Липополисахарид менингококка серогруппы А: Получение, характеристика и возможная область использования

Актуальность проблемы. Несмотря на успехи в диагностике, профилактике и лечении менингококковой инфекции, достигнутые за последние два десятилетия, эта проблема продолжает оставаться одной из важнейших в инфекционной патологии и привлекает пристальное внимание исследователей. Это связано о тем, что генерализованные формы менингококковой инфекции характеризуются особенно тяжелым течением заболевания, постинфекционными осложнениями и высокой летальностью (от 10 до 40/0, не имеющей тенденции к снижению (31, 39, 202).

В настоящее время не вызывает сомнения, что развитие тяжелых патологических состояний организма: нарушения метаболизма, электролитного баланса, важнейших биохимических систем и поражения отдельных органов вплоть до шока и гибели, происходит от токсического действия липополисахарида (9, 32, 40, 55, 140). G учетом этого многие исследователи полагают, что вопросы традиционной терапий Менингококковой инфекции должны быть пересмотрены в направлении создания для этих целей препаратов иммуноглобулинов направленного антиэндотоксического действия (28, 46, 65, 74, 75, 76, 77, 78, 84, 219).

Липополисахарид относится к числу протективных антигенов менингококка, стимулирует образование бактерицидных антител и участвует в формировании невосприимчивости к менингококковой инфекции. Детоксицированный липополисахарид рассматривается как один из наиболее вероятных кандидатов противоменингококко-вой вакцины (12, 13, 14, 79, 100, 169, 170).

Глубокие исследования в области менингококковой инфекции, имеющие связь с липополисахаридом, определяют необходимость создания надежных и доступных коммерческих эритроцитарных ди-агноетикумов на основе липополисахарида. Подобные препараты в нашей стране пока не производятся.

Несомненно, что исследования, направленные на выявление специфических антилипополисахарвдных антител, и обеспечение этого направления надежным диагностическим препаратом создадут необходимые предпосылки для решения конкретных задач, связанных о проблемой менингококковой инфекции.

Цель и задачи исследования

.

Б связи с вышеизложенным целью работы являлось получение и характеристика ЛЕЮ менингококка группы А, конструирование на его основе эритроцитарного диагностикума для выявления специфических антител и разработка подходов для создания менинго-кокковых иммуноглобулинов направленного антиэндотоксического действия.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать метод получения высокоочищенного липополисахарида менингококка группы А, свободного от примеси других антигенов микробной клетки.

2. Отработать методы контроля иммунохимической и химической чистоты MG.

3. Изучить физико-химические, иммунохимические и биологические свойства 1ПС.

4. Разработать эритроцитарный диагностикум на основе ЛПС для определения специфических антител.

5. Оценить содержание JHIC-антител в сыворотках здоровых лиц и больных менингококковой инфекцией, а также изучить изменение их уровня в динамике заболевания.

6. Исследовать уровни антител к ЛПС в донорокой плазма и плацентарных сыворотках, используемых в качестве сырья при производстве иммуноглобулинов, для решения вопроса о возможности приготовления специфического антиэндотоксического иммуноглобулина.

7. Изучить протективную активность сывороток с высоким уровнем антител к ЛПС менингококка.

Положения, выносимые на защиту:

1. Для конструирования диагностических препаратов на основе ЛШ необходимы антигены, свободные от примеси капсульно-го группоспецифического полисахарида. Предлагаемый для этих целей метод включает комбинацию препаративных процедур, состоящих из водно-фенольяой экстракции микробных клеток по Вестфалю, термичеокой обработки раствора и ультрацентрифугирования его в присутствии ffafil.

2. Разработана технология изготовления высокочувствительного, специфичного эритроцитаряого ЛШ-диагноетикума для выявления менингококковых ЛПС-антител.

3. Для серотерапии Г#МИ предложено использовать комплексные иммуноглобулиновые препараты, обогащенные XgK-фракцией и приготовленные из сывороточного сырья с высоким исходным уровнем менингококковых ЛИС-антител.

Научная новизна.

Разработан оригинальный метод очистки менингококкового ЛПС серогруппы, А от примеси группоспецифического полисахарида, Получено авторское свидетельство В 1 537 263 от 15 сентября 1989 г. на «Способ получения ЛПС менингококка группы А» .

Получены доказательства иммунохимичеокой гомогенности ЛПС и его выраженной видовой специфичности.

Получены дополнительные данные о содержании ЛПС-антител в сыворотках здоровых лиц и больных менингококковой инфекцией, а также данные об изменении уровня ЛПС-антител в динамике заболевания.

Впервые проанализированы на содержание специфических ЛПС-антител донорские и плацентарные сыворотки, используемые в производстве иммуноглобулинов, а также готовые коммерческие иммуноглобулины и экспериментальные серии комплексного иммуноглобулинового препарата (КИП), разработанного в ШИИЭМ им. Г. Н. Габричевского. Показано, что IQ% исследованных сывороток содержат высокие уровни ЛПС-антител (1:128 — 1:256).

Экспериментально обосновано на основе КИП, обогащенного igMфракцией иммуноглобулинов, конструирование менингококко-вого иммуноглобулина антиэндотоксического действия из сывороточного сырья с высоким исходным уровнем ЛПС-антител (от 1:128 и выше).

Практическая значимость выполненной работы состоит в разработке на основе очищенного ЛПС менингококка группы, А эритроцитарного диагноетикума для определения специфических антител, а также в обосновании возможности получения препаратов иммуноглобулинов направленного антиэндотоксического действия для серотерапии менингококковой инфекции.

Составлена научно-техническая докумштация на эритроци-тарный ЛИС-диагностикум (Изменение к ТУ-42.14 и Регламенту производства диагностикумов менингококковых групп, А и С эритроцитарных жидких, проекты ФС на диагностикумы эритроци-тарные менингококковые группоспецифические и видовой антигенные жидкие для РА и Инструкции, но применению диагности.

— 10 кума менингококкового видового липополисахаридного антигенно^ го жидкого).

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе одно авторокое свидетельство.

Чисть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ВЫВОДЫ.

1. Разработан опоооб получения выоокоочищённого и биологически активного MG менингококка группы, А путем комбинации водно-фенольной экстракции по Вестфалю, термической обработки и ультрацентрифугирования в растворе хлористого натрия с концентрацией 0,5 М и выше. Примененная методика обеспечивает получение иммунохимически гомогенного препарата, свободного от примеси груипоспецифического полисахарида.

2. Показано, что препараты ЛПС по своему химическому составу и электрофоретической подвижности в ПААГ с ДСН относятся к ЛПС 1-типа. Средняя масса молекул ЛИС составляет около 4,7 кД.

3. Установлена высокая гемосенсибилизирующая и антитело-связывающая активность ЛПСМАК в РПГА составляла 62−125 мкг/мл, а МАК в РТПГА — 0,5−2,0 мкг/мл. В структуре ЛПС выявлены детерминанты видовой специфичности, которые обуславливают перекрестные серологические реакции с иммунными кроличьими сыворотками ко всем серогруппам менингококка.

4. Разработана технология изготовления и освоено производственное получение менингококкового эритроцитарного ЛЩ-диагностикума. Диагностикум характеризуется высокой чувствительное тыэ: минимальная концентрация антител, выявляемая в РПГА, составила около 1,8 мкг/мл.

5. Проведена сравнительная оценка содержания менингококко-вых ЛПС-антител в сыворотках больных ГШЙ, менингитами иной этиологии и здоровых лиц. Установлено/что уровни ЛПС-антител в сыворотках больных ГФМИ статистичеоки значимо превышали таковые в сыворотках здоровых лиц или больных менингитами другой.

— 147этиологии. Выявлена динамика нараотания ЛПС-антител в процессе заболевания.

6. Обнаружено, что около 10 $ донорских и плацентарных сывороток содержат менингококковые ЛПС-антитела в повышенных титрах (1:128 и выше). ЛПС-антитела относятся к igM-классу и обладают антиэндотоксической активностью в эксперименте на мышах.

7. Сыворотки с повышенным уровнем менингококковых ЛПС-антител являются перспективными для использования в качестве сырья при создании иммуноглобулиновых препаратов направленного антиэядотоксического действия. Одним из таких препаратов может быть обогащенный ^[-фракцией комплексный иммуноглобули-новый препарат, разработанный в ШИИЭМ им. Г. Н. Габричевского.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

ЩШ относятся к числу исключительно тяжело протекающих инфекций и характеризуются высокой летальностью, которая в начале века составляла 80−90 $. Применение гипериммунных менинго-кокковых сывороток позволяло снижать летальность до 10−30 $. Однако в те годы по ряду объективных причин этот метод лечения Щ не нашел широкого применения. В настоящее время в связи о использованием антибиотиков, сульфаниламидных препаратов и кортикостероидов летальность от Ш снизилась до 10−20 $ (40). При этом следует иметь в виду, что такой уровень сохраняется неизменным на протяжении почти 50 лет и в отличие от других бактериальных инфекций не имеет тенденции к снижению.

Профилактика заболеваемости Ш осуществляется с помощью полисахаридных химических вакцин. За последние 20 лет разрабо-tshh и внедрены в производство менингококковые полисахаридные вакцины серогрупп A, G, г, W-I35 (36). К сожалению, аналогичная вакцина, приготовленная из В-ПС, оказалась не иммуно-генной для лвдей (216), в в настоящее время проводятся исследования по созданию эффективной менингококковой вакцины группы В на основе других протективных антигенов менингококка (19, 81, 145). Однако массовая иммунизация менингококковыми вакцинами целесообразна лишь в периоды эпидемического подъема заболеваемости и в организованных коллективах, где возникают очаги инфекции. В межэпидемический период применение вакцин экономически и эпидемиологически не оправдано. Между тем именно в этот период наблвдается увеличение летальности, по-видимому, из-за ослабления внимания медиков к МИ.

Хорошо известно, что рост числа антибиотикеи сульфаниламидорезистентных штаммов привел к значительному снижению эффективности лечения Ш этими препаратами (32, 40). Более того, применение антибиотиков для лечения больных с менингококдемией порой утяжеляет их состояние. Это происходит вследствие массовой гибели менингококка от действия антибиотиков и высвобождения в кровь больных больших количеств эндотоксина (41, 74, 189, 199).

Вышеперечисленные причины побуждают к поиску новых средств лечения Ж и других грамотрицательных инфекций. Одним из альтернативных решений проблемы является серотерапия на основе иммуноглобулинов направленного действия. Этому вопросу посвящены многочисленные публикации последних лет (28, 46, 75, 76, 77, 78, 65, 84, 219).

Общепризнано, что основным патогенетическим фактором при развитии грамотрицательных инфекций, в том числе и Щ, является ЛПС. Вызывая активацию системы комплемента, освобождение многочисленных медиаторов, действуя на макрофаги и клетки эпителия, ЛПС приводит к развитию тяжелых патологических состояний макроорганизма, вплоть до шока и гибели. Отсщда очевидно, что средства серотерапии должны быть направлены в первую очередь на инактивацию ЛПС. К таким средствам следует отнести прежде во его препараты плазмы крови или иммуноглобулинов, обогащенные антителами к ЛПС. Опубликованы данные об успешном применении специфических ан ти-ЛПСиммун ог л о булинов в хирургической практике и при лечении сепсиса (46, 47, 75, 223). Подобные препараты для лечения ГШ! пока не разработаны,.

1з данных литературы известно, что уровень ЛПС в крови больных Г" может достигать значений в сотни и тысячи раз выше, чем йри оептицемйях, вызванных другими грамотрицатедьными инфекциями (55). Можно предположить по аналогии о другими грамотрица те льнами инфекциями, что введение иммуноглобулинов аятиэндотоксического действия, связывающих ШЮ менингококка и вызывающих его инактивацию, приведет к улучшению состояния больных ГйШ. В своей работе мы попытались обосновать основные подходы к созданию менингококковых антиэндотоксических иммунб-глобулиновых препаратов и, в первую очередь, оценить возможности использования донорских и плацентарных сывороток в качестве исходного еырья для получения таких препаратов. Согласно данным литературы около 3−1(3 $ сывороток здоровых доноров имеют высокий уровень антител к ЛПС различных бактерий (33, 83, 84). Однако сведения о содержании в таких сыворотках антител к ДШ менингококка в литературе отсутствуют.

Для получений четкого представления о содержании ЛПС-ан-тител нами было исследовано более двухсот образцов плазмы крови безвозмездных доноров и плацентарных сывороток. На основании результатов титрования в РПГА указанного материала было показано, что сывороточные антитела к менингококковому ЛПС присутствуют практически у всех здоровых лиц, но, как правило, в низких титрах. Лишь у 10 $ исследованных образцов уровень антител был достаточно высоким (1:128 и выше), чтобы рассматривать этот материал как перспективный для использования в серотерапии^ нативном видели в качестве исходного сырья при изготовлении иммуноглобулинов направленного действия.

Изучение аятиэндотоксической активности образцов плазмы крови с высоким исходным уровнем НС-антител в тесте защиты мышей от летальной эндотоксемии показало, что указанные образцы обладали выраженными протективннми свойствами. Процент гибели мышей при введении плазмы с высоким уровнем антител уменьшался вдвое до сравнению с плазмой, содержащей низкий уровень антител. Чтобы определить, сохраняется ли соответствующий уровень антител в готовых препаратах иммуноглобулинов, было проанализировано 10 серий коммерческого нормального иммуноглобулина, 5 серий специфического противоменингококкового иммуноглобулина, полученного из плазмы доноров, иммунизированных полисахаридной А-вакциной (37), и 5 серий экспериментального комплексного иммуноглобулинового препарата (КИП), разработанного в МНИЙЭМ им. Г. Н. Габричевского (60. В отличие от коммерческих препаратов иммуноглобулинов, содержащих в основном только igg, в состав КИПа входило 15 920 $ iga ж 25−30 $ igi- (6). Особенно важно присутствие с которыми, как известно, связывают защитный эффект при ряде грамотряцатеяьяых инфекций (эшерихиозы, садьмонеллезы и др.) (7). Б настоящее время энтеральные формы КИП успешно применяются для лечения острых кишечных инфекций (7). Ведется разработка КИИ для в/в введения.

Из всех испытанных нами препаратов антитела к Л1С менингококка в высоких титрах (1:128 — 1:256) были обнаружены только в КИПе. В коммерческих нормальных и специфических противо-мендагококковнх иммуноглобулинах титры антител были даже ниже, чем в исходном сывороточном сырье. Это свидетельствовало о потере ЛПС-антител при изготовлении коммерческого иммуноглобулина и, напротив, о концентрировании их в КИПе. Поскольку КИИ обогащен иммуноглобулинами класса М, можно было предположить, что менингококковые ЛПС-антитела принадлежат именно к этому классу. Титрование в РПГА образцов плазмы крови и КИП, предварительно обработанных меркаптоэтанолом, подтвердило наши предположения и указывало на перспективность использования КИП для серотерапии ЩЩ. Если такие препараты готовить из сывороток с высоким исходнйм уровнем ЛШ-антител, то это приведет к значительному увеличению их содержания в готовом препарате.

Необходимой предпосылкой для создания таких препаратов является наличие высокочувствительной и специфичной тест-системы для выявления НС-антител. Это и составляло основную цель наших исследований. В качестве диагностической тест-оис-темы нами был выбран эритроцитарный диагностикум на основе высокоочищенного ЛПС менингококка группы А.

Традиционные методы выделения ЛПС из микробных клеток позволяли получать препараты с различной степенью очистки и биологической активностью. Наиболее очищенные препараты с низким содержанием примеси белка и нуклеиновых кислот могли быть получены по методу Вестфаля в сочетании с ультрацентрифугиро-ваниам раствора ЛПС при 105 000 g. Однако иммунохимический анализ с менингококковыми гипериммунными кроличьими сыворотками выявлял в таких ЛПС присутствие примеси капсульного ПС в количестве около J%,.

В качестве методов количественной оценки содержания примеси А-ПС в ЛИС были использованы ВИЭ# и РТПГА с грунпоепеци-фическими менингококковыми кроличьими сыворотками. Были специально подобраны условия проведения этих реакций с учетом количества примеси А-ПС. Необходимость использования для этих целей йммунохймических методов вызывалась тем, что определение А-ПС химическими методами по содержанию фосфора оказалось невозможным из-за присутствия фосфора в составе самого ЛПС.

Следует отметить, что при анализе данных литературы, касающихся получения менингококковых ЛПС (II, 26, 27, 112, 113, 124, 203, 205), мы не нашли каких-либо сведений по характернотике иммун (c)химической и антигенной чистоты полученных препаратов, в том числе данных, подтверждающих отсутствие в ЛПС примеси капеульного группоспецифического НС. Вместе с тем мы считали, что такая характеристика крайне необходима, особенно в том случае, если предполагается использование ЛПС для проведения иммунохимпческих и серологических исследований. Показано, что из-за сильно выраженного общего отрицательного заряда А-ПС, он легко сенсибилизирует эритроциты без какой-либо предварительной их обработки (95). В этом отношении сенсибилизирующая активность А-ПС приблизительно в 10 раз превышает активность ЛПС. Использование для приготовления диагностикума ЛПС, содержащего примесь А-ПС даже в небольшом количестве, было неприемлемо, так как в таком случае титрование сывороток привело бы к искажению результатов фактического содержания антител к ЛПС. Следовательно, необходимо было разработать такой способ очистки ЛПС, который бы гарантировал отсутствие в готовом препарате группоспецифического ПС даже в следовых количествах.

В основу разработанного нами метода было положено различие в термостабильности двух антигенов. Известно, что ЛШ относится к числу достаточно термостабильных антигенов и сохраняет серологическую и биологическую активность при нагревании его при Ю0°С в течение 3-х часов (198). А-ПС, напротив, весьма термолабилен и полностью разрушается до низкомолекулярных фрагментов в процессе нагревания при IQ0°C в течение 30 минут (18). Поэтому оказалось возможным подобрать такие условия, при которых происходило избирательное разрушение А-ПС при полном сохранении основных свойств ЛПС. Избирательная деградация A-1G достигалась нами в результате термостатирования водного раствора ЖС при 37 °C в течение 16 суток. Однако и в этом случае эффективного разделения высокомолекулярного ЛПС и низкомолекулярного А-ПС не происходило ни в результате гельфильтрации на колонке с сефарозой 4 В, ни при ультрацеятрифугировании.

В дальнейшем было показано, что ЛПС и А-Ш образуют комплекс, но связь между ними не является новалентной и может быть разрушена в присутствии определенных концентраций неорганических солей в раетворе. В соответствии с отработанными условиями заключительный этап очистки ЖС следовало проводить в присутствии laCi при концентрации раствора, равной 0,5 М или выше. На «Способ получения липоиолисахарида менингококка группы Ая получено авторское свидетельство Л 1 537 263 от 15 сентября 1989 г.

Указанным опособом ЖС мог быть получен как из сухих. микробных клеток, так и из иосадка-25и — балластного промежуточного продукта производства менингококковой полисахаридной вакцины группы А.

По разработанному методу было получено Ю серий ЖС. С помощью методов диффузионной преципитации в геле и ЙЭФ с гипериммунными кроличьими сыворотками было показано, что очищенные препараты содержали единственный антигенный компонент и бшш иммунохимически гомогенными.

Анализ очистки ЛПС проводили с помощью традиционных методов определения белка по Лоури и нуклеиновых кислот по Спирину. Суммарное содержание примеси балка и нуклеиновых кислот было невелико и не превышало в пересчете на сухую массу препарата.

Химический состав ЖС практически полностью совпадал с данными, представленными другими авторами для ЖС менингококка группы, А (112, 113). Содержание фоофора в ЛПС составляло в среднем .3,752, КДО — около J0, липида, А — более ЗС$. Высокое содержание КДО и липида, А в наших препаратах указывало на то, что ЛИС принадлежит к ктипу, и это полностью соответствовало современным представлениям о химической структуре менингококковых ШЮ (108).

Дополнительное доказательство этого было получено с помощью Э# в MAT о ДОН. В сравнительных экспериментах постановки ЭФ в ШАТ о ДСН ЛПС из е. coli оеротипа 055: Вб, относящегося к ЖС sтипа, и менингококковых ЛПС групп А, В, С было показано, что препарат из е. eoli давал более 40 полос различной интенсивности, расположенных по всей длине геля и указывающих на сильно выраженную гетерогенность молекулярных масс от очень малых (порядка 3−4 кД) до больших (порядка нескольких десятков тысяч дальтон) (204). В противоположность этому ЛПС менингококка давали характерный для д-типа спектр, где выявилось от 2 до 6 отдельных полос. При этом количество основных компонентов не превышало 2, кроме которых обнаруживалось еще 2−3 минорных. Все компоненты двигались со скоростью, близкой к скорости бромфенолового синего, что свидетельствовало об их низкой молекулярной маосе, и находились на близком расстоянии друг от друга, почти сливаясь, что указывало на очень незначительную разницу в их молекулярной массе и химической структуре. Полученные нами данные полностью соответствовали представлениям о молекулярной структуре менингококковых ЛПС (204). Элетрофоретические профили ЛПС серогрупп, А и В были очень похожи как по набору полос, так и по их расположению. Иная картина наблвдалась при электрофорезе ЛПС группы С. Независимо от концентрации препарата, использованной для электрофореза, в ЛПС группы С выявлялась единственная полоса без каких-либо минорных компонентов. Эти данные указывали на то, что для ЛПС групп, А и В существует более выраженное антигенное родство, тогда как для серогрупны С такое предположение маловероятно.

Ориентировочная молекулярная масса ЛИС, оцененная расчетным опособом по результатам химического анализа, составляла 4,7 кД. Эти данные были очень близки к результатам, полученным другими авторами с помощью ЭФ в ПААГ о ДСП (124, 205).

Для решения вопроса об использовании очищенного ЛИС в качестве основы при созданий менингококковой диагностической тест-системы необходимо было изучить его серологическую активность и специфичность, которые имеют ключевое значение в характеристике любого антигена, используемого для конструирования диагностических препаратов.

Согласно данным литературы специфичность менингококковых ЛИС неоднозначна. ЛИС может иметь в своей структуре различные антигенные детерминанты (123, 205). В зависимости от условий культивирования менингококка, метода выделения и степени очистки активность тех или других детерминант может в значительной степени варьировать. При этом, до мнению ряда авторов, наиболее сильно выражены детерминанты с иммунотиповой специфичностью и в меньшей степени — с видовой специфичностью (137, 205, 225). Наряду о этим в ЛПС менингококка выявлены детерминанты, общие с некоторыми видами рода Neisseria, такими как ж. gonorrhoeae И Ж* lactamica (123).

При исследовании серологической активности и специфичности были использованы сыворотки к менингококкам различных серогрупп, к некоторым другим видам нвйосерий, к бактериям семей.

О IBS En-feerolaeteriaeeae И в. dxjMiieriae. B опытах постановки РПГА с эритроцитами, сенсибилизированными ЛШС, в гомологичной системе титры гемагглютинации для разных серий сывороток находились в интервале от 1:128 до 1:5120. В гетероло-гичных системах титры значительно варьировали в пределах от 1:16 до 1:2048 в зависимости от серогруппы менингококка, взятого для иммунизации. Максимальные титры наблвдались в сыворотках к менингококку группы В.

Возвращаясь к данным, полученным при электрофореза ЛПС групп, А и В, можно предположить, что высокие уровни антител к ЛШ в сыворотках группы В, обусловлены, по-видимому, большей гомологией в структуре молекул Аи В-ЛПС по сравнению о другими серогруппами.

При сравнении результатов титрования кроличьих сывороток к менингококкам и к непатогенным нейссериям, полученным по единой схеме иммунизации, было установлено, что слабые перекрестные реакции наблкщались в случае ц. fiavescens (1:20 -1:40) и практически отсутствовали для в, cattarbalis. Выраженных перекрестных реакций с сыворотками к представителям семейства энтеробактерий и грамположительным бактериям дифтерии не обнаружено.

При иммунохимических исследованиях с помощью диффузионной преципитации в геле по Ухтерлоне с гипериммунными кроличьими сыворотками к менингококкам серогрупп А, В и С ШС формировал с каждой из указанных сывороток единственную адентичную полосу преципитаций. Эти результаты позволили заключить, что очищенный ЛШ представляет собой антиген, содержащий детерминанты видовой специфичности. I сожалению, отсутствие эталонных сывороток с йммунотишовой специфичностью, которые в настоящее время получены лишь в зарубежных лабораториях, не позволили нам охарактеризовать иммунотиповую принадлежность подученного нами ЛПС.

Следующим этапом нашей работы было изготовление эритроци-тарного диагностикума на основе высокоочищенного и иммунохими-чески гомогенного ЛПС для выявления специфических менингококковых антиэндотоксичеоких антител. Диагностикум готовили с помощью общеизвестных методов (17), используя формалинизирован-ные по Фили эритроциты и активированный ЛПС. Было апробировано 2 способа активаций ЛПС: щелочная и кипячением. Как показали исследования, и в том и в другом случае получали ЛПС с приблизительно одинаковой гемосенсибилизирующей активностью. Однако при выборе окончательного варианта диагностикума предпочтение было отдано щелочной активации ЛПС, как более технологичной.

Эритроцитарный ЛПС-диагностикум был сравнительно отаби-лен и сохранял свою активность в течение-З^х лет хранения в условиях бытового холодильника.

Чувствительность и специфичность разработанного диагностикума была изучена в результате титрования как кроличьих ги~ периммунных менингококковых сывороток различных серогруш, так и человеческих сывороток, полученных от больных Щ®-, больных менингитами иной этиологии, а также здоровых лиц. Исследования выявили высокую чувс твительнос ть ЛПС-диагностикума. С его помощью можно было определить титры ЛПС-антител в интервале от Д2 до 1:5120 — 1:10 240. Минимальная концентрация антител/выявляемая в РИГА с ЛПС-диагностикумом, составляла по белку 1,8 мкг/мл.

При титровании оывороток, полученных от больных Щ с установлвнной серогрулдовой принадлежностью возбудителя, отмечены более высокие титры IliC-аятител по сравнению с уровнем таковых в сыворотках здоровых лиц или больных менингитами неменингокок-ковой этиологии. Это свидетельствовало о наличии выраженного иммунного ответа на ЛПС-антиген при МИ. Наблвдалась динамика нарастания антител в ходе заболевания Ш.

Отмеченные закономерности, как и ранее полученные экспериментальные данные по титрованию кроличьих иммунных сывороток к различным серогруппам менингококка, подтверждают видовую специфичность ЛПС-антигена и изготовленного на его основе эрит-роцитарного диагноетикума.

Средние уровни ЛШ-антител при ГФЩ серогрупп Б и С были достоверно выше, чем при заболеваниях, обусловленных менингококком группы, А (соответственно, 1:118? 1,2- 1:155 $ 1,3 а 1:60×1,2). Мы полагаем, что одним из возможных объяснений такого иммунологического ответа может быть конкуренция антигенов мезду оильнш антигеном — грунпосиецифическим А-ПС и слабым антигеном — ЛПС. Такое предположение базируется на более выраженной антигенной стимуляции и иммунологической активности у А-ПС по сравнению с группоепецифичеокими Ш других серогрупп менингококка (29, 95, 96, 97).

Таким образом, в результате проведенных исследований разработан метод получения высокоочищенного иммунохимически однородного менингококкового ЛПС и на его основе сконструирован эритроцитарный ЛПС-диагностикум с четко выраженной видовой специфичностью. ЛШ-диагностикум предназначен для выявления ме-нингококковых антиэндотоксичвскйх антител и может быть использован как в научных исследованиях при изучении разнообразных.

— 145 вопросов патогенеза и иммуногенеза менингококковой инфекции, так и в практических целях, в частности, при отборе сывороточного сырья с повышенным содержанием менингококковых ЛЩ-анти-тел для получения иммуноглобулинов направленного антиэндоток-сического действия. Показано, что наиболее перспективным препаратом такого типа являетея КИП — комплексный иммуноглобули-новый препарат, содержащий, помимо антител ig@-класса, антитела м-класса.