Изучение роли теломеразы в реактивации синтеза ДНК в ядрах макрофагов в составе гетерокарионов

Более 15 лет назад в результате исследований резидентных макрофагов из невоспаленной перитонеальной полости мыши было показано, что макрофаги обладают уникальной способностью быстро распознавать иммортальные клетки. Оказалось, что реактивация синтеза ДНК в ядрах макрофагов в составе гетерокарионов происходит только в том случае, если для слияния с макрофагами использовали бессмертные клетки (Егоров и др., 1984). Причем, в отличие от макрофагов, для реактивации синтеза ДНК в ядрах других терминально дифференцированных клеток (ядерных эритроцитов курицы, нейтрофилов периферической крови мыши) в составе гетерокарионов, иммортальность пролиферирующей клетки-партнера по слиянию не была необходима. В 80-е годы было известно, что в бессмертных клетках происходит экспрессия онкогенов бессмертия (к этой группе генов относят гены туе и 2Е1А). Свойство макрофагов возобновлять репликацию ДНК в составе гетерокарионов с иммортальными клетками в то время объясняли экспрессией онкогенов бессмертия.

Несколько лет спустя после этих исследований был открыт фермент, теломераза, который предотвращает укорачивание теломер в стволовых и половых клетках, а также в раковых клетках. Оказалось, что бессмертие и теломеразная активность коррелируют. Продолжением исследований, проводившихся в 80-х годах, является данная работа, в которой изучается роль теломеразы в реактивации синтеза ДНК в ядрах макрофагов в составе гетерокарионов с иммортальными клетками. Эти исследования могут также углубить теоретические представления о роли репрессии теломеразы в поддержании дифференцированного состояния макрофагов.

С момента открытия теломеразы и до настоящего времени в лабораториях всего мира ведутся интенсивные исследования теломеразы. Столь большой научный интерес можно объяснить тем, что с одной стороны, в соматических клетках, где теломераза репрессирована, наблюдают процессы клеточного старения. С другой стороны, было показано, что высокую теломеразную активность обнаруживают в 85% раковых клеток. Ежегодно по всему миру от рака умирают сотни тысяч людей. В США в национальном институте здоровья была получена следующая статистика для США за 2001 год: злокачественное изменение клеток было диагностировано у 1.268.000 человек, умерло от рака в США только за 2001 год 553.400 человек. Проблема лечения рака уже давно является одной из самых насущных проблем медицины. Происходит постоянный поиск методов эффективного лечения опухолей. Традиционно в терапии рака используют хирургическое удаление опухолей, облучение и химиотерапию. Одним из направлений терапии рака является подавление функции теломеразы в раковых клетках. Этот подход, возможно в комплексе с другими методами, имеет хорошие перспективы, так как теломераза необходима для бесконечной пролиферации раковых клеток, и подавление теломеразной активности должно вызывать остановку пролиферации раковых клеток. Ингибиторы теломеразы могут быть использованы в качестве химиотерапевтических препаратов. Продолжается поиск новых специфичных и эффективных ингибиторов теломеразы. Для анализа свойств ингибиторов теломеразы необходимо наличие адекватных модельных систем. Используемый в настоящее время метод анализа ингибиторов теломеразы, когда клетки с теломеразной активностью инкубируют в присутствии ингибитора, контролируя длину теломер и выживаемость клеток, имеет несколько недостатков: требуется много времени для получения результатов, а также необходимы большие количества ингибиторов, что не всегда доступно. Актуальным направлением является разработка других модельных систем для анализа ингибиторов теломеразы. В данной работе проведено исследование влияния подавления функции теломеразы на реактивацию синтеза ДНК в ядрах макрофагов в гетерокарионах. В том случае, если реактивация синтеза ДНК в ядрах макрофагов происходит в ответ на появление теломеразной активности в гетерокарионах, и подавление теломеразной активности ведет к снижению доли гетерокарионов, в которых произошла реактивация, гетерокарионы с макрофагами можно рассматривать в качестве модели для проверки ингибиторов теломеразы. В диссертационной работе изучается возможность использования гетерокарионов с макрофагами в качестве тест-системы для анализа новых ингибиторов теломеразы.

Следует заметить, что поскольку теломераза является обратной транскриптазой, тест-система с макрофагами может быть использована для исследования ингибиторов обратных транскриптаз некоторых вирусов, например, вируса иммунодефицита человека. Ранее было показано, что азидотимидин, являясь ингибитором обратной транскриптазы вируса HIV, также подавляет и теломеразную активность.

Обзор литературы.

I. Теломеры и теломераза 1. Структура теломер.

1.1. Теломерная ДНК.

Теломеры — это особые структуры, локализованные на концах всех эукариотических хромосом и важные для генетической стабильности (Muller, 1938; McClintock, 1941; .Lundblad and Szostak, 1989; Sandell and Zakian, 1993). Теломеры являются комплексом теломерной ДНК и связанных с теломерной ДНК белков (Blackburn, 1991; Greider, 1996). Теломерная ДНК состоит из коротких тандемно повторяющихся последовательностей длиной 5−8 оснований. Теломерная последовательность ДНК всех позвоночных животных — (TTAGGG)n, повторенная сотни и тысячи раз (Meyne et al., 1989). Теломерный повтор оказался очень консервативным в эволюции. Так, у организмов, относящихся к разным классам, теломерные повторы могут быть одинаковым или отличаться незначительно (табл. 1). В клетках различных организмов длина теломерного повтора варьирует в широком диапазоне: от 10−15 т.п.о у человека (de Lange et al, 1990) до 50 т.п.о. у мышей вида Mus musculus (Broccoli et al., 1996).

Экспериментально длину теломер определяют с помощью гибридизации по Саузерну. Этот метод позволяет определить длину концевых фрагментов рестрикции (TRF от англ. terminal restriction fragments). TRF кроме консервативного теломерного повтора также включают в себя теломероподобные последовательности, характеризующиеся высокой вариабельностью (Allshire et al., 1989; de Lange et al., 1990). Таким образом, длина TRF, определяемая с помощью гибридизации по Саузерну, оказывается несколько больше реальной длины теломер.

Так как одна цепь ДНК теломерного повтора содержит примерно 50% остатков гуанозина, а другая соответственно, примерно 50% остатков цитозина, то когда говорят о теломерах, различают G-богатую цепь ДНК и комплементарную ей С-богатую цепь ДНК.

Выводы.

1. С помощью различных подходов показано, что теломераза необходима для реактивации синтеза ДНК в ядрах макрофагов в составе гетерокарионов: а) В результате блокирования функции теломеразы в гетерокарионах «макрофаг + клетка ЗТЗ Swiss» с помощью различных ингибиторов теломеразы (азидотимидин, олигонуклеотид, комплементарный матричному району hTR, модифицированные динуклеозидтетрафосфонаты) происходит подавление реактивации синтеза ДНК в ядрах макрофагов без влияния на синтез ДНК в ядрах клеток ЗТЗ. б) Диплоидные фибробласты кожи человека, трансформированные геном hTERT, и обладающие теломеразной активностью, вызывают реактивацию синтеза ДНК в ядрах макрофагов в составе гетерокарионов «макрофаг + ДФЧЬТЕКТ». Диплоидные фибробласты человека без теломеразной активности не обладают такой способностью. в) Миобласты кожи человека, трансформированные геном hTERT, и обладающие теломеразной активностью, вызывают реактивацию синтеза ДНК в ядрах макрофагов в составе гетерокарионов «макрофаг + миобластЬТЕКТ». Миобласты без теломеразной активности не обладают такой способностью.

2. Миобласты кожи человека с введенным геном hTERT, обладающие теломеразной активностью, имеют такой же пролиферативный потенциал, как и исходные миобласты, при этом они обладают способностью реактивировать синтез ДНК в ядрах макрофагов в гетерокарионах. Таким образом, для реактивации синтеза ДНК в ядрах макрофагов в составе гетерокарионов необходимо именно наличие теломеразной активности в пролиферирующей клетке (а не ее иммортальность).

3. Теломеры резидентных макрофагов, видимо, изменены таким образом, что для реактивации синтеза ДНК в ядрах макрофагов необходимо наличие теломеразной активности у клетки, входящей в состав гетерокариона с макрофагом.

4. Впервые создана система, позволяющая относительно быстро и с минимальными затратами изучать ингибиторы теломеразы на клеточном уровне.

Благодарности.

Автор выражает сердечную благодарность своим научным руководителям, доктору биологических наук, профессору А. В. Зеленину и кандидату биологических наук, Е. Е. Егорову за предложенную интересную тему, помощь в работе и ценные советы.

Автор также выражает искреннюю признательность д.б.н. И. А. Прудовскому и к.б.н. С. С. Акимову за обучение основам культивирования клеток. Автор благодарит асп. В. В. Андрееву, Э. Б. Дашинимаева и к.б.н. И. В. Семенову за помощь, оказанную при выполнении экспериментальной части диссертации. Автор выражает особую признательность с.н.с., д. Физ.-мат.н. А. И. Полетаеву и н.с. К. В. Попову за помощь в оформлении диссертационной работы.

Автор благодарит всех сотрудников Лаборатории Функциональной морфологии хромосом за проявленный интерес к работе, за моральную поддержку во время работы, и за отзывчивость в обсуждении результатов.