Использование принципа максимального правдоподобия при решении фазовой проблемы в кристаллографии макромолекул

Макромолекулярная кристаллография является необходимым компонентом современной структурной биологии. Знание трехмерной структуры белков и нуклеиновых кислот является ключевым для понимания ее стабильности и механизма функционирования. Во многих случаях знание структуры белка и его комплекса с ингибиторами является решающим фактором при создании противовирусных препаратов.

Первым этапом определения структуры является выращивание кристаллов и получение дифракционной картины рентгеновского, нейтронного или электронного рассеяния на кристаллах исследуемой структуры. Второй этап представляет собой определение функции, описывающей распределение электронной плотности в кристалле, по дифракционной картине. Конечный этап — построение и уточнение атомной модели исследуемого вещества. Настоящая работа посвящена разработке методов, используемых на втором этапе. Так как функция электронной плотности в кристалле является периодической, она может быть представлена в виде комплексного ряда Фурье:

Дг) = ехр (-2шИ-г),.

У и где Vобъем элементарной кристаллической ячейки, а трехмерный вектор Ь=(ЬьЬ2,Ьз) принимает все целочисленные значения. Комплексный коэффициент Еь называется структурным фактором. Он может быть записан в виде:

Р = Т7.

А ь 1 ь ет где.

— это модуль структурного фактора, а гд — фаза.

Когда монохроматический рентгеновский луч падает на кристалл, определенным образом ориентированный относительно падающего луча, то рассеяние происходит в дискретных направлениях, определяемых кристаллической решеткой. Дифракционная картина, возникающая на пленке детектора, представляет собой набор пятен, называемых рефлексами, пронумерованных с помощью векторов обратной решетки Ь. Согласно кинематической теории рассеяния интенсивность каждого отдельного рефлекса пропорциональна квадрату модуля структурного фактора. Т.о. измерив интенсивность рефлексов, можно получить значения модулей структурных факторов, и чтобы определить искомую функцию электронной плотности недостает только значений фаз. Отсутствие этих значений является центральной проблемой, так называемой «фазовой проблемой», при решении неизвестной структуры. Для рефлексов общего типа (нецентросимметричных рефлексов) фаза структурного фактора может принимать любое значение в интервале от 0 до 2%. Тем не менее, в зависимости от симметрии кристалла для некоторых групп рефлексов (центросимметричных рефлексов) значение фазы может быть ограничено одним из двух возможных значений.

Основными подходами к решению фазовой проблемы для макромолекул в настоящее время являются:

• Метод множественного изоморфного замещения (Вlow & Crick, 1959).

• Метод молекулярного замещения (Perutz, 1956; Rossmann, 1972).

• Многоволновая аномальная дифракция (Hendrickson, 1991).

Однако с помощью перечисленных методов фазовая проблема далеко не всегда решается.

Для применения метода изоморфного замещения необходимо получить дифракционные данные не только от кристалла нативной структуры, но также от нескольких кристаллов ее тяжелоатомных изоморфных производных. Последние представляют собой вещества с той же самой молекулярной структурой, но с одним или несколькими тяжелыми атомами, которые могут быть либо добавлены к нативной структуре, либо могут замещать часть ее атомов. Изоморфные производные должны быть закристаллизированы в той же самой пространственной группе, что и исходная макромолекула. Если положения тяжелых атомов в полученных кристаллах могут быть определены, то на основании сравнения интенсивностей рефлексов нативной структуры и тяжелоатомных производных фазовая проблема может быть решена. Однако, использование этого метода наталкивается на большие экспериментальные трудности при получении производных, часто полученные производные обладают недостаточно высокой степенью изоморфизма, что является необходимым условием успеха метода.

Для возможности применения метода молекулярного замещения необходимо знание модели структуры, гомологичной исследуемой структуре. Такая модель может быть выбрана из банка известных структур на основании близости ее последовательности неизвестной структуре или получена методами электронной микроскопии. Эта модель «помещается» (методами компьютерного моделирования) в кристаллическую ячейку и сначала вращается с целью определить ее наилучшую ориентацию, а затем в полученной ориентации двигается по элементарной ячейке с целью определить ее наилучшую позицию. Критерием наилучшей позиции и ориентации модели является соответствие рассчитанных и наблюдаемых дифракционных данных. Если правильные ориентация и позиция найдены, то по такой модели рассчитываются значения фаз, которые затем используются как первое приближение к решению фазовой проблемы. Успех метода во многом определяется степенью гомологичности модели исследуемой структуре, а также степенью корректности размеров модели по отношению к элементарной ячейке. Даже небольшое несоответствие модели исследуемой структуре может вызвать неудачу при поиске позиции уже ориентированной модели.

При использовании метода многоволновой аномальной дифракции длина волны падающего на кристалл луча варьируется вокруг значений приблизительно равных значениям, при которых происходит эффект резонанса, или аномальное рассеяние, для нескольких «специальных» атомов структуры. Дифракционные картины измеряются для нескольких значений длины волны падающего луча и на основании анализа разностей интенсивностей рефлексов этих картин оцениваются значения фаз. Успех многоволновой аномальной дифракции, как и изоморфного замещения во многом зависит от экспериментального получения производных с требуемыми свойствами для аномальной дифракции.

Развитие технологии: совершенствование методов кристаллизации белков, использование синхротронного излучения и совершенствование детекторов, что позволило сильно сократить время проведения эксперимента и существенно улучшить точность получаемых экспериментальных данных, использование все более мощных компьютеров для проведения необходимых вычислений, совершенствование методов генной инженерии, позволяющей получать модифицированные формы белков в случае, если исследуемая структура не поддается кристаллизации, во многом определяет то, что перечисленные методы продолжают развиваться и широко применяться в мире. Однако, наряду с этим существует огромный интерес к созданию новых подходов к решению фазовой проблемы для макромолекул.

К одному из таких направлений принадлежат исследования возможности использования для этой цели вероятностного подхода, на основе которого были созданы «прямые методы» решения низкомолекулярных структур. Непосредственное использование процедур прямых методов применительно к макромолекулам к успеху не приводит из-за принципиальных ограничений, лежащих в основе этих методов, на число атомов исследуемой структуры. Здесь необходимо создание новых методик, учитывающих качественно иную ситуацию для больших белков и макромолекулярных комплексов с числом атомов, превышающих 1000. Привлекательность идеи использования вероятностного подхода для решения макромолекулярных структур состоит в том, что фазовая проблема в рамках этого подхода решается ab-initio. Это означает, что в качестве исходных данных используются только результаты эксперимента, полученные с нативной структурой, и не требуется ни наличия модели, ни проведения дополнительных рентгеновских экспериментов.

Данная работа посвящена исследованию возможности использования статистического моделирования и принципа максимального правдоподобия при решении фазовой проблемы для макромолекул на низком разрешении. Рефлексами низкого разрешения в кристаллографии являются рефлексы, находящиеся в малоугловой зоне рассеяния. Соответствующие структурные факторы отвечают гармоникам Фурье с большими «длинами волн», передающим грубые детали объекта. Актуальность такой задачи определения фаз низкого разрешения связана с тем, что возможны два подхода к определению фаз для макромолекул. Согласно одному — ставиться задача оценить значения фаз сразу для всех рефлексов, для которых есть экспериментальные данные, а затем уточнять полученные значения. Согласно другому, сначала определяются значения фаз для рефлексов только низкого разрешения, а затем этот набор расширяется и уточняется (Xiang et al., 1993; Podjarny, Rees & Urzhumtsev, 1996; Main, 1999). Кроме того, в ряде случаев, а именно: для больших макромолекулярных комплексов, когда модель очень низкого разрешения представляет интерес сама по себе, например модель рибосомыв случае, если не удается получить дифракционную картину высокого разрешенияв случае, когда макромолекула представляет собой смесь упорядоченных и неупорядоченных областей, например, нуклеиновые кислоты в вирусах, знание фаз низкого разрешения представляет большой интерес (Podjarny & Urzhumtsev, 1997).

Первая глава настоящей работы содержит обзор литературы, кратко отражающий развитие идей по использованию вероятностного подхода в рентгеновской кристаллографии. Вторая глава посвящена задаче определения ab-initio области молекулы, которая является первым этапом решения фазовой проблемы при низком разрешении. Для выбора области молекулы из набора альтернативных областей предлагается критерий обобщенного правдоподобия, являющийся аналогом статистического правдоподобия,. Показано, что задача выбора наилучшей области молекулы может быть сведена к выбору априорного распределения координат атомов неизвестной структуры из некоторого класса априорных распределений. Для каждой тестируемой области значение критерия обобщенного правдоподобия оценивается с помощью специальной компьютерной процедуры. Третья и четвертая главы посвящены исследованию применения критерия обобщенного правдоподобия для выбора области молекулы из класса сферических областей, для выбора одной из нескольких альтернативных областей молекулы, полученных с помощью FAMметода, и для выбора правильного или ближайшего к правильному фазового набора из большого количества гипотетических наборов значений фаз. Задача поиска наилучшего фазового набора может быть сведена к выбору наиболее вероятной области молекулы, и для такой задачи может быть применен критерий обобщенного правдоподобия. Т.о. все рассматриваемые задачи в главах 2−4 сводятся в конечном итоге к поиску априорного распределения координат атомов, которому соответствует максимальное значение критерия, являющегося аналогом статистического правдоподобия и оцениваемого в ходе специальной компьютерной процедуры. Последняя пятая глава посвящена попытке решить задачу поиска априорного распределения, которому бы соответствовало максимальное значение функции правдоподобия аналитическим путем. Математические выкладки вынесены в Приложения 1 и 2.

Изложенная в диссертации работа выполнялась в сотрудничестве с Лабораторией биологических структур Института генетики и молекулярной и клеточной биологии (г.Страсбург, Франция).

Работа была поддержана грантами РФФИ 94−04−12 844 и 97−04−48 319.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ.

1. Предложен подход к выбору области, занимаемой макромолекулой в элементарной ячейке кристалла из класса альтернативных областей, основанный на статистическом моделировании, принципе максимального правдоподобия и компьютерной процедуре Монте-Карловского типа, позволяющей оценивать величину правдоподобия. Применимость подхода продемонстрирована в тестовых расчетах на белках с известной атомной структурой.

2. Предложен метод трансформирования фазовой проблемы рентгено-структурного анализа в проблему выбора области, занимаемой макромолекулой, из класса альтернативных областей.

3. Предложен подход к ab-initio к решению фазовой проблемы при низком разрешении, основанный на фильтрации случайно сгенерированных фазовых наборов при помощи критерия отбора, являющегося аналогом статистического правдоподобия, и усреднении отобранных вариантов. С помощью предложенного подхода для тестируемых структур получены значения фаз, которые можно использовать в качестве первого приближения к решению фазовой проблемы.

4. Получены явные асимптотические формулы для совместного распределения вероятностей набора структурных факторов, пригодные для использования при работе с сильными рефлексами. Найденные формулы применены для расчета градиента функции правдоподобия и приближения априорного распределения градиентом функции правдоподобия.

В заключение автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю д.ф.-м.н. Лунину В. Ю. за ясную постановку задач, постоянное руководство и внимание.

Автор благодарит к.ф.-м.н. Лунину Н. Л. за помощь при подготовке программ.

Автор выражает особую благодарность Сковороде Т. П. за участие в обсуждениях и постоянные ценные советы.