et al., 1990), расположенных по обеим сторонам сайта связывания IHF. Основная последовательность, обеспечивающая связывание РагВ, — это гептамер (atttcac), казываемый Бокс А. Имеются четыре копии бокса А, два из которых образуют инвертированный повтор в правой половипе parS, — минимальную последовательность, необходимую для связывания ParB (Martin et al., 1991). Второй послеовательностью, участвующей в связывании РагВ, является гептамер (tcgcca), называемый Боксом В (Davis et al., 1990). Связывание IHF с parS вызывает изгиб ДНК, центр которого находится в сайте связывания IHF. Этот изгиб способствует специфическому свзыванию РагВ с parS (Davis and Austin, 1988; Funnell, 1988b, 1991; Funnell and Gagnier, 1993).Эксперименты по задержке в геле показали, что комплекс, образующийся у parS, включает IFH и димер ParB (Bouet et al., 2000).

Белок РагА обладает АТФ-зной активностью и выполняет две функции: во-первых, он репрессирует промотор par оперона и, во-вторых, является компонентом собственно механизма сегрегационной стабильности (Davis et al., 1992 Friedman and Austin, 1988, Davis et al., 1996). РагА образуют димеры, связываясь с ATP или ADP. Описана точечная мутация в РагА, не влияющую на репрессию промотора par оперона, но нарушающую стабильность высококопийной плазмиды, содержащей parS (Youngren and Austin, 1997). Анализ свойств этого мутанта позволил выдвинуть гипотезу о образовании после репликации ориентированных пар плазмид, которые разделяются и траипортируются к противоположным концам делящейся клетки. Если контакт между плазмидами осуществляется в parS сайтах, а функция РагА состоит в разделении пар, то описанная мутация, нарушающая эту функцию, фактически приведет к снижению эффективного числа копий плазмиды вдвое.

Второй важной функцией РагА является регуляция экспрессии par оперона, что обеспечивает контролируемую продукцию Par белков. Повышенный уровень их экспресии нарушает работу механизма снгрегационной стабильности (Funnell, 1988а Hayes et al., 1994). РагА репрессирует транскрипцию, связываясь с районом, прекрывающим промотором оперона (Abeles et al., 1985), а именно, участком длиной около 140 нт, центром которого является АТ-богатый палиндром длиной 42 нт (Davis et al., 1992). Аналогичным образом соответствующий промотор репрессирует РагА белок фага Р7. РагА белки содержат ДНК-связывающий helix-turn-helix мотив в N-концевом участке (аминокислоты 43−62 в PI и 44−63 в Р7), замена этого мотива в ParA Р1 на эквивалентный мотив из ParA Р7 приводит к смене специфичности репрессии промотора (Hayes et al., 1994).

2.2 Плазмида F.

Fфактор является низкокопийной конъюгативной плахмидой, кодирующей собственный механизм сегрегеционной стабильности, или sopсистему. Sop локус включает два гена, sopA и sopB, а также с/5-действующий сайт, sopC.

Как и ParA, SopA принимает участие как в регуляции экспрессии оперона, так и в работе собственно механизма сегрегационной стабильности. SopA связывается с четырьмя последовательностями CTTTGC, перекрывающими промотор, и, тем самым, репрессирует его (Mori et al., 1989). Уровень репрессии возрастает в присутствие SopB, и дополнительно возрастает в присутствие sopC (Yates et al., 1999).

Структура центромерного сайта sopC существенно отличается от структуры parS. SopB связывается с двенадцатью прямыми повторами последовательности длиной 43 нт, составляющими sopC (Hayakawa et alMori et al., 1986, 1989; Lane et al., 1987; Watanabe et al., 1989). Однако, одна единица обеспечивает уровень стабильности плазмиды, эквивалентный обеспечиваемому целым sopC. Эта 43-нт единица включает инвертированный повтор длиной 7+7 нуклеотидов, разделенных двумя нуклеотидами и зеркальный повтор 9+9 нуклеотидов, разделенный одним нуклеотидом. Связывание SopB не требует участия IHF (Ogura et al., 1990), что согласуется с отсутствием соответствующего сайта в sopC.

Длина (т.п.н.) 1.

P" J Рая i ж ж ж ж репрессия транскрипции связывание с центромерой.

I I.

F Рав репрессия транскрипции связывание с центромерой 1.

R1 Ж Ж * * Ж * Ж 1 > рагМ parR.

Pmr.

I w репрессия связывание с центромерой.

Рисунок 8. Организация sop оперонов плазмид PI, F и R1. Заштрихованый прямоугольник — транскриптЧерные прямоугольники, элементарные единицы центромерных сайтов.

2.3 Плазмида R1.

Par локус плазмиды R1 является аналогом, но не гомологом par/sop лоуксов F и Р1. В этом случае центромерный рагС сайт расположен не после оперона, состоящего из геноъ рагМ и parR, а перед ним (Dam and Gerdes, 1994, Gerdes and Molin 1986) .parC сайт также содержит и промотор оперона, перекрывающийся двумя итеронами, с которыми связывается ParR. (Jensen R.B. et al., 1998; Breuner et al., 1996; Jensen et al., 1994). Связывание ParR с итеронами необходимо как для репрессии, так и собственно для работы механизма сегрегационной стабильности. РагМ обладает АТФазной активностью, которая необходима для работы par-системы (Jensen and Gerdes, 1997). В отличие от SopA/ParA, РагМ не принимает участие в регуляции активности par промотора. Центромсрный сайт рагС включает 10 итеронов длиной 11 нт, фланкирующих промоторный участоквсе десять сайтов необходимы для работы механизма сегрегационной стабильности R1. Было установлено, что образование сегрегационного комплекса у рагС приводит к образованию пар плазмид, контактирующих в районе этих сайтов.

2.4 Внутриклеточная локализация плазмид.

Использование флуоресцентных зондов для изучения внутриклеточной локализации плазмид в последние годы существенно облегчило анализ механизмов сегрегационной стабильности плазмид и хромосом. Было установлено, что перемещение новой реплицированной ДНК является не пассивным процессом, связанным с увеличением клеточной стенки, а активным и достаточно быстрым (относительно периода клеточного цикла) процессом (Sharpe and Errington, 1999, Jensen and Shapiro, 1999).

Внутриклеточная локализация плазмид F и PI в живых клетках была исследована с помощью флуоресцентного белка GFP. Для этого в геном плазмид был интегрирован lacоператор, с которым связывался гибридный белок GFP-lacI, экспрессируемый в той же клетке (Gordon et al., 1997, Jensen and Gerdes, 1999). Аналогичные паттерны внутриклеточной локализации плазмид были выявлены в экспериментах с использованием fluorescent in situ hybridisation (FISH) (Niki and Hiraga, 1997). Пример визуализации плазмиды F с помощью FISH приведен на Рис. 9.

Правильная внутриклеточная локализация плазмиды F зависит от функционирования sop — системы (Niki and Hiraga, 1997). В клетках, содержащих одну F или Р1 плазмиду, флуоресцентный сигнал локализуется в районе центра клетки, в то время как в клетках, содержащих две плазмиды (результат репликации), они расположены в положениях V* и V* по длине клетки. Таким образом, можно предположить, что плазмиды реплицируются в центре клетки, а затем транспортируются в положения положениях % и V*, т. е. в центры будущих дочерних клеток, где они и находятся до завершения клеточного деления. Отсутствие флуоресцентных фокусов в других положениях свидетельствует о том, что этот перенос протекает достаточно быстро по сравнению с длительностью клеточного цикла, что предполагает активный транспорт плазмид.

Также была исследована внутриклеточная локализация Sop В и РагВ (Erdmann el al 1999, Kim and Wang, 1998). Гибридный белок SopB-GFP локализуется в положениях Щ и Ул, что позволяет предположить, что именно он обуславливает аналогичную внутриклеточную локализацию sopCсодержащей плазмиды. Аналогичным образом было установлено, что РагВ локализуется в положениях % и образование точечного фокуса за виси ло от присутствия parS, в то время как его правильное положение зависело также и от Pa г A (Erdmann et а! 1999).

Caulobacter crescentis.

Рисунок 9. Внутриклеточная локализация плазмиды F и хромосомной Д! !К. I и II — состояния до и после инициации репликации. В случае бактериальных хромосом использовано два различных флуоресцентных зонда, гибридизующихся с районом ori-сайта (О) и районом терминации репликации (Т). Рисунок взят из работы (Moller-Jensen et at., 2000) и модифицирован для воспроизведения в черно-белом виде.

2.4 Модель функционирования механизма сегрегационной стабильности.

Полученные в последние годы результаты (Niki and Hiraga, 1997, 1999; Jensen et al., 1998; Jensen and Gerdes 1997) свидетельствуют в пользу следующей модели функционирования механизма сегрегационной стабильности (Рис. 10, Moller-Jensen et al., 2000), принципиально аналогичной митозу у эукариот. Репликация плазмид, локализованных в районе центра клетки сопровождается формированием сегрегационных комплексовреплицированные молекулы плазмид образуют пары за счет взаимодействия сегрегационных комплексов, связанных с их центромерами. После завершения репликации происходит разделение пар (в случае плазмиды F эту функцию, вероятно, выполняет SopA) и активный транспорт плазмид под действием неидентифицированных в настоящее время клеточных факторов. Образование пар плазмидами R1 in vitro зависит от белков ParR и ParM (Jensen et al., 1998). Следовательно, сборка сегрегационнго комплекса является необходимым предварительным условием для последующей работы гипотетического митотического аппарата. Колокализация плазмид и белков, связывающихся с центромерами (РагВ, SopB и ParM of R1) предполагает, что эти белки связывают транспортированные плазмиды со специфическими клеточными структурами, сохраняя их в определенной позиции до завершения клеточного деления.

Сегрегация хромосом является более сложным процессом. Флуоресцентная детекция хромосомной ДНК показала, что реплицированные oriсайты быстро разделяются за счет движения к противоположным полюсам клетки. Это согласуется с тем, что хромосомные аналоги sop/par семейства специфически связываются с последовательностями, расположенными вблизи ori-сайтов. Будучи клонированными в плазмидах, хромосомные и плазмидные sop/par системы работают одинаково эффективно. Поэтому вероятно, что плазмидные и хромосомные sop/par системы, могут функционировать сходным образом, т. е. может происходить образование спаренных oriCрайонов, которые затем разделяются и транспортируются к противоположным полюсам.

Moller-Jensen и соавторы (2000) предложили следующую модель сегрегации бактериальных хромосом. В только что образовавшейся клетке oriC перемещается к центру клетки, где происходит сборка реплисомы. После инициации репликации центромероподобные районы около or/'-сайта, совместно с sop/par «митотическим» аппаратом. а) плазмида бактериальная (слегка сегрегационный комплекс кепписома репликация сегрегация ппазшщ О кпеючное деление.

I И I jсегрегация oriC конденсация демосом платочное деление.

Ш1Ш ртчц®- «» ftAtTnfUiifjijy.

Рисунок. Ю. Модель сегрегации плазмид и хромосом прокариот (Moller-Jensen et al.,.

2000).

Позднее, одновременно с репликацией, oriC активно транспортируется к полюсам клетки, к которым затем прикрепляются. Последовательная конденсация синтезированной ДНК обеспечивает двунаправленный перенос хромосомы, но направлению к полюсам клетки. Эта модель является некоторым упрощением реальной ситуации, поскольку она не принимает во внимание наличие нескольких репликационных вилок в быстро растущей бактериальной культуре. Более того, последствия отсутствия par/sop гомологов в некоторых бактериальных геномах (например, Е. coli) требуют дальнейшего изучения.

Origin.

3. Особенности генетики бактериофага N15.

Бактериофаг N15 был выделен и описан В. К. Равиным в 1964 г (Голуб и Равин, 1967). Фаг N15 имеет линейную двунитевую ДНК молекулярной массой 30 МД, частота лизогенизации около 50%, урожай фага около 100, латентный период 45 мин (Равин, 1971). Бактериофаги N15 и лямбда имеют схожую структуру вириона, около 50% ДНК N15 гибридизуется с ДНК фага лямбда (Ravin and Shulga, 1970). На основании этого N15 был отнесен к семейству лямбдоидных фагов.

Лизогенные по фагу N15 бактерии также устойчивы к фагам Т1 и phi80 (лизогенная конверсия), (Голуб и Равин, 1967). Ген cor, ответственный за конверсию, впоследствии был локализован на физической карте фаговой ДНК (Малинин и др., 1993; Vostrov et al., 1996).

Как было показано В. К. Равиным и сотрудниками в 1967;70 гг, уникальной особенностью N15 является то, что в лизогенном состоянии он не интегрируется в хромосому, а представляет собой автономно реплицирующуюся плазмиду. Этот вывод был основан на трех фактах, суммированных в работе (Ravin and Shulga, 1970).

1. Были получены температурно чувствительные мутанты фага N15, которые можно разделить на два класса: «ранние» и «поздние» (Равин и Шульга, 1968). У «ранних» мутантов при непермиссивной температуре блокирована репликация ДНК. Было установлено, что в этих условиях лизогенные бактерии теряют профаг (Равин, 1968).

2. Результаты бактериальных кроссов показывают отсутствие профага в хромосоме лизогенных клеток (Равин, 1972).

3. Бактериальная и фаговая ДНК могут быть разделены при центрифугировании препарата ДНК из лизогенной по фагу N15 культуры в сахарозном градиенте (Ravin and Shulga, 1970).

Следующий важный шаг в изучении генетики фага N15 был сделан проф. В. Н. Рыбчиным и сотрудниками, которые показали, что профаг N15 представляет собой линейную плазмиду с ковалентно замкнутыми концами (теломерами). Вывод о линейности профага N15 был сделан на основе физического картирования ДНК фага и профага, которое показало, что (1) обе молекулы ДНК линейны и имеют длину 46.3 тпн и (2) рестрикциопная карта профага является результатом циклической пермутации карты фага (Сварчевский и Рыбчин, 1984b).

Концы профага N15 (теломеры), назвываемые telL и telR, представляют собой шпилечные структуры, т. е. две нити ДНК ковалентно связаны однонитевыми участками. Шпилечная структура теломер профага N15 была установлена (Сварчевский и Рыбчин, 1984b) в результате двух экспериментов: (1) концевые, но не внутренние рестрикционные фрагменты могут быстро ренатурировать после тепловой денатурации и быстрого охлаждения, (2) обработка плазминой ДНК нуклеазой S1, разрезающей однонитевую ДНК, перед рестрикцией, нарушает способность концевых фрагментов к быстрой ренатурации. Кроме того, при электрофорезе в денатурирующих условиях видимые длины концевых рестрикционных фрагментов удваиваются (Малинин и др., 1992а).

В работах (Малинин и др., 1992а, 1992b) были определены нуклеотидные последовательности концевых районов профага и соответствующего неразрезанного сайта в фаговой ДНК, telRL, предсавляющего собой палиндром длиной 56 н. Схема образования плазмидной ДНК из фаговой, впервые предложенная в работе (Малинин и др., 1992а), показана на Рис. 11. После проникновения фаговой ДНК в клетку она замыкается в кольцо по когезивным концам, однонитевые разрывы зашиваются ДНК-лигазой. Затем гипотетический фаговый фермент, впоследствие названный протеломеразой (прокариотическая теломераза), вносит ступенчатый разрыв в фаговой ДНК в области telRL. Отжиг концевых однонитевых участков, имеющих внутреннюю комплементарность и последующее соединение фосфодиэфирных связей приводит к образованию ковалентно замкнутых теломер.

Некоторые свойства плазмиды N15 были охарактеризованы в работе (Сварчевский и Рыбчин, 1984а). Так, было установлено, что плазмида N15 является низкокопийной и стабильно наследуемой, — частота ее спонтанной потери не превышает 10″ 4 на генерацию. N15 совместим с плазмидами, представляющими различные группы несовместимости: PI, pBR322, Fфактором. Было установлено, что плазмида N15 поддерживается в штаммах Е. coli, содержащих мутации в генах герА и polA. В работе (Tilly, 1991) было показано, что ни литическое развитие N15, ни поддержание плазмиды, не зависят от мутаций в генах теплового шока dnaJ, dnaK, и grpE.

Было показано, что профаг N15 индуцируется под действием ультрафиолета в лизогенном штамме Е. coli С (N15) (Равин, 1972), но не в лизогенных штаммах-производных Е. coli К12 (штаммы К802 и М7010, Сварчевский и Рыбчин, 1984а). cosLС. циркуляризация telRL cosR I фаговая ДНК тс*ос]цзизитаотсаттм>сосдсотАТАМоо"я*ттотзтастом>—AIAOTCTTCTCTiaACS3GIART"TeCSCSC]gMTlVXTSiaWCAC"CGACTMtelRL telL о разрезание telRL сайта протеломеразой и образование ковалентно замкнутых тел о мер -—ДНК линейного профага telL.

GCGTATAATGGACTATTGTGTGCTGATA— О telR.

CGCATATTACCTGATAACACACGACTAT————^ ^ ^.

—-TATCAGCACACAATTGCCCATTATACGC.

ATAGTCGTGTGTTAACGGGTAATATGCQ ?

Рисунок 11. Преобразование фаговой ДНК в линейную плазмиду после инфекции. cosL, cosR, — однонитевые когезивные концы, cosRL, cos сайт после замыкания и лигированияtelRL, сайт действия протеломеразыtelL and telR, левая и правая шпилечные теломеры профага, образуемые при помощи протеломеразы.

Сварчевский и Рыбчин предположили, что репрессор литических функций N15 может быть устойчив к ReeA-зависимому расщеплению в штамме Е. coli К12. Отметим, что низкий уровень спонтанной индукции N15 наблюдается и в гесА" штаммах, что свидетельствует о существовании гесА-независимого пути индукции, описанного для фага лямбда (Rozanov et al., 1998).

Районы генома N15, существенные для поддержания плазмидного состояния были идентифицированы посредством конструирования миниплазмид (Сварчевский, 1986; Востров и др. 1992). Примерно 70% ДНК в центральной части генома линейного плазмидного профага может быть делетировано без нарушения функций репликации и поддержания плазмиды. Минимальный полазмидный репликон, расположенный в пределах фрагмента длиной 5.2 тпн (координаты 4.1−9.3 тпн по карте плазмиды) обеспечивал репликацию кольцевой миниплазмиды (Сварчевский, 1986).

Санькова и др (1992) локализовали районы в геноме N15, существенные для поддержания плазмидного состояния, а также для литического развития, в результате инсерционного мутагенеза при помощи транспозонов «mini-kan» и Тп9. Полученные мутанты были исследованы па способность образовывать негативные колонии (бляшки), стабильность плазмидного состояния, способность вызывать у бактерии-хозяина лизогенную конверсию (Рис. 12). В районе 1−10 тпн по карте плазмиды была получена всего одна вставка (Cml, 4.1 тпн), которая не нарушала ни поддержание плазмиды, ни литическое развитие. Отсутствие вставок в районе 4.1−10.0 тпн согласуется с предположением о его важности для репликации. Инсерции в ген Q, а также в район, содержащий «поздние» гены, нарушала литическое развитие фага, но не влияло на поддержание его в виде линейной плазмиды. Вставки в районы с координатами (11−16 тпн) и (41.2−41.4 тпн) не влияли ни на поддержание плазмиды, ни литическое развитие. Вставка во второй из этих районов (Km 19) нарушала лизогенную конверсию, что согласуется с локализацией в этом участке гена cor, ответственного за эту функцию (Малинин и др. 1993). Одна из вставок (Km 14), в точку с координатами 44.01 тпн, нарушала стабильное наследование профага, позднее было установлено, что этот район содержит гены sopA и sopB, обеспечивающие сегрегационную стабильность профага (partition, Ravin and Lane, 1999).

О 10 20 30 40 тпн.

111 ¦ ¦ сВ сю Q.

Минимальная кольцевая плазмида.

Район, который может быть делегирован в линейной гглазмиде.

Рисунок 12. Расположени инсерционных мутаций на генетической карте плазмиды N15. Буквами «р» и «d» отмечены инсерции, не нарушающие и нарушающие образование бляшек, соответственно. сА и сВ (надписи внутри прямоугольников), -положение локусов, в которых были картированы clear plaque мутации (в некоторых работах используются названия immA и immB).

Для идентификации генов, необходимых для контроля лизогении, первоначально были идентифицированы мутанты, образующие светлые бляшки (т.е. неспособные к лизогении). Эти мутанты (clear plaque) были картированы в трех различных локусах, immA, immB и immC (Сварчевский, 1986).

Локус irnmB, охарактеризованный в работе (Lobocka et al., 1996), структурно и функционально аналогичен CI локусу фага лямбда и обеспечивает устойчивость N15-лизогенов к суперинфекции (иммунность). lmrtxB содержит три гена (Рис.13). Ген 38 (сВ) кодирует репресссор, гомологичный CI репрессору фага лямбда. Clear plaque мутации, картированные в irnmB, находятся именно в пределах гена сВ, что подтверждает роль СВ как основного репрессора. Ген 39 (его), имеет гомологию с его генами фагов Р22 и НК022, и расположен в аналогичном положении относительно с/. Третий ген, 40 (Q) кодирует белок, сходный с фактором антитерминации транскрипции лямбдоидного фага phi82.

Температурночувствительная мутация (сЗ) по гену сВ при пермиссивной температуре приводит к увеличению числа копий профага в 10 раз, а при повышении температуры может происходить индукция фага. Таким образом, продукт гена сВ с одной стороны, является репрессором при репликации профага, а с другой, -репрессором литического развития (Lobocka et al., 1996).

Ген сВ фланкирован набором сходных, но не идентичных сайтов, содержащих промотор и перекрывающую его операторную последовательность. В работе (Lobocka et al., 1996) были идентифицированы операторные сайты и показано, что СВ связывается с ними in vitro, но позиции промоторов известны исключительно на основании анализа пуклеотидной последовательности и требуют экспериментального подтверждения. Два оператора, расположенные левее сВ, перекрывают предполагаемые промоторы гена герА, что позволяет предположить, что связывание СВ с этими операторами репрессирует транскрипцию герА. Это предположение дополнительно подтверждается данными, о том что Ы15-миниплазмиды, не содержащие ген сВ, имеют значительно более высокое число копий, чем плазмиды с интактным сВ (Равин и Равин, 1994). Три оператора, расположенные правее сВ, перекрывают предполагаемые промоторы самого гена сВ и промоторы «позднего» оперона, включающего гены его и Q. Предполагается (Lobocka et al., 1996), что связывание СВ с этими операторами регулирует уровень экспрессии самого гена сВ, а также генов его и Q.

Рисунок 13, Структурная организация района immB.

Показаны гены (серые прямоугольники), Предполагаемые промоторы (Р), терминаторы (Т), операторы (О) и сайты связываия рибосом (черные кружки). Гены, показанные выше (ниже) базовой линии, транскрибируются слева направо (справа налево).

Помимо СВ, еще как минимум два фактора могут участвовать в регуляции экспрессии герА (Lobocka в! al., 1996), хотя эти гипотезы не были проверены экспериментально. Во-первых, лидерная последовательность герА содержит Rho-независимый терминатор, что позволяет сделать предположение о том, что терминация-антитерминация может принимать участие в регуляции экспрессии герА.

Помимо этого, лидерный участок содержит ориентированный в противоположную сторону промотор Р1ПС за которым на расстоянии около 80нт следует терминатор (Рис. 13), С этого промотора может инициироваться синтез антнемысловой РНК, модулирующей экспрессию герА. Регуляция экспрессии генов, обеспечивающих репликацию, при помощи антисмысловых РНК. достаточно распространена и, в частности, описана в случае логического репликона фага PI (Heinrich et al., 1995).

4. Векторы для клонирования крупных фрагментов ДНК.

Одной из целей настоящей работы являлось использование фага N15 как основы для создания линейных клонирующих векторов, обладающих большой емкостью. Поэтому в этой части Обзора литературы будут рассмотрены существующие в настоящее время системы для клонирования крупных фрагментов ДНК (более 20 тпн) и проблемы, возникающие при клонировании фрагментов ДНК, содержащих инвертированные повторы, которые достаточно часто встречаются в геномной ДНК эукариот.

Изучение структуры и экспрессии генов прои эукариот включает в качестве обязательного промежуточного этапа клонирование этих генов. Для этого необходимо получение библиотек геномной ДНК. Идеальный вектор для клонирования геномной ДНК должен обладать как можно большей емкостью, чтобы отдельный ген был представлен в одном или в мининимальном числе клонированных фрагментов ДНК. Для этих целей не используются стандартные кольцевые многокопийпые векторы типа pUC19, поскольку их емкость ограничена величиной 10−20 тпн. В настоящее время наиболее часто применяются для создания библиотек геномной ДНК вектора двух типов — вектора замещения на основе фага лямбда и космидные вектора.

Для клонирования фрагментов ДНК с использованием векторов замещения применяется следующая стратегия. При расщеплении векторной ДНК соответствующей рестриктазой образуется три фрагмента: левое и правое плечи и центральный фрагмент. Плечи вектора содержат гены, которых достаточно для литического развития фага. Центральный фрагмент не содержит необходимых для этого генов, но он нужен для того, чтобы вектор имел длину, допускающую его упаковку в фаговую частицу. После разрезания вектора плечи отжигают, при этом они соединяются по cos — концам. Затем плечи отделяют от центрального фрагмента при помощи электрофореза или центрифугирования в градиенте сахарозы. Полученный препарат плечей вектора лигируют с предварительно фракционированной по размеру клонируемой ДНК в условиях, обеспечивающих преимущественно межмолекулярное лигирование. Полученные контактамерные рекомбинантные молекулы in vitro разрезаются терминазой фага лямбда по cos — сайтам и упаковываются в фаговые частицы, которыми затем заражают бактерии штамма — хозяина. Негативные колонии.

РОССИЙСКАЯ.

41 ГОСУДАРСТВЕННАЯ.

БИБЛИОТЕКА фаговые бляшки), образовавшиеся в результате лизиса зараженных бактерий, будут содержать рекомбинантные молекулы ДНК.

Емкость векторов замещения определяется размером центрального фрагмента и допустимыми вариациями в длине упаковываемой в фаговую частицу ДНК и составляет максимум 22 тпн. Как частный случай векторов замещения можно рассматривать вектора включения, в которых центральный фрагмент отсутствует. Эти вектора способны клонировать фрагменты ДНК размером от 0 до максимум 10 тпн и, как правило, используются для создания библиотек к-ДНК.

Важнейшим достоинством векторов замещения является высокая эффективность введения рекомбинантных молекул ДНК в клетки. Это достигается за счет того, что вместо обычной трансформации используется процесс упаковки in vitro. Эффективность упаковки in vitro достигает 109 бляшек на 1 мкг ДНК фага лямбда, что на несколько порядков выше чем эффективность трансфекции. Используя вектора замещения можно получить более чем 106 рекомбинантов на 1 мкг донорной ДНК.

Удобной модификацией векторов замещения являются фазмидные вектора, сочетающие в себе свойства плазмид и фагов. (Donaghue and Sharp, 1978; Yankovski et al., 1985). Помимо последовательностей левого и правого плечей вектора замещения фазмида содержит плазмидную последовательность, в результате чего вектор может поддерживаться как плазмида или как фаг. Один из фазмидных векторов описан в работе (Yankovski et al., 1989). Вектор pMYF131 представляет собой кольцевую плазмиду размером 33.3 тпн. Помимо всех генов и сайтов фага лямбда, необходимых для литического развития, он включает последовательность плазмиды pUC19. Вектор, не имеющий вставки, поддерживается как плазмида. При клонировании фрагмент ДНК лигируют с вектором, обработанным соответствующей рестриктазой, проводят реакцию упаковки in vitro и заражают клетки бактерии-хозяина. Размер вектора не допускает упаковку нерекомбинантной формы или олигомерных форм, клонируемые фрагменты должны иметь длину от 4.4 до 19.6 тпн. Вектор имеет температурночувствительный репрессор, что позволяет поддерживать рекомбинантные клоны в виде плазмид или фагов. Описанный фазмидный вектор был использован для создания геномных библиотек (Yankovski et al., 1985, 1989).

Поскольку емкость векторов замещения и фазмид невелика, в настоящее время для клонирования геномной ДНК используются космидные вектора, емкость которых составляет до 46 тпн. Клонирование в космидных векторах основано на том, что в головку фага лямбда может быть упакована любая ДНК подходящего размера, ограниченная двумя cos — сайтами с небольшими прилегающими участками.

Космидные вектора (Collins et al. 1978) представляют собой модифицированные плазмиды Е. coli, включающие cos — последовательность фага лямбда. Поскольку космидные вектора имеют плазмидный мини-репликон и ген устойчивости к антибиотику, они могут быть введены в Е .coli посредством обычной трансформации и поддерживаться как плазмиды. Почти все космиды основаны на мини-репликоне ColEl. Этот же репликоп имеют обычные клонирующие вектора — pBR322, pUC и др.

Для клонирования в космидном векторе его линеаризуют соответствующей рестриктазой и лигируют с фрагментами ДНК размером 35−45 тпн в условиях, обеспечивающих преимущественно межмолекулярное лигирование, что приводит к образованию длинных коикатамерных молекул ДНК. Полученные контактамеры являются субстратом в реакции упаковки in vitro. Cosсайты разрезаются терминазой фага лямбда и ДНК между двумя cos — сайтами упаковывается в фаговые частицы, которыми заражают клетки бактерии — хозяина. После инфекции линейные рекомбинантные молекулы замыкаются в кольцо по когезивным концам. Полученная кольцевая молекула представляет собой космидный вектор с клонированной вставкой и в дальнейшем реплицируется как обычная плазмида. Бактерии, содержащие рекомбинантные плазмиды, могут быть отобраны на среде с соответствующим антибиотиком.

Емкость космидных векторов определяется, во-первых, размером ДНК, которая может быть упакована в фаговую частицу (38 — 52 тпн.) и, во-вторых, размером самого вектора (обычно около 6 тпн.). Таким образом, в космидном векторе могут быть клонированы фрагменты ДНК размером от 32 до 46 тпн. Благодаря использованию для введения рекомбинантных молекул в клетки процесса упаковки in vitro, эффективность клонирования хотя и несколько ниже, чем для векторов замещения, но все же составляет до 106 клонов на 1 мкг клонируемой ДНК. По сравнению с векторами замещения недостаток космид состоит в том, что рекомбинантные космиды представляют собой низкокопийные плазмиды, что делает скрининг методом гибридизации ДНК для них менее эффективным.

Чтобы преодолеть недостатки космидных векторов был создан ряд различных систем для клонирования крупных фрагментов ДНК в E.coli. Это системы для клонирования на основе бактериофага Р1 и системы на основе F-фактора E.coli.

4.1.1 Клонирующие векторы, созданные на основе F-фактора Е. coli.

Природный F-фактор E. coli представляет собой кольцевую молекулу ДНК размером 94,5 kb, которая может либо реплицироваться автономно, либо встраиваться в хромосому бактерии. F-фактор является однокопийной плазмидой, стабильно наследующейся при делении клеток. Стабильность плазмиды обеспечивается за счет правильного распределения плазмид между дочерними клетками при делении.

В области генома F-плазмиды с координатами 40−50kb располагаются гены и сайты, ответственные за репликацию и распределение молекул плазмидной ДНК между дочерними клетками. Эта область, вычлененная из ДНК F-плазмиды, сохраняет репликативные свойства и свойство несовместимости исходной плазмиды, поэтому ее назвали мини-Р-плазмидой. В ней имеется два ori-сайта. В норме с ori I инициируется двунаправленная репликация, но если его делетировать, то с ori IIсайта обеспечивается однонаправленная репликация. Рядом с этими сайтами располагаются ген герЕ, продукт которого необходим для репликации, а также локусы incB и incC, контролирующие репликацию. Распределение плазмиды между клетками контролируется областью sop.

Рисунок 14. Карта вектора pBeloBACl 1.

Стабильность F-фактора и его способность реплицировать фрагменты ДНК размером до 1500kb послужили стимулом для создания векторов на основе его репликона (ВАСвекторы).

Один из таких векторов описан в работе (Kim et al., 1996). Вектор pBeloBACl 1 получен па основе мини-Р-плазмиды и представляет собой кольцевую молекулу ДНК размером 7.5 тпн (рис.14). Помимо генов F-фактора, вектор имеет ген устойчивости к хлорамфениколу Cm, позволяющий отбирать трансформанты, и полилинкер с клонирующими сайтами. ВАС-векторы способны стабильно поддерживать вставки размером до 300kb (Shizuya et а., 1992). В работе (Kim et al., 1996) авторы использовали этот вектор для получения полной библиотеки геномной ДНК человека.

4.1.2 Клонирующие векторы, созданные на основе бактериофага Р1.

Бактериофаг Р1 — умеренный бакетериофаг E. coli, в отличие от большинства других бактериофагов в лизогенном состоянии он не встраивается в бактериальную хромосому, а представляет собой автономно реплицирующуюся кольцевую плазмиду (Sternberg and Hoess, 1983). Плазмида PI низкокопийная, стабильно наследуемая.

Поскольку, в отличии от F-фактора, Р1 является умеренным фагом, то имеется возможность создать систему для упаковки in vitro, аналогичную системе для космидных векторов, но с большей емкостью, т.к. размер ДНК фага Р1 составляет около 110 тпн (у фага лямбда — 48 тпн). Создание и характеристика такой системы для клонирования на основе фага Р1 описано в работе (Sternberg, 1990). У фага Р1 процесс упаковки ДНК в фаговую частицу начинается с того, что фермент паказа узнает и разрезает сайт рас в фаговой ДНК. ДНК с одной стороны от разрыва начинает упаковываться в пустую фаговую головку. Как только головка будет заполнена, паказа вносит второй разрыв, отделяющий ДНК в головке от остальной. Этот разрыв не является сайт-специфическим. Затем к заполненным головкам присоединяются хвостики, завершая процесс сборки фаговой частицы.

В описываемой автором упаковочной реакции in vitro на первой стадии рас-сайт векторной ДНК разрезается экстрактом, содержащим паказу. На второй стадии к полученной ДНК добавляют экстракт с головками и хвостиками фаговых частиц и процесс упаковки завершается. Полученными фагами заражают бактерии штамма E. coli, экспрессирующего Сге-рекомбиназу фага Р1, трансформанты отбирают на агаре с канамицином. Сге-рекомбиназа вызывает сайт-специфическую рекомбинацию между двумя loxP — сайтами, приводя к образованию кольцевой плазмидной молекулы.

Максимальная емкость вектора составляет около lOOkb, причем она обусловлена емкостью головки фага Р1.

Использованная автором система упаковки Р1 в одном важном отношении существенно отличается от систем для упаковки фага лямбда. Если у фага лямбда в головку может упаковаться только одна непрерывная молекула ДНК, обязательно ограниченная cos — сайтами, то в головку фага PI могут упаковываться фрагменты ДНК размера много меньше, чем максимальная емкость фаговой частицы. Вследствие этого возникает проблема, связанная с упаковкой в одну частицу молекул ДНК, образованых из нескольких небольших вставок и молекул вектора. Это может привести к образованию значительного количества химерных конструкций. Эта же проблема возникла при разработке аналогичной упаковочной системы еще большей емкости на основе фага Т4 (Rao et al., 1992).

Альтернативной системой для клонирования на основе бактериофага PI являются РАС-векторы, представляющие собой мини-Р1 плазмиды (loannou et al., 1994). Как и в случае плазмиды F, изолированный фрагмент ДНК фага Р1 содержит все функции, необходимые для репликации и стабильного наследования. Пример такого вектора показан на Рис. 15. Вектор pZC175 содержит репликационный ген герА, область par, обеспечивающую стабильное наследование плазмиды (гены рагА, рагВ и центромерный сайт parS), а также ген устойчивости к ампициллину (Ыа). Подобные векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК размером до 500 тпн.

Рисунок 15. Карта РАС-вектора pZC 175.

4.1.3 Проблемы, возникающие при клонировании фрагментов ДНК, содержащих инвертированные повторы.

В геноме прокариот и, особенно, эукариотических организмов, достаточно часто встречаются участки ДНК с особенностями вторичной структуры. Так, в геноме человека в среднем один раз на 40 тпн встречается участок ДНК, потенциально способный формировать «крестообразную» структуру. Предполагается, что подобные аномальные районы ДНК могут иметь функциональное значение [Schroth and Но, 1995].

Клонирование последовательностей ДНК, содержащих прямые и особенно инвертированные повторы, представляет собой определенную проблему. Если для успешного клонирования прямых повторов достаточно подавить рекомбинацию, что может быть достигнуто использованием дефектных по рекомбинации штаммов, то ситуация с инвертированными повторами намного сложнее. Если два инвертированных повтора разделены какой-либо последовательностью или не являются полностью идентичными, то говорят о неидеальном палиндроме, при отсутствии такой последовательности и идентичности повторов палиндром является идеальным. Практически идеальные палиндромы длиной более 30 нуклеотидов не удается клонировать. Так, частота делеций при увеличении длины идеального палиндрома от 22 до 90 нуклеотидов возрастает в тысячи раз [Das Gupta et al., 1987; Weston-Hafer and Berg, 1991].

В дальнейшем будет идти речь только о неидеальных палиндромах (Рис. 16). Палиндром in vitro, а возможно и in vivo, может образовывать так называемую крестообразную структуру, состоящую из петли (область центральной асимметрии) и стебля. Уже в ранних работах было установлено, что стабильность палиндрома в Escherichia coli зависит от трех факторов: 1) природы палиндрома — его длины, величины участка центральной асимметрии, последовательности нуклеотидов- 2) генотипа штамма Е. coli и 3) типа репликона, в котором локализован палиндром [Sinden, 1994; Leach et al., 1987].

В общем, по мере увеличения длины ствола и уменьшения длины петли стабильность палиндрома падает [Chalker et al., 1993; Sinden et al., 1991]. Поскольку даже крупные палиндромы (4200 + 4200 нуклеотидов) сохраняются в нереплицирующейся ДНК и теряются только при репликации, считается, что формирование in vivo крестообразной структуры является главной причиной нестабильности палиндромов (Sinden, 1994; Shurvinton et al., 1987). Эти структуры затем разрушаются SbcCD нуклеазой (Connelly et al., 1998; Cromie et al., 2000).

Образование палиндромом крестообразной структуры в двунитевой ДНК является, в принципе, энергетически невыгодным процессом из-за наличия неспаренных нуклеотидов в концевых шпильках и основании палиндрома. Однако такой переход может оказаться энергетически выгодным в условиях сверхспирализации, поскольку образование палиндрома уменьшает число сверхвитков и, тем самым, понижает свободную энергию молекулы.

Известный специалист по структуре ДНК Ричард Шинден в обзоре (Sinden, 1994) делает заключение, что «кресты могут образовываться в сверхспирализованной, но не в линейной или релаксированной ДНК» .

Рисунок 16. Схема формирования крестообразной структуры палиндромом. Одинаковые последовательности показаны жирными стрелками.

Предпринято много попыток подобрать мутантные штаммы Е. coli, в которых палиндромы были бы стабильными, однако это дает лишь частичный результат, поскольку такие мутации влияют на размножение векторов на основе фага лямбда, обычно используемых для клонирования относительно крупных фрагментов эукариотической ДНК [Chalker et al., 1987; Gibson et al., 1992; Doherty et палиндром al., 1993].

В исследованиях, о которых шла речь, палиндромы клонировались в векторах на основе репликона плазмид типа pUC или фага лямбда. В обоих случаях вектор или имеет всегда кольцевую форму, или проходит стадию кольцевой ДНК в процессе репликации. Между тем установлено, что суперскрученность резко увеличивает вероятность формирования крестообразной формы [Courey and Wang 1988].

Другой причиной делетирования палиндромных последовательностей (SbcCD независимый путь) является образование крестообразной структуры находящимся в однонитевом состоянии палиндромом в ходе репликации отстающей цепи (Pinder et al., 1998; Leach, 1994, Bzymek and Lovett, 2001).

Таким образом, можно сделать заключение, что последовательности, включающие инвертированные повторы, могут быть нестабильны при их клонировании в обычных кольцевых векторах. Эта нестабильность связана с образованием палиндромами крестообразной структуры в условиях сверхспирализации. В то же время в геномной ДНК прои особенно эукариот последовательности, включающие инвертированные повторы, встречаются достаточно часто. Поэтому представляется целесообразным создание линейных клонирующих векторов, не имеющих сверхспирализованных форм. Такие векторы могут быть иметь преимущества по сравнению с обычными кольцевыми векторами при клонировании палиндромов и крупных фрагментов геномной ДНК, которые могут их содержать.

выводы.

1. Определена полная структу ра генома бактериофага N15 (46 375 нт). Геном включает блок генов, кодирующих структурные белки вириоиа, которые высоко гомологичны соответствующим генам лямбдоидных фагов, и несколько блоков генов, присутствие которых связано с тем, что профаг N15 является линейной плазмидой с ковалентно замкнутыми теломерами. Это ген протеломеразы (фермент, образующий ковалентно замкнутые теломеры), оперон, включающий гены антирепрессора, репликационный оперон, sop-oncpoH, обеспечивающий стабильное наследование плазмидного профага. Контрольный модуль в составе гена основного репрессора сВ, генов его и Q, гомологичных соответствующим генам лямбдоидных фагов, регулирует экспрессию репликационного оперопа и позднего оперопа, включающего гены лизиса и гены структу рных белков вириона.

2. Идентифицированы гены антирепрессора N15 и показано, что их экспрессия контролируется короткой регуляторной РНК, образующейся в результате процессинга лидерной части транскрипта. Показано, что выбор между литическим и лизогенным путем развития зависит от соотношения рспрсссор-антирснрессор на ранней стадии инфекции.

3. Стабильное наследование плазмидного профага N15 обеспечивается за счет правильного распределения реплицированных молекул между дочерними клетками при делении. Установлено, что эта функция обеспечивается генами яо/^-оперона (геи 28= sopA и ген 27=sopB) и четырьмя центромерными сайтами, расположенными в различных районах генома N15. Показано, что Sop белки N15 и F-фактора функционально частично взаимозамспимы. Идентифицированы функциональные домены Sop белков N15 и плазмиды F.

4. Функционирование механизма стабильного наследования линейных репликонов требует, в отличие от кольцевых плазмид, наличия множественных центромерных сайтов, расположенных в различных районах генома.

5. Продукт фагового гена 29 является ферментом, образующим ковалентно замкнутые теломеры в ходе репликации линейного плазмидного профага (протеломеразой). Показано, что протеломераза завершает репликацию линейного плазмидного профага, разрезая дунлицированные теломерыотсутствие протеломеразы приводит к накоплению кольцевых димерных молекул.

6. Протеломераза и сайт ее действия представляют собой независимую функциональную единицу, способную, при клонировании ее в кольцевых плзмидах, преобразовывать их в линейные плазмиды с ковалентно замкнутыми теломерами.

7. Минимальный репликон N15 включает один ген, герА, в пределах которого находится точка инициации репликации. Установлено, что обеспечиваемая RepA репликация ДНК N15 является двунаправленной.

8. Экспериментально доказана модель репликации ДНК линейного плазмидпого профага N15. Согласно этой модели двунаправленная репликация инициируется с о/7-сайта, расположенного несимметрично относительно центра молекулы, в пределах гена rep А. После дупликации левого тсломерного сайта протеломераза разрезает его, образуя шпилечные концы. Таким образом формируется Y-подобная структура. После репликации правой теломеры и последующего процсссипга образуются две линейные молекулы. Это первая экспериментально доказанная модель репликации линейной ДНК с ковалентно замкнутыми теломерами для прокариот.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Равин Н. В., Равин В. К. (1994) Сверхконийная плазмида на основе мини-репликона умеренного бактериофага. Молекулярная Генетика, Микробиология и Вирусология, 1, 37−39.

2. Равин П. В., Страхова Т. С., Равин В. К. (1996) Создание и анализ библиотеки геномной ДНК человека в линейном сверхкопийном векторе. Тезисы материалов конференции «Геном человека-96», с. 15, Москва, 1996.

3. Равин Н. В., Равин В. К. (1998) Клонирование крупных нсидсальиых палиндромов в кольцевом и линейном векторах. Генетика, 34(1), 38−44.

4. Равин 11.В., Дорошенко О. И., Равин В. К. (1998) COS-райои умеренного бактериофага N15. Молекулярнт Генетика, Микробиология и Вирусология, 2, 17−20.

5. Равин Н. В., Дорошенко О. И., Страхова Т. С., Равин В. К. (1998) Анализ последовательностей ДНК генома человека, подавляющих репликацию кольцевых векторов. Тезисы материалов конференции «Геном человека-98», с.28−29. Москва, 1998.

6. S. Casjcns, R. Hendrix, N. Ravin, M. Ford, V.Ravin. (1998) General description and sequence of temperate bacteriophage N15. Abstracts of The 6th international workshop on P2, P4 and related bacteriophages, p.20−21, Berlin, Germany, 1998.

7. Ravin, N, Lane, D. (1998) Partitioning of the linear plasmid N15: functional intcrchangeability with the sop partitioning functions of the F plasmid. Abstracts of The 6th international workshop on P2, P4 and related bacteriophages, p.20−21, Berlin, Germany, 1998.

8. Ravin N.V., Ravin V.K. (1999) Use of a linear multicopy vector based on the mini-replicon of temperate coliphage N15 for cloning DNA with abnormal secondary structures. Nucleic Acids Research, 27, eI3.

9. Ravin N., Svarchevsky, A., Deho G. (1999) The antiimunity system of phage-plasmid N15: identification of the antirepressor gene and its control by a small processed RNA. Molecular Microbiology, 34, 980−994.

10. Ravin N., Lane D. (1999) Partition of the linear plasmid, N15: functional interactions with the sop locus of the F plasmid. Journal of Bacteriology, 181, 6898−6906.

11. Ravin, V., Ravin, N., Casjens. S., Ford, M., Hatfull, G., Hendrix, R. (2000). Gcnomic scqucnce and analysis of the atypical bacteriophage N15. Journal of Molecular Biology, 299,53−73.

12. Ravin, N.V., Strakhova, T.S., Kuprianov, V.V. (2001) The protelomerase of the phage-plasmid N15 is responsible for its maintenance in linear form. Journal of Molecular Biology, 312, 899−906.

13. N.V. Ravin, V.V.Kuprianov, T.S.Strakhova. (2001) Replication mechanisms of linear DNA with covalcntly closcd ends: the phage N15 model. Abstracts of the 7th International workshop on P2, P4 and related bacteriophages, p. 26−27, Sigtuna, Sweden.

14. N.V. Ravin, D. Lane. (2001) Functional domain in bacterial plasmid partition proteins. Abstracts of The International Symposium «Molecular mechanisms of genetic processes and biotechnology», p. 122−123, Moscow.

15. H.B. Равин, T.C. Страхова, В. В. Куприянов. (2001) Теломсраза фага N15 обеспечивает его репликацию в виде линейной плазмидной молекулы с ковалентно замкнутыми концами. Тезисы Международного Симпозиума «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология», с. 135−136, Москва, 2001.

16. N.V.Ravin, V.V.Kuprianov (2002) Replication mechanisms of linear DNA with covalcntly closed ends: the N15 virus model. Abstracts of the Xllth International Congress of Virology, Paris, France.

17. J-Y. Bouct, V. Libantc, M. Bouvicr, N. Ravin, D. Lane. (2003) On bacterial mitosis: the mechanism of F plasmid partition. Abstracts of EMBO workshop on Rcplicon Theory. Villefranche-sur-mer, France.

18. Дорохов Б. Д., Страхова T.C., Равин H.B. (2003) Протеломераза фага N15 защищает линейную ДНК с ковалентно замкнутыми концами от деградации в клетках Escherichia coli. Тезисы Второго Международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», с. 20. Москва.

19. Ravin, N.V. (2003) Mechanisms of replication and telomere resolution of the linear plasmid prophage N15. FEMS Microbiology Letters, 221 (1), 1−6.

20. Ravin, N.V., Rech, J., & Lane, D. (2003). Mapping of functional domains in F plasmid partition proteins reveals a bipartite SopB-recognition domain in SopA. Journal of Molecular Biology, 329, 875−889.

21. Dorokhov, B.D., Lane, D., Ravin, N.V. (2003) Partition operon expression in the linear plasmid prophage N15 is controlled by both Sop proteins and protelomerase. Molecular Microbiology, 50, 713−721.

22. Ravin, N.V., Kuprianov, V.V., Gilcrease, E.B., Casjcns, S.R. (2003) Bidirectional replication from an interna! ori site of the linear N15 plasmid prophage. Nucleic Acids Research, 31, 6552−6560.

23. Равин H.B., Дорохов Б. Д., Lane D. (2004) Структурная организация и контроль экспрессии sop оперона линейного плазмидного профага N15. Молекулярная Биология, 2, 297−302.

24. Дорохов Б. Д., Страхова Т. С., Равин Н. В. (2004) Регуляция экспрессии гена протеломеразы бактериофага N15. Молекулярная Генетика, Микробиология и Вирусология, 2, 28−32.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Различные модели репликации линейной ДНК с ковалентно замкнутыми теломерами, предложенные на протяжении последних 30 лет (Bateman, 1975, Casjens, 1999), суммированы на Рис. 86. О.

Vo^hohитевои раз застройка конца одной итевой разрыв и.

1 перестройка теломеры о репликация по механизму /-V вытеснения цепи О завершение репликации.

5) несколько циклов репликации.

Рисунок 86. Возможные модели репликации ДНК с ковалснтно-замкнутыми теломерами.

Согласно первому механизму двунаправленная репликация, инициированная с ori-сайта, расположенного в центральной части молекулы, приводит к образованию кольцевого димера. Вторая стратегия предполагает разрезание теломер и образование кольцевого мономера, который реплицируется как кольцевой репликон. В обоих случаях дочерние линейные молекулы образуются в результате разрезания дуплицированных теломер специальным ферментом. Третья стратегия предполагает внесение однонитевых разрывов в одной (показано на рисунке) или обеих теломерах, за которым следует застройка однонитевых участков ДНК-полимеразой, перестройка теломер, и репликация по механизму вытеснения цепи (strand-displacement). Заключительным этапом является разрезание дуплицированных теломер с образованием дочерних линейных молекул. Представленные стратегии репликации не являются взаимоисключающими, например, стратегия 1 может быть использована для репликации основной части ДНК, а стратегия типа 3, — для репликации теломер (Casjens, 1999).

Описанные выше модели различаются несколькими принципиальными позициями: (1) положение ori-сайта: внутри молекулы или в районе теломер, (2) направленность репликации и ее механизм: одноили двунаправленная, 0- механизм или другой, (3) свойства фермента, образующего теломеры и структура интермедиата, который он процсссируст: кольцевой мономер, кольцевой димер или линейная молекула.

Полученные в настоящей работе результаты позволяют сделать однозначный вывод о том, что принципиапьпо репликация ДНК профага N15 следует первой из описанных моделей. Во-первых, точка начала репликации N15 находится в пределах гена герА, т. е. во внутренней части молекулы. Во-вторых, репликация является двунаправленной, а установленные свойства свойства репликациоиного белка RepA согласуются с 0 — механизмом репликации. В-третьих, идентифицирован фермент, образующий ковалеитно-замкиутые теломеры в ходе репликации профага N15 (протеломераза) и показано, что отсутствие протеломеразы приводит к накоплению интермедиатов, имеющих структуру кольцевых димеров. Наконец, прямой анализ структуры реплицирующихся молекул методом электронной микроскопии подтвердил сделанный вывод.

Более подробная модель репликации ДНК N15 представлена на Рис 87. Единственным существенным отличием от схемы, представленной выше, является то, что процессииг одной из теломер (вероятно, левой) протеломеразой предшествует полной репликации молекулы и образованию кольцевого димера (путь А). Эта модель может быть расширена и для объяснения механизма репликации ДНК N15 в ходе литического развития (путь В).

Возможно, что па определенной стадии литического развития полная репликация молекулы завершается до разрезания теломер, в результате чего образуется полный кольцевой димер, альтернативный процессииг теломер в котором может (за счет модификации протеломеразы и/или сайта разрезания) приводить к образованию двух кольцевых мономеров вместо двух линейных плазмид (Рис. 87 В). Альтернативным вариантом является обратная относительно процесса образования теломер реакция, т. е. непосредственное образование кольцевой мономериой молекулы из линейной (Рис. 87 В1). Первый вариант представляется более вероятным, поскольку проведенный в этой работе анализ структур ДНК, образующихся в ходе репликации ДНК N15 в процессе литического развития, показал, что образованию кольцевого мономера предшествует появление кольцевых димерных молекул. Репликация образовавшегося кольцевого мономера может следовать сигма-механизму с последующим образованием линейных конкатамеров, которые могут затем разрезаться по cos сайтам и упаковываться в фаговые частицы. линеиная плазмида поздняя репликация, а — типа, аналогично случаю фага лямбда telRL фаговая ДНК.

Рисунок 87. Модель репликации ДНК N15.

A) — репликация линейной плазмиды.

B) — возможный механизм репликации ДНК N15 в ходе литического развития.

Репликация других прокариотических ДНК, имеющих ковалентно-замкнутые теломеры, вероятно, следует модели, подтвержденной в настоящей работе для профага N15.

Гомологи протеломеразы N15 имеются в геномах всех описанных прокариотических репликонов такого типа: это ген ВВВ03 в Borrelia burgdorferi, AgrC4584 в Agrobacterium tumefaciens, гены протеломераз линейных фагов-плазмид фК02 и PY54. Образование шпилечных теломер продуктами генов ВВВ03, а также протеломераз фК02 и PY54, было продемонстрировано in vitro (Kobryn and Chaconas, 2002; 1 luang et al, 2004; Hertwig et al., 2003), а в случае TelK (фК02) также и in vivo.

Репликация линейных плазмид и хромосом В. burgdorferi инициируется с ori-сайтов, расположенных в центре молекул и является двунаправленной (Picardeau et al, 1999). Было показано (Chaconas et а!., 2001), что сиитетическая последовательность, имеющая структуру дуплицированной теломеры, разрезается in vivo и обеспечивает преобразование кольцевой молекулы в линейную. Предполагается (Chaconas et al., 2001), что репликация линейных плазмид Borrelia включает стадию образования кольцевого димера, разрезаемого продуктом гена ВВВОЗ.

Репликация фагов-плазмид фК02 и pY54, вероятно, также инициируется с внутреннего оп-сайта. расположенного в пределах их гомологов гена repA N15. В пользу этого свидетельствует как высокая гомология repA генов, так и сохранение структуры ori сайтов (глава 9).

В то же время описанная выше модель репликации прокариотических ДНК с ковалентно замкнутыми теломерами отличается от модели, используемой эукариотическими организмами с аналогичной структурой ДНК (поксвирусы, иридопоксвирусы, вирусы Chlorella, и др.). В частности, предполагается, что репликация поксвирусов инициируется в районе теломер, следует механизму вытеснения цепи, в результате чего образуются линейные конкатамеры, процессируемые неизвестным в настоящее время ферментом с образованием линейных мономеров (De Masi et al., 2001). Помимо этого, геномы поксвирусов не содержат явных гомологов протеломераз.

Эти данные свидетельствуют в пользу независимого эволюционного происхождения прокариотических и эукариотических репликонов с ковалентно замкнутыми теломерами, а не выдвинутой ранее (Hinncbusch and Barbour, 1991; Hinnebusch and Tilly, 1993) гипотезы о переносе генов протеломераз от эукариот (иридопоксвирусы) к прокариотам (Borrelia) или наоборот.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор выражает глубокую благодарность за разнообразную помощь в выполнении работы своим коллегам: Jean-Yves Bouet, Sherwood Casjens, Giovanni Dcho, David Lane Erich Lanka, Б. Д. Дорохову, Л. А. Замчук, Б. Б. Кузнецову, В. В. Куприянову, А. В. Марданову, Т. С. Страховой, и веем другим, кто помогал в работе.

В.К. Равину, В.II. Рыбчину, А.II. Сварчевскому, К. Г. Скрябину, М. А. Эльдарову, Н. К. Янковскому, — за плодотворные научные дискуссии,.

Д.В. Мухе, Gregory Phillips, Wai-Mun Huang, Walter Messer — за предоставленные препараты ДНК, бактериальные штаммы и плазмиды.