Экспериментальные подходы к разработке противотуберкулезной вакцины на основе дендритных клеток

Общая характеристика работы.

Данная работа посвящена изучению подходов к разработке вакцины на основе дендритных клеток на модели летальной туберкулёзной инфекции у мышей.

Актуальность проблемы.

По данным ВОЗ при исследовании причин гибели взрослого населения планеты от различных инфекционных болезней, смертность от туберкулеза составляет около 30% [Bloom В. R. et al., 1992]. Это определяет необходимость совершенствования мер борьбы и профилактики туберкулеза. К основным средствам борьбы с распространением туберкулеза относятся, прежде всего, активное обнаружение и эффективная лекарственная терапия больных, а также профилактическая вакцинация.

Несмотря на многочисленные попытки создания новых эффективных противотуберкулезных вакцин, единственной разрешенной к применению у человека остается вакцина BCG. Известно, что эта вакцина достаточно эффективна в детском возрасте. Вакцинация детей BCG защищает их от милиарного туберкулёза, препятствует диссеминации возбудителя инфекции и возникновению туберкулёзного менингита [Rodrigues L. С. et al., 1993; Colditz G. A. et al., 1994]. Однако данные по эффективности BCG при лёгочной форме туберкулёза у взрослых имеют весьма противоречивый характер. При клинических испытаниях в различных регионах мира было выявлено, что эффективность вакцины BCG колеблется от 0 до 80% [Sutherland I. et al., 1987; Fine P. E., 1995]. Все это свидетельствует о том, что одной из важнейших задач по борьбе с туберкулезом является создание новой более эффективной вакцины. Одним из подходов к вакцинации, которому сейчас уделяется серьезное внимание, является повышение эффективности уже существующей вакцины BCG с использованием стратегии первичной вакцинации и вторичных ревакцинаций [Feng С. G. et al., 2001; Ferraz J. С. et al., 2004]. Другой подходэто генетическая модификация вакцины BCG для повышения ее иммуногенности. Существует целый ряд данных о том, что вставка некоторых генов с одновременным выключением других генов может значительно усилить протективные свойства вакцины BCG [Conradt P. et al., 1999; Horwitz M. A. et al., 2000; Grode L. et al., 2005]. Этот подход, тем не менее, может дать неоднозначные результаты, если иметь ввиду безопасность людей с иммунодефицитами, в частности заражённых ВИЧ, при применении таких живых вакцин [Reynes J. et al., 1989; Elhay M. J. et al., 1997]. Весьма сомнительным этот подход также выглядит с точки зрения стабильности модифицированных штаммов BCG после генетических манипуляций.

Некоторые очищенные или рекомбинантные белки из М. tuberculosis по отдельности или в различных сочетаниях также индуцируют протективный иммунитет против туберкулёза в экспериментальных моделях [Yeremeev V. V., et al., 2003; Doherty T. M. et al., 2004; Williams A. et al., 2005], но для генерации сильного иммунного ответа и протекции необходимы мощные адъюванты. Важно отметить, что единственным разрешённым для применения у человека адъювантом является гидроокись алюминия, индуцирующая преимущественно иммунный ответ Т-хелперов 2 типа, которые не участвуют в протективном иммунном ответе при туберкулёзе [Andersen Р., 1997]. Другой мощный адъювант — монофосфорил липид А, который активирует иммунный ответ Т-хелперов 1 типа, в настоящее время лишь рассматривается как потенциальный кандидат для применения у человека [Elhay M. J. et al., 1997].

Inaba, Steinman и другие [Inaba К. et al., 1990, 1993; Steinman R. M., 1991] показали, что инъекция дендритных клеток (ДК), нагруженных разными антигенами, способна индуцировать Т-клеточный ответ без добавления дополнительных адъювантов. Показано также, что ДК способны фагоцитировать аттенуированные и вирулентные микобактерии, что приводит к индукции антимикобактериального клеточного иммунитета [Inaba К. et al., 1993; Henderson R. A. et al., 1997; Demangel C. et al., 1999, 2000]. Важно, что при этом возникает ответ Т-клеток с фенотипом CD4+, который, как считается, является важным элементом резистентности к туберкулёзу [Flynn J. L. et al., 2001; North R. et al., 2004]. В лёгких незрелые ДК, располагающиеся рядом с воздушными путями и дистальными альвеолами, очень важны для запуска клеточного иммунного ответа против лёгочных патогенов [Cella M. et al., 1997; Banchereau J. et al., 1998]. Учитывая центральную роль ДК как профессиональных и сверхэффективных антиген-презентирующих клеток (АПК), представляется весьма перспективным использование этих клеток в качестве естественного, замещающего адъювант, компонента противотуберкулёзных вакцин. Кроме того, изучение ДК в экспериментальных системах крайне важно для понимания фундаментальных механизмов протективного иммунитета при туберкулёзе.

Цель исследования.

Целью настоящего исследования стало изучение возможности использования дендритных клеток, выращенных in vitro и нагруженных микобактериальными антигенами, для индукции протективного противотуберкулезного иммунитета у мышей.

Задачи исследования.

В настоящей работе мы ставили перед собой следующие задачи:

1) отработать метод получения ДК in vitro из костно-мозговых предшественников;

2) охарактеризовать фенотип полученных in vitro ДК по экспрессии поверхностных маркеров и продукции цитокинов;

3) исследовать функциональную активность полученных in vitro ДК, а именно — изучить способность ДК индуцировать ответ Т-клеток на сложную смесь микобактериальных антигенов (соникат М. tuberculosis H37Rv) in vitro и in vivo;

4) охарактеризовать различные показатели иммунного ответа, индуцированного ДК у мышей in vitro и in vivo;

5) определить оптимальную схему вакцинации и дозы нагруженных антигеном ДК для индукции максимальной защиты против последующего заражения М. tuberculosis в модели на мышах (исследовать динамику гибели мышей и бактериальную нагрузку в органах зараженных животных).

Научная новизна и практическая значимость.

• Усовершенствованы и оптимизированы ранее разработанные методы выращивания дендритных клеток in vitro из костно-мозговых предшественников и обработки ДК антигенами вирулентных микобактерий туберкулёза.

• Впервые изучена способность ДК индуцировать первичный и вторичный иммунные ответы Т-клеток на сложную смесь микобактериальных антигенов (соникат М. tuberculosis H37Rv) in vitro и in vivo и оценена специфичность этих ответов.

• Впервые выявлены фенотипические и функциональные различия между дендритными клетками, выращенными на сингенной (мышиной) и ксеногенной (эмбриональной телячьей) сыворотках, а именно различия в степени зрелости этих ДК и способности индуцировать Т-клеточный ответ.

• Впервые показано, что дендритные клетки, выращенные на сингенной мышиной сыворотке, при адоптивном переносе активируют Т-клетки, специфически отвечающие на микобактерии. Дендритные клетки, выращенные на ксеногенной сыворотке, индуцируют неспецифический ответ Т-клеток.

• Разработана новая схема вакцинации выращенными in vitro дендритными клеткамиоптимизированы сроки, дозы и пути введения вакцины.

• Впервые показана способность дендритных клеток, выращенных на мышиной сыворотке, вызывать значительную протекцию против последующего заражения туберкулёзом (снижение числа КОЕ, увеличение продолжительности жизни мышей).

• Впервые обнаружено, что вакцинация выращенными на мышиной сыворотке дендритными клетками приводит к значительному накоплению ИФН-у-продуцирующих клеток в органах животных.

Результаты исследования возможности разработки вакцины против туберкулёза на основе дендритных клеток в экспериментальных системах свидетельствуют о том, что выращенные in vitro дендритные клетки в перспективе можно использовать в качестве естественных адъювантов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.

Введение

.

После попадания микобактерий в организм хозяина через респираторный тракт возможны четыре варианта развития событий: 1) первичный ответ может убить все поступившие микобактерии, и туберкулез никогда не разовьется;

2) микобактерии могут начать размножаться, и у пациента проявятся клинические признаки заболевания, известного как первичный туберкулез;

3) бациллы могут остаться в «спящем» состоянии, и такая латентная инфекция выявляется только по кожному тесту на туберкулин- 4) спящие микобактерии могут возобновить размножение, результатом чего будет клиническое проявление так называемого реактивационного туберкулеза [Dannenberg А. М. et al., 1982, 1994].

Клеточный иммунитет (КИ) организма-хозяина определяет развитие инфекции. При адекватном КИ развитие инфекции может быть ограничено вскоре после попадания микобактерий в легкие. Если КИ не оптимален, макрофаги с поглощенными Mycobacterium tuberculosis могут выходить из гранулемы и распространяться по внутрилегочным лимфатическим и кровеносным сосудам, результатом чего может быть быстрая диссеминация. При не сбалансированном КИ иммунная система организма-хозяина постоянно борется с размножающимися микобактериями, избыточным и несвоевременным воспалением, что может сопровождаться разрушением легочной ткани и дальнейшим распространением микроорганизмов через лимфу и кровь.

выводы.

1. Показано, что ДК, выращенные в среде, содержащей эмбриональную телячью сыворотку (ДК-ЭТС) и GM-CSF (стандартная процедура), способны индуцировать Т-клеточный пролиферативный ответ in vitro и in vivo.

2. Иммунный ответ, вызванный ДК-ЭТС in vivo, не является антиген-специфическим, тогда как ДК, выращенные в присутствии мышиной сыворотки (ДК-МС), индуцируют высокоспецифичный ответ Т-клеток на микобактериальные антигены in vivo.

3. При оценке динамики иммунного ответа показано, что антиген-специфический ответ, вызванный однократным введением ДК-МС, нагруженных антигеном, сохранялся по крайней мере в течение 3 недель после подкожной иммунизации.

4. Дендритные клетки, выращенные в присутствии мышиной сыворотки, обладают фенотипом незрелых ДК, и лишь небольшой процент этих клеток экспрессирует молекулы CD11с и МНС II класса. Такие клетки не способны активировать Т-клеточный ответ in vitro.

5. При проведении сравнительного анализа ДК-ЭТС и ДК-МС показано, что в популяции ДК-ЭТС доля CDllc+ МНС П+ клеток была выше, чем в популяции ДК-МС, при этом культура ДК-ЭТС содержала больше нейтрофилов. В присутствии антигена число зрелых ДК в обеих популяциях увеличивалось. Кроме того, ДК-ЭТС продуцировали больше TNF-a, ИЛ-12, ИЛ-6, ИЛ-10.

6. Отработана оптимальная схема вакцинации мышей ДК. Показано, что эффективный протективный иммунный ответ против экспериментальной туберкулёзной инфекции развивался в результате трехкратного подкожного введения ДК.

7. Вакцинация мышей ДК-МС, нагруженными антигеном, приводила к увеличению числа клеток, продуцирующих ИФН-у, к снижению бактериальной нагрузки в лёгких и селезенке заражённых животных и к увеличению среднего времени их выживания после заражения.