Структурная организация функционально активных комплексов РНК полимеразы E. coli с факторами транскрипции GreA и GreB.
Идентификация и анализ промоторных мишеней для GreA E. coli и Gfh1 T. thermophilus

ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Содержание

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
- 1. 1. Бактериальная ДНК-зависимая РНКП
  - 1. 1. 1. Субъединичный состав и функции РНКП
  - 1. 1. 2. Каталитические активности РНКП
  - 1. 1. 3. Транскрипционный цикл
  - 1. 1. 4. Структура РНКП (кор- и холо-ферменты, бинарный и элонгационный комплексы)
  - 1. 1. 5. Каталитический центр и подвижные элементы вторичного канала РНКП (G-петля, F-мостик, jaw-домен)
- 1. 2. Бактериальные транскрипционные факторы, модулирующие активность РНКП через вторичный канал
  - 1. 2. 1. Общие сведения о функциях и биологическая роль
  - 1. 2. 2. Структуры
  - 1. 2. 3. Механизм действия
  - 1. 2. 4. Модели комплексов с РНКП
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
- 2. 1. Материалы и реагенты
- 2. 2. Методы
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
- 3. 1. Детальный анализ взаимодействия Gre-факторов с РНКП и механизма их действия
  - 3. 1. 1. Картирование пространственного расположения Gre-белков в РНКП
  - 3. 1. 2. Определение пространственного расположения неконсервативного регуляторного домена G-петли относительно элементов РНКП и ДНК в элонгационном комплексе
  - 3. 1. 3. Определение положения консервативной части G-петли во вторичном канале необходимого для связывания Gre-белков с РНКП
  - 3. 1. 4. Альтернативные положения Gre-белков во вторичном канале РНКП
  - 3. 1. 5. Моделирование структуры комплекса Gre-РНКП
- 3. 2. Роль расщепляющей активности GreA в стимуляции транскрипции на ряде промоторов Е. col
  - 3. 2. 1. Анализ эффекта GreA на образование полноразмерного РНК-продукта на промоторах выбранных по данным экспрессионного анализа на микроматрицах! А
  - 3. 2. 2. Анализ расщепляющей активности GreA на абортивный синтез РНК
- 3. 3. Определение функциональной мишени для действия Gre-подобного ингибитора транскрипции — Gfhl из Thermus thermophilus
  - 3. 3. 1. Анализ активности Gfhl на ряде промоторов Thermus thermophilus in vitro
  - 3. 3. 2. Анализ эффекта Gfhl на Км для НТФ при инициации и элонгации транскрипции
ВЫВОДЫ

Структурная организация функционально активных комплексов РНК полимеразы E. coli с факторами транскрипции GreA и GreB. Идентификация и анализ промоторных мишеней для GreA E. coli и Gfh1 T. thermophilus (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Актуальность проблемы. Транскрипция генов является первым этапом реализации генетической информации у всех живых организмов. Ключевыми ферментами, катализирующими этот процесс в эукариотических и прокариотических клетках, являются многосубъединичные ДНК-зависимые РНК-полимеразы (РНКП), осуществляющие комплементарный синтез РНК-транскрипта на ДНК-матрице [1, 2]. Многосубъединичные РНКП ответственны за синтез практически всех клеточных РНК. Их аминокислотные последовательности содержат большое число консервативных областей, а данные кристаллографических исследований демонстрируют сходство пространственной организации. Более простое строение бактериальных РНКП (6 субъединиц) по сравнению с эукариотическими, содержащими до 17 субъединиц (РНКП III), делает их прекрасной моделью для изучения клеточных РНКП в целом. Все оии используют общий механизм катализа (нуклеофильное замещение), основанный на присутствии двух ионов Mg2+ в активном центре ферментадостигают высокой процессивности в фазе элонгации, формируя РНК-ДНК гибрид одинаковой длиныимеют сходство в механизмах процессов инициации, элонгации и терминации синтеза РНК.

Процессивность РНКП во многом связана с ее способностью образовывать прочную связь как с транскрибируемой ДНК, так и с растущей цепью РНК. Однако, несмотря на эту особенность, в процессе удлиннения транскрипта РНКП движется по ДНК-матрице с непостоянной скоростью, с паузами различной продолжительности, способными привести к транскрипционному аресту — конформационному состоянию, при котором процесс удлиннения РНК становится невозможен несмотря на целостность ЭК [3]. Как паузы, так и аресты возникают в результате смещения РНКП на одну из внутренних фосфодиэфирных связей РНК, что приводит к разрыву связи между ее Ъ" -концевым нуклеотидом и активным центром РНКП (комплекс в этом случае называется «откатившимся») [4, 5].

Таким образом, сложность транскрипции и необходимость ее координации для множества генов во время клеточного роста и в ответ на различные изменения внешней среды в бактериальных клетках требует строгого контроля активности РНКП. Принято считать, что основная регуляция этого процесса осуществляется ДНК-связывающими белками на стадии взаимодействия РНКП с промотором и инициации синтеза РНК. Однако существует еще один класс регуляторов — белковые факторы, взаимодействующие с РНКП в области ее вторичного канала и непосредственно влияющие на процесс катализа. В эту группу входят белки семейств Gre (GreA, GreB и Gfhl), DksA (DksA, TraR) и Rnk, которые обладают структурной гомологией, но сильно различаются функционально.

Gre-подобные белки, для которых накоплен большой объем генетических и биохимических данных, являются прекрасными моделями для изучения регуляции транскрипции через вторичный канал РНКП. В экспериментах in vitro Gre-белки стимулируют синтез РНК за счет (1) ускорения перехода от инициации к элонгации, (2) предотвращения образования пауз транскрипции и арестованных комплексов, (3) повышения точности транскрипции. Действие Gre-белков основано на индукции и модуляции собственной транскриптрасщепляющей активности РНКП [1]. Для более полного понимания их биологической роли требуется выяснить, какие из выявленных in vitro эффектов, имеют физиологическое значение, а также определить этапы транскрипции, на которых эти эффекты наиболее выражены. В то же время, Gfhl из Thermus thermophilus, являясь антагонистом GreA и GreB, ингибирует все активности РНКП. Его биологическая роль пока мало понятна. Предполагается, что Gfhl может специфично ингибировать синтез РНК в определенных условиях ее жизни [2].

В настоящее время структуры высокого разрешения комплексов бактериальных РНКП с факторами вторичного канала не описаны. Существует только несколько спорных моделей, созданых на основании криоэлектронных структур низкого разрешения и биохимических данных с использованием мутантных форм Gre-белков [3−5]. Отсутствие детальных структурных данных затрудняет понимание молекулярных механизмов, определяющих взаимодействие этих факторов с компонентами вторичного канала РНКП, а возможные функционально-активные состояния их комплексов с РНКП остаются неизученными. Для создания целостной картины регуляции активности РНКП Gre-подобными белками необходимо получить как можно более детальную структурную модель комплексов РНКП-Gre, учитывающую их конформационные изменения на различных стадиях цикла транскрипции.

Цели и основные задачи исследования. Целью работы являлось определение структурно-функциональной организации комплексов бактериальной РНКП с факторами транскрипции GreA и GreB Е. coli, а также изучение функциональной роли GreA Е. coli и Gre-подобного транскрипционного ингибитора Gfhl из Thermus thermophilus на разных этапах транскрипции.

В работе были поставлены следующие задачи:

1) картировать и исследовать расположение Gre-белков в комплексах с РНКП;

2) определить пространственное расположение регуляторного домена — G-петли Р'-субъединицы РНКП относительно Gre-белка, ДНК и элементов вторичного канала РНКП в элонгационном комплексе, а также изучить роль конформации этого домена в связывании Gre-белков с ферментом и их функциональной активности;

3) создать детальную модель комплекса Gre-белков с РНКП;

4) исследовать роль транскрипт-расщепляющей активности GreA в стимуляции транскрипции, инициированной с разных промоторов Е. coli;

5) определить этап транскрипции, на котором действует Gre-подобный транскрипционный ингибитор Gfhl из термофильной бактерии Т. thermophilus.

Научная новизна. Впервые предложена структурная модель комплекса РНКП-Gre, которая описывает расположение Gre-белков и G-петли относительно структурных модулей РНКП,.

ДНК и Gre-белков в элонгационном комплексе и учитывает возможные функциональные 5 состояния Gre-белков. Впервые продемонстрирована необходимость расщепляющей активности GreA для стимуляции транскрипции, инициированной с пяти промоторов Е. coli. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что GreA активирует переход абортивного комплекса к продуктивному синтезу РНК. Впервые установлен промотор-специфичный ингибирующий эффект Gre-подобного фактора транскрипции Gfhl, который наиболее выражен на стадии абортивного синтеза и обусловлен прямой конкуренцией Gfhl с НТФ.

Научно-практическая ценность. Предложенная в данной работе структурно-функциональная модель РНКП-Gre позволяет понять важнейшие аспекты регуляции транскрипции и открывает ряд возможностей для дизайна новых эффективных регуляторов транскрипции и антибиотиков, мишенью которых, также как и для Gre, могут стать подвижные структурные элементы активного центра фермента. Описанная модель вносит определенную ясность в понимание механизма передачи регуляторных сигналов, обеспечивающих фактор-зависимую регуляцию активности РНКП. Обнаружение стадии транскрипции, на которой действуют факторы вторичного канала РНКП — GreA Е. coli и Gfhl Т. thermophilus — позволяет предположить, что биологическая роль GreA заключается в повышении общего уровня синтеза РНК за счет уменьшения количества абортивных продуктов. Согласно полученным данным, Gfhl должен ингибировать синтез РНК в клетке, преимущественно действуя на транскрипционные комплексы, которым для начала синтеза РНК необходимы высокие концентрации субстратов. Такая регуляция может быть востребована для адаптации аппарата транскрипции клетки к изменяющемуся уровню источников питания.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международной конференции International Е. coli alliance (Hinxton, UK, 2008), конференции UMDNJ Biomedical Sciences Conference (Stratford, NJ, USA, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 печатных работ, из них 2 статьи и 4 тезиса стендовых сообщений на конференциях.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

выводы.

1) С помощью адресной модификации Gre-белков и ДНК химической протеазой FeBABE определена локализация GreA и GreB во вторичном канале РНК полимеразы Е. coli.

2) С использованием мутантных производных РНК полимеразы с G-петлей, фиксированной в двух альтернативных положениях, показано, что для связывания GreA необходима ее «открытая» конформация. «Закрытая» конформация G-петли препятствует связыванию регулятора во вторичном канале фермента.

3) Показано изменение положения Gre-белков во вторичном канале РНК полимеразы в процессе функциональной активности фермента. Предложена модель конформационной динамики Gre-белков с участием P’GNCD, согласно которой, для гидролиза РНК каталитическая петля N-концевого домена GreA располагается в каталитическом центре РНК полимеразы, а во время синтеза РНК она от него удалена.

4) В элонгационном комплексе охарактеризовано расположение неконсервативного регуляторного домена G-петли (P'GNCD) РНК полимеразы относительно Gre-белка и выходящей из главного канала ДНК. На основании полученных данных построена детальная модель комплекса Gre-PHK-полимераза.

5) Для генов пяти оперонов, позитивно регулируемых GreA in vivo, установлено, что в процессе инициации транскрипции стимулирующий эффект на разных промоторах реализуется с разной степенью эффективности, причем для активации синтеза РНК необходима расщепляющая активность GreA.

6) Показано, что ингибирующий эффект регулятора транскрипции Gfhl из Т. thermophilus дифференцированным образом проявляется на разных промоторах и зависит от сродства транскрипционного комплекса к субстратам на стадии абортивной инициации.

Показать весь текст

Список литературы

Borukhov, S., J. Lee, and O. Laptenko, Bacterial transcription elongation factors: new insights into molecular mechanism of action. Mol Microbiol, 2005. 55(5): p. 1315−24.
Laptenko, O., et al., pH-dependent conformational switch activates the inhibitor of transcription elongation. Embo J, 2006. 25(10): p. 2131−41.
Opalka, N., et al., Structure and function of the transcription elongation factor GreB bound to bacterial RNA polymerase. Cell, 2003. 114(3): p. 335−45.
Sosunova, E., et al., Donation of catalytic residues to RNA polymerase active center by transcription factor Gre. Proc Natl Acad Sci USA, 2003. 100(26): p. 15 469−74.
Laptenko, O., et al., Transcript cleavage factors GreA and GreB act as transient catalytic components of RNA polymerase. Embo J, 2003. 22(23): p. 6322−34.
Zhang, G., et al., Crystal structure ofThermus aquaticus core RNA polymerase at 3.3 A resolution. Cell, 1999. 98(6): p. 811−24.
Gross, C.A., et al., The functional and regulatory roles of sigma factors in transcription. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 1998. 63: p. 141−55.
Wosten, M.M., Eubacterial sigma-factors. FEMS Microbiol Rev, 1998. 22(3): p. 127−50.
Ishihama, A., N. Fujita, and R.E. Glass, Subunit assembly and metabolic stability of E. coli RNA polymerase. Proteins, 1987. 2(1): p. 42−53.
Blatter, E.E., et al., Domain organization of RNA polymerase alpha subunit: C-terminal 85 amino acids constitute a domain capable of dimerization and DNA binding. Cell, 1994. 78(5): p. 889−96.
Severinov, K., RNA polymerase structure-function: insights into points of transcriptional regulation. Curr Opin Microbiol, 2000. 3(2): p. 118−25.
Sweetser, D., M. Nonet, and R.A. Young, Prokaryotic and eukaryotic RNA polymerases have homologous core subunits. Proc Natl Acad Sci USA, 1987. 84(5): p. 1192−6.
Severinov, K., et al., Dissection of the beta subunit in the Escherichia coli RNA polymerase into domains by proteolytic cleavage. J Biol Chem, 1992. 267(18): p. 12 813−9.
Severinov, K., et al., A non-essential domain of Escherichia coli RNA polymerase required for the action of the termination factor Ale. J Biol Chem, 1994. 269(19): p. 14 254−9.
Zakharova, N., et al., Mutations in and monoclonal antibody binding to evolutionary hypervariable region of Escherichia coli RNA polymerase beta' subunit inhibit transcript cleavage and transcript elongation. J Biol Chem, 1998. 273(38): p. 24 912−20.
Zaychikov, E., et al., Mapping of catalytic residues in the RNA polymerase active center. Science, 1996. 273(5271): p. 107−9.
Grachev, M.A., et al., Studies of the functional topography of Escherichia coli RNA polymerase. A method for localization of the sites of affinity labelling. Eur J Biochem, 1989.180(3): p. 577−85.
Mustaev, A., et al., Modular organization of the catalytic center of RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA, 1997. 94(13): p. 6641−5.
Ghosh, P., A. Ishihama, and D. Chatterji, Escherichia coli RNA polymerase subunit omega and its N-terminal domain bind full-length beta' to facilitate incorporation into the alpha2beta subassembly. Eur J Biochem, 2001. 268(17): p. 4621−7.
Ghosh, P., C. Ramakrishnan, and D. Chatterji, Inter-subunit recognition and manifestation of segmental mobility in Escherichia coli RNA polymerase: a case study with omega-beta' interaction. Biophys Chem, 2003. 103(3): p. 223−37.
Chatterji, D., et al., The role of the omega subunit of RNA polymerase in expression of the relA gene in Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett, 2007. 267(1): p. 51−5.
Vrentas, C.E., et al., Response of RNA polymerase to ppGpp: requirement for the omega subunit and relief of this requirement by DksA. Genes Dev, 2005.19(19): p. 2378−87.
Buck, M., et al., The bacterial enhancer-dependent sigma (54) (sigma (N)) transcription factor. J Bacteriol, 2000.182(15): p. 4129−36.24.

Заполнить форму текущей работой