Диплом, курсовая, контрольная работа
Помощь в написании студенческих работ

Количественная характеристика антителосекретирующих клеток в органах и тканях иммунной системы мышей в процессе иммуногенеза

Диссертация: Количественная характеристика антителосекретирующих клеток в органах и тканях иммунной системы мышей в процессе иммуногенеза
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Анализ литературных данных свидетельствует о том, что в настоящее время практически нет научных данных о количественном соотношении различных типов АСК в костном мозге, полученных с помощью современной методологии с применением высокоспецифических антител к отдельным эпитопам иммуноглобулинов. Недостаточно изучена роль этого органа в формировании первичного и вторичного иммунного ответа… Читать ещё >

Содержание

  • 1. ВВЕДЕНИЕ
  • 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.,
    • 2. 1. Общая характеристика органов и клеток иммунной системы
    • 2. 2. Механизмы формирования иммунного ответа
    • 2. 3. Иммунологические методы исследований
    • 2. 4. Количественная оценка различных типов клеток иммунной системы ЕЫЭРОТ-методом
  • СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
  • 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
  • 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1. Разработка методов ЕЫБРОТ и ИФА для характеристики гуморального иммунного ответа и определение общего количества антителосекретирующих клеток у интактных беспородных мышей и мышей линии ВАЬВ/с.54.

4.1.1. Выделение, очистка и идентификация вирусных антигенов.55.

4.1.2. Разработка непрямого и «сэндвич"-вариантов твердофазного ИФА.57.

4.1.3. Разработка ЕЫ8РОТ-метода для количественной характеристики АСК.58.

4.1.4. Количественная характеристика

§-М-,А-секретирующих клеток в лимфоидных органах интактных мышей.65.

4.2. Количественная характеристика антителосекретирующих клеток в органах и тканях иммунной системы мышей в процессе иммуногенеза.

4.2.1. Характеристика количественных изменений антителосекретирующих клеток в органах и тканях лимфоидной системы мышей при формировании иммунного ответа на вирусные антигены (ВТГС и РВ).68.

4.2.1.1. Характеристика иммунного ответа в периферических лимфатических узлах (паховых и подколенных).70.

4.2.1.2. Характеристика иммунного ответа в селезёнке.73.

4.2.1.3. Характеристика иммунного ответа в костном мозге.76.

4.2.1.4. Характеристика иммунного ответа в ЛТК.79.

4.2.1.5. Характеристика иммунного ответа в тимусе.81.

4.2.1.6. Динамика количественных изменений АСК в крови.84.

4.2.1.7. Динамика изменений титра вирус-специфических антител в сыворотке крови иммунных мышей.84.

4.2.2. Оценка иммуногенной активности вакцины против рожи свиней и характеристика количественных изменений антителосекретирующих клеток в процессе иммунного ответа на бактериальный антиген (Е.гЬивюраШае).86.

4.2.2.1. Характеристика иммунного ответа в периферических лимфатических узлах (паховых и подколенных).87.

4.2.2.2. Характеристика иммунного ответа в селезёнке.91.

4.2.2.3. Характеристика иммунного ответа в костном мозге.94.

4.2.2.4. Характеристика иммунного ответа в лимфоидной ткани ассоциированной со слизистыми оболочками.97.

4.2.2.5. Характеристика иммунного ответа в тимусе.99.

4.2.2.6. Количественная характеристика антителосекретирующих клеток в смыве с перитонеальной полости.102.

4.2.2.7. Количественная характеристика АСК в крови.103.

4.2.2.8. Определение уровня

§-0,1§-М, в сыворотке крови мышей после вакцинации и контрольного заражения.105.

Количественная характеристика антителосекретирующих клеток в органах и тканях иммунной системы мышей в процессе иммуногенеза (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Актуальность темы

В разработке фундаментальных и прикладных аспектов специфической профилактики болезней животных основополагающая роль принадлежит иммунологии — относительно молодой среди других биологических дисциплин, сложной, но одной из многообещающих областей науки. Развитие новых подходов к предупреждению инфекционных заболеваний, изучение механизмов иммунологической защиты животных и взаимоотношений между различными клетками иммунной системы неразрывно связаны с разработкой и внедрением новых методов и технологий, основанных на современных представлениях об эффекторных механизмах иммунитета, среди которых главное место занимает взаимодействие антиген-антитело (Петров Р.В., 1982, 1988; Грен Э. Л., Пумен П. П., 1988; Ярилин А. А., 1999; 2001).

Интенсивное развитие иммунохимии белков подтвердило важную роль иммуноглобулинов в защите организма человека и животных (Стефани Д.В., 1975; Федоров Ю. Н., 1984; Чекишев В. М., 1985; Ездакова И. Ю., 1994; Верховский О. А., 1998 и др.). Иммуноглобулины (антитела) продуцируются антителосекретирующими клетками (АСК), от количества и функционального состояния которых напрямую зависит способность организма к гуморальному иммунному ответу. АСК обнаруживаются практически во всех органах и тканях иммунной системы (Сапин М.Р. и др., 1992, Cukrowska В., 1995), однако в настоящее время остаются недостаточно изученными вопросы, связанные с изменением их количественных характеристик в процессе иммуногенеза при взаимодействии с различными типами антигенов и на разных стадиях развития иммунного ответа (Cukrowska В., 1995.). Эти сведения необходимы для изучения роли различных составляющих иммунной системы в активации и изотипическом переключении антигенспецифических плазматических В-лимфоцитов, понимания механизмов иммунологического распознавания и презентации антигенов, а также формирования иммунитета в целом.

Одним из самых эффективных методов оценки функциональной активности клеток иммунной системы в процессе онтои иммуногенеза является ELISPOT-метод (англ. enzyme-linked immunospot assay, точечный иммуноферментный анализ), разработанный двумя группами учёных для выявления и подсчёта клеток, секретирующих антитела одной определённой специфичности (Czerkinsky С.С. et al., 1983; Sedgwick J.D. and Holt P.G., 1983). В настоящее время ELISPOT-метод широко используется при проведении иммунологических исследований в медицине и ветеринарии (Чернышова И.Н. и др., 1999; Viret J.F., 1999; Sestak К. et al., 1999; Lewis P.J. et al., 1999; Jonuleit H. et al., 2000; Bacon A. et al., 2000;

Nagabhushanam V. and Cheers C., 2001 и др.). Его высокая чувствительность и специфичность позволяют выявлять одну клетку иммунной системы при наличии антител к секретируемым ей продуктам (Sedgwick J.D., 1998).

Для оценки антигенных и иммуногенных свойств традиционных, субъединичных и ДНК-вакцин, а также при фундаментальных исследованиях, чаще всего в качестве экспериментальной модели выбирают линейных или беспородных мышей. Это связано, в первую очередь, с удобством их использования, плодовитостью, неприхотливостью и возможностью использовать в сложных опытах большого количества животных. Кроме того, из всех млекопитающих мыши являются исключительным «иммунологическим» видом, что объясняется высокой степенью гомологии биологических свойств иммунной системы у человека и мыши (Хаитов P.M. и др., 2000). В ветеринарии мыши используются для оценки иммуногенности вакцин против сальмонеллеза и колибактериоза различных видов животных, диплококковой септицемии телят, ягнят и поросят, ботулизма норок, рожи свиней, а также для контроля всех биои фармпрепаратов (Осидзе Д.Ф. и др., 1981; Wood R. L et al., 1981; Takahashi Т. et al., 1984; Shimoji Y. et al., 1994; 1998; и др.).

В связи с этим актуальными являются исследования по оценке функциональной активности клеток иммунной системы мышей в норме и при патологических процессах. Изучение механизмов формирования иммунитета и роли иммунных реакций в патогенезе инфекционных болезней данного вида животных позволяет выявить наиболее общие закономерности для подобных состояний у других видов млекопитающих, в том числе и человека.

Цель работы. Количественная характеристика общих и вирус-специфических IgG-, IgM-, IgAсекретирующих клеток в лимфоидных органах и тканях мышей в процессе иммуногенеза с использованием современных методов исследования (ИФА, ELISPOT). Сравнительный анализ динамики формирования разных типов иммунного ответа (первичного и вторичного, поствакцинального и постинфекционного) на антигены различной природы на основе количественных изменений АСК.

Основные задачи исследований:

• Разработать варианты ELISPOT-метода для количественной оценки общих и антиген-специфических IgG-, IgM-, IgAсекретирующих клеток в органах и тканях лимфоидной системы мышей.

• Разработать непрямой и «сэндвич"-варианты твердофазного ИФА для определения общего уровня иммуноглобулинов и антиген-специфическихМ-, 1§-Аантител в сыворотке крови иммунных животных.

• Определить количество 1§ 0-, 1яМ-,Асекретирующих клеток в лимфоидных органах и тканях клинически здоровых интактных мышей.

• Изучить динамику количественных изменений общих и антиген-специфических АСК в лимфоидных органах и тканях мышей и содержания специфических 1§-М-, антител в сыворотке крови мышей в процессе формирования первичного и вторичного иммунного ответа на вирусные антигены, входящие в состав ассоциированной вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной инфекции свиней.

• Определить динамику изменений общего количества 1§-Асекретирующих клеток в лимфоидных органах мышей при формировании поствакцинального и постинфекционного иммунного ответа на бактериальный антиген.

• Изучить динамику количественных изменений Т-лимфоцитов (Е-РОК) в органах и тканях иммунной системы мышей в процессе иммуногенеза.

• На основании полученных результатов провести сравнительный анализ изменений параметров клеточного и гуморального иммунного ответа у мышей в лимфоидных органах и определить роль последних на различных этапах иммуногенеза.

Научная новизна работы.

Разработан чувствительный и специфичный ЕЬКРОТ-метод, предназначенный для количественной характеристики общих и антиген-специфических0-, 1§-М-, секретирующих клеток в органах и тканях иммунной системы мышей.

С помощью разноплановых методов (ЕЫБРОТ, ИФА, Е-РОК) впервые проведены комплексные исследования по изучению динамики формирования гуморального и клеточно-опосредованного иммунного ответа у мышей на антигены различной природы и патогенности. Получены новые данные о количественных измененияхО-, секретирующих клеток, Е-РОК в органах и тканях иммунной системы на отдельных этапах иммуногенеза.

Впервые дана количественная характеристикаО-, секретирующих клеток в лимфоузлах, селезенке, костном мозге, лимфоидной ткани слизистых оболочек, крови и тимусе мышей в процессе формирования поствакцинального и постинфекционного иммунного ответа.

На основании сравнительных исследований получены новые фундаментальные данные и подтверждены некоторые закономерности изменений клеточного состава лимфоидных органов и тканей в процессе иммуногенеза. Показана ведущая роль лимфоузлов, селезенки и костного мозга мышей, как главных органов развития 1§—СК, при формировании основных типов иммунного ответа.

Практическая значимость исследований.

Разработанный ЕЫБРОТ-метод может использоваться в качестве основного метода определения количества как общих, так и антигенспецифических АСК в органах и тканях иммунной системы мышей. При этом установленные значения общего количества 10-, 1§-М-,Асекретирующих клеток в лимфоидных органах клинически здоровых интактных животных могут служить нормативными показателями.

Полученные результаты являются основой для дальнейших фундаментальных исследований по изучению механизмов и закономерностей формирования иммунного ответа у животных на антигены различной природы.

На основании проведенных исследований разработаны, апробированы и рекомендованы для использования в НИУ «Методические рекомендации по количественному определению антителосекретирующих клеток методом точечного иммуноферментного анализа (ЕЫ8РОТ-метод)» (рассмотрены и одобрены на заседании секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии 21 декабря 2000 г. протокол № 3).

Основные положения, выносимые на защиту.

Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения:

• результаты исследований по разработке ЕЫЗРОТ-метода для количественной оценки общих и антиген-специфическихО-, 1§-М-, 1§-Асекретирующих клеток в органах и тканях лимфоидной системы мышей;

• результаты экспериментов по изучению динамики количественных изменений общих и антиген-специфических 1^, 0-, 1§-М-,Асекретирующих клеток в лимфоидных органах и тканях мышей при различных типах иммунного ответа на антигены вирусной и бактериальной природы с использованием разработанных современных методов исследований для характеристики В-системы иммунитета (ЕЬКРОТ и ИФА) и Т-системы (метод Е-РОК);

• результаты сравнительных исследований содержания АСК и РОК в органах и тканях лимфоидной системы иммунных и неиммунных мышей в процессе иммуногенеза после заражения патогенным штаммом Е. гктюраШае с использованием современных методов ЕЬКРОТ, ИФА и Е-РОК.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы представлены на:

• 26-м Ветеринарном конгрессе, Франция, 1999;

• II Международной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 2000;

• заседании секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины РАСХН, Москва, 2000;

• заседании учёного совета ВИЭВ, Москва, 2000;

• У1-м международном ветеринарном иммунологическом конгрессе, Швеция, 2001;

• межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ, Москва, 2002.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано десять научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 136 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка цитированной литературы. Материалы диссертации иллюстрированы одной схемой, б таблицами и 35 рисунками.

Список литературы

включает 163 источника (49 отечественных и 114 зарубежных авторов).

6.ВЫВОДЫ.

1. Разработаны непрямой и «сэндвич"-варианты точечного иммуноферментного анализа (ELISPOT-метода, англ. enzyme-linked immunospot assay), предназначенные для количественной характеристики общих и вирус-специфических IgG-, IgM-, IgA-секретирующих клеток в центральных и периферических органах иммунной системы мышей. Показано, что метод характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью и воспроизводимостью результатов.

2. Дана количественная характеристика IgG-, IgM-, IgAсекретирующих клеток в центральных и периферических органах иммунной системы мышей. Установлено, что среди всей популяции антителосекретирующих клеток в исследованных органах иммунной системы преобладающими являются IgMи IgG-секретирующие клетки. IgA-CK являются доминирующими в лимфоидной ткани лёгкого.

3. Разработан непрямой вариант твердофазного ИФА для определения общего уровня иммуноглобулинов IgG-, IgM-, IgA-изотипов и вирус-специфических антител в сыворотке крови иммунных животных, оптимизированы условия постановки метода спонтанного розеткообразования (Е-РОК) для характеристики Т-системы иммунитета.

4. Комплексными исследованиями с использованием ELISPOT-метода, ИФА и Е-РОК, определена динамика формирования первичного и вторичного иммунного ответа у мышей на вирусные антигены, входящие в состав ассоциированной вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной инфекции свиней. Определено количество общих и вирус-специфических IgG-, IgM-, IgAСК и розеткообразующих клеток в лимфоидных органах, а также титр IgG-, IgM-, IgA-антител в сыворотке крови иммунных животных.

5. Установлено, что доминирующая роль в первичном иммунном ответе на ВТГС и РВ принадлежит лимфатическим узлам, селезенке и частично лимфоидной ткани слизистых оболочекво вторичном иммунном ответе ведущая роль принадлежит костному мозгу, как органу синтеза антителосекретирующих клеток (АСК). При этом в процессе иммуногенеза максимальное количество вирус-специфических АСК установлено в лимфатических узлах на 2−3-е сутки первичного и на 3−5-е сутки вторичного иммунного ответа, в селезенке — на 4-е (для IgM-CK) — 7-е (для IgG-CK) и на 1−3-е сутки соответственно. В ЛТК максимальное количество вирус-специфических АСК зарегистрировано на 2-е (для IgM-CK), 7-е (для IgG-CK) и на 9-е (для IgA-CK) сутки первичного иммунного ответа. В костном мозге максимальное количество вирус-специфических АСК обнаружено на 4−7-е сутки вторичного иммунного ответа.

6. Экспериментальными исследованиями установлено, что достоверное увеличение или уменьшение вирус-специфических IgMи 1§-АСК в лимфоидных органах мышей в процессе иммуногенеза положительно коррелирует (г=0,86, р<0,05) с количеством розеткообразующих клеток. При первичном иммунном ответе динамика появления, логарифмического роста и снижения титра изотип-специфических антител в сыворотке крови положительно коррелирует с количеством соответствующих по специфичности 1§-М-, 1^А-СК в селезенке (г=0,68).

7. В опытах по оценке иммуногенной активности вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2 определено общее количество 10-, 1§-М-,Асекретирующих клеток и Е-РОК в лимфоидных органах у мышей в процессе формирования поствакцинального и постинфекционного иммунного ответа. Установлено, что поствакцинальный иммунный ответ сопровождается увеличением общего числа секретирующих клеток в лимфатических узлах, селезенке, ЛТК и в крови. В 1−7-е сутки после иммунизации в количественном отношении в лимфатических узлах, селезенке и крови преобладаютМ-СК. Показано, что в постинфекционном иммунном ответе наряду с лимфоузлами и селезёнкой значительная роль в продукции плазматических Вклеток принадлежит костному мозгу.

8. Установлены закономерности в развитии иммунокомпетентных клеток в процессе иммуногенеза, которые позволяют разделить первичный иммунный ответ на несколько стадий. На первой стадии после введения антигена в лимфоидных органах происходит увеличение количества неспецифических АСК. На второй стадии происходит уменьшение количества АСК и появление первых антиген-специфическихО-антител в крови. Третья фаза иммуногенеза характеризуется повторным увеличением количества АСК за счёт антиген-специфических клеток и возрастанием титра специфических антител в крови. Первые две стадии характеризуют индуктивную фазу иммуногенеза, а третьяпродуктивную.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Разработанный ЕЫЗРОТ-метод рекомендуется в качестве основного метода, определения как общего количества, так и антиген-специфических АСК в органах и тканях иммунной системы мышей. При этом установленные значения общего количества 1§ 0-,М-, ^Асекретирующих клеток в лимфоидных органах и тканях клинически здоровых интактных животных могут служить ориентиром при оценке иммунного ответа на антигены различной природы.

На основании проведенных исследований разработаны и рекомендованы для использования в НИУ «Методические рекомендации по количественному определению антителосекретирующих клеток методом точечного иммуноферментного анализа (ЕЬШРОТ-метод)» (рассмотрены и одобрены на заседании секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии 21 декабря 2000 г. протокол № 3).

5.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Основной целью нашей работы являлось выявление динамики количественных изменений IgG-, IgM-, IgAсекретирующих клеток в органах и тканях иммунной системы мышей в процессе иммунного ответа на антигены различной природы.

Для решения поставленных задач необходимы чувствительные и специфичные методы соответствующего назначения, поэтому первым этапом нашей работы была разработка непрямого и «сэндвич"-вариантов ELISPOT-метода и ИФА.

ELISPOT-метод является вариантом ИФА и в настоящее время применяется для оценки клеточного и гуморального звеньев иммунной системы в процессе онтои иммуногенеза. Он широко используется для характеристики иммуногенных свойств вакцинных препаратов, оценки функционального состояния иммунной системы, ее отдельных тканей и органов, изучения механизмов регуляции иммунного ответа [Makela M.J., Nikkari S., Meurman О. et al., 1995; Arvilommi H., 1996; Daugaharty H., Messmer Т.О., Fields B.S., 1997; Sedgwick J.D., 1998; и др.]. Однако, наряду с высокой чувствительностью и информативностью метода, исследования, связанные с его разработкой для каждого конкретного антигена и практическое применение, являются довольно трудоемкими и в настоящее время, это является основным сдерживающим фактором его широкого внедрения в практику [Cui Y., Chang L.J., 1997].

При проведении исследований в целях повышения специфичности метода мы получали высокоочищенную суспензию мононуклеарных клеток в одноступенчатом градиенте плотности Histopaque, благодаря которому присутствие клеток других типов (кроме МНК) в исследуемой суспензии практически исключалась. Кроме того, для повышения эффективности всех иммуноферментных методов (ИФА и ELISPOT), нами использовались очищенные препараты РВ и ВТГС, а также коммерческие моноспецифические реагенты к отдельным изотипам иммуноглобулинов мыши, меченые биотином, и авидин, коньюгированный с пероксидазой. Методы, основанные на использовании системы авидин-биотин, являются очень чувствительными, поскольку авидин, являясь биологическим антагонистом биотина, специфически замещает его во всех химических соединениях [Fujihashi К., McGhee J.R., Beagley K.W. et al., 1993].

Однако эффективность использования системы авидин-биотина в ELISPOT-методе требовала дополнительных исследований, поскольку существовала вероятность появления ложноположительной реакции. Это связано с тем, что биотин (витамин Н) является составной частью дыхательных ферментов клетки и присутствует в ней в большом количестве. Можно было предположить, что при специфическом его замещении, авидин, коньюгированный с пероксидазой, окажется связанным не только с мечеными антителами, но и с ферментами клеток, которые не являются АСК.

Результаты проведенных исследований и анализ размеров окрашенных точек, полученных на нитроцеллюлозной мембране, позволили сделать вывод о том, что при использовании малого увеличения (х40) возможность подсчёта неспецифически окрашенных точек очень мала, так как антитела, секретируемые АСК, покрывают гораздо большую площадь НЦмембраны, нежели занимает, даже очень крупная клетка. Таким образом, точки, характеризующие АСК, выглядят значительно крупнее.

Специфичность моноспецифических антисывороток к IgG, IgM, IgA мыши, меченых биотином и авидин-пероксидазных коньюгатов была проверена нами в предварительных опытах при подборе их оптимальных разведений для постановки метода. В результате был сделан вывод о том, что реагенты неспособны к неспецифическому взаимодействию между собой. Для всех опытов был подобран инертный блокирующий белок — Б С А, применение которого практически исключало появление неспецифических точек (при оптимальных условиях подбора реагентов неспецифические точки не видны). О чувствительности метода говорит тот факт, что мы смогли определить АСК в крови, тимусе и перитонеальной полости, где они в большинстве своем находятся в неактивном состоянии и являются преимущественно CD5 В1-клетками [Inaba М. et al., 1988; CukrowskaB. et al, 1995].

Таким образом, в результате проведения первого этапа нашей работы были разработаны непрямой и «сэндвич"-варианты ELISPOT-метода, предназначенные для подсчета общего количества и вирус-специфических IgG-, IgM-, IgAсекретирующих клеток в органах и тканях лимфоидной системы мышей. Получены убедительные данные, свидетельствующие о том, что ELISPOT является высокочувствительным, специфичным, информативным и воспроизводимым методом количественного определения АСК.

Перед проведением каждой серии экспериментов с помощью разработанного метода было определено общее количество IgG-, IgM-, IgAсекретирующих клеток в лимфоидных органах и тканях клинически здоровых интактных мышей линии BALB/c, а также беспородных белых мышей, использовавшихся в качестве отрицательного контроля (таблица 4). Результаты исследований показали, что больше всего плазматических Влимфоцитов содержится в селезенке (средние значения составляли: IgG-CK- 298±57, IgM-CK- 357±49, IgA-CK- 189±32 клеток на 104 МНК), лимфатических узлах (191+51, 245+59 и 172+35 клеток соответственно) и костном мозге (195+36, 244+52 и 127+24 клеток соответственно). В перитонеальной полости (IgG-CK- 84+25, IgM-CK- 192+43, IgA-CK- 40+23 клеток на 104 МНК), ЛТЛ (127+16, 59+25, 140+30 клеток соответственно), ЛТК (53+32, 64+44, 44+21 клеток соответственно) и крови (34+23, 76+37, 15+9 клеток соответственно) эти показатели были ниже. Минимальное количество 10-,Асекретирующих клеток было обнаружено в тимусе (13±15-С-, 14±13М- 119±-8бА-СК на 104 МНК).

Наши дальнейшие исследования были направлены на использование разработанного ЕЫБРОТ-метода в экспериментах по оценке В-системы иммунитета у мышей в процессе иммуногенеза на клеточном уровне и определение роли отдельных лимфоидных органов мышей в динамике формирования иммунного ответа на основе количественных изменений общих и вирус-специфическихО-, СК.

Исследования проводили в двух направлениях:

• определение динамики содержания общих и вирус-специфическихО-, ^М-,АСК в лимфоидных органах мышей, титра изотипспецифических антител в сыворотке крови животных в процессе формирования первичного и вторичного иммунного ответа на вирусные антигены, входящие в состав ассоциированной вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной инфекции свиней;

• оценка иммуногенной активности вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2 и определение динамики содержания общего количестваМ-, 1§-Асекретирующих клеток в различных лимфоидных органах мышей в процессе формирования поствакцинального и постинфекционного (после экспериментального заражения вирулентным штаммом Е. rhusiopa.th.iae) иммунного ответа.

Как известно, количество клонов активированных Влимфоцитов зависит не только от существующей популяции Вклеток, но и от АПК и субпопуляций Тлимфоцитов. Поэтому, для более углубленного изучения механизмов формирования иммунного ответа во всех проведенных нами экспериментах, испытуемые пробы параллельно исследовались как в ЕЫБРОТ-методе, так и методом Е-РОК, что позволило охарактеризовать не только гуморальное, но и клеточное звено иммунного ответа.

В результате проведённых опытов были получены данные в динамике развития иммунного ответа по каждому исследованному органу и ткани иммунной системы.

Сравнительный анализ полученных результатов позволил заключить, что динамика формирования гуморального иммунного ответа в центральных и периферических лимфоидных органах мышей на антигены различной природы, характеризующаяся количественными изменениями общих и вирус-специфических 1§-М-, АСК и Е.

РОК, имеет ряд аналогичных закономерностей.

Во-первых, антигенная стимуляция приводила к повышению количества как общих, так и специфических АСК. Это совпадает с мнением Е. В. Сидоровой (1993) и И. Н. Чернышевой с соавт. (1999), которые в своих экспериментах на мышах показали, что введение антигена индуцирует как синтез специфических антител, так и резкое повышение образования неспецифических иммуноглобулинов.

Во-вторых, в процессе формирования иммунного ответа принимали участие практически все лимфоидные органы и ткани, при этом основная роль принадлежала лимфатическим узлам, селезенке и костному мозгу, которые являются главными органами синтеза АСК.

И, в-третьих, процесс формирования и угасания первичного (однократное введение ассоциированной вакцины против ВТГС и РВ, вакцинация против рожи свиней) иммунного ответа В-клеток у мышей можно разделить на фазы. Первая фаза, по нашим данным, характеризовалась увеличением количества АСК всех изотипов и продолжалась с 1 до 4-х сут. после антигенной стимуляции (для разных органов и антигенов сроки могли несколько варьировать). Возможно, что это увеличение количества антителосекретирующих клеток может быть связано с опосредованной их стимуляцией, через цитокины АПК, которые первыми отвечают на антигенное воздействие и выделяют интерлейкины, стимулирующие все МНК, ранее активированные другими антигенами. Также следует учесть тот факт, что исследованные нами животные не являлись гнотобиотами, и можно предположить, что мы наблюдали не абсолютный первичный ответ, а на какую-то часть вирусных антигенов ответ уже был вторичным. Вероятность этого достаточно велика, поскольку на фоне увеличения общего количества 1§-М-,Асекретирующих клеток было зарегистрировано увеличение количества и вирус-специфических АСК. Наличие у контрольных мышей во всех органах иммунной системы вирус-специфических АСК можно объяснить, наличием нестимулированных клонов клеток с различными антигенными рецепторами и специфичностью, а также вероятностью того, что животные уже однажды встречались с антигенно-родственными вирусами (см. раздел 4.2.). В наших последующих опытах по характеристике ответа секретирующих клеток на бактериальный антиген, в рассматриваемый период времени были получены сопоставимые результаты. Антиген-специфические АСК при исследовании ответа на бактериальный антиген мы не определяли, но поскольку культура Е. тки$юраШае для мышей была патогенна (проводили контрольное заражение штаммом 1329), вызывает сомнение в том, что опытные животные могли встретиться с её антигенами до иммунизации. При этом следует отметить, что динамика изменения количества ]?- секретирующих клеток при ответе на бактериальный антиген, несколько отличалась от таковой при иммунном ответе на вирусный антиген. Возможно, при этом определённую роль играет структурный состав антигена, его патогенность, доза введения и наличие примесных белков, входящих в состав вакцин.

Вторая фаза первичного иммунного ответа характеризовалась уменьшением количества АСК в период с 3 по 5-е сутки. В зависимости от органа, сроки этого процесса могли сдвигаться до 7-х сут. после антигенной стимуляции. У некоторых животных в эти периоды количество АСК было сопоставимо с контрольными показателями. По нашему мнению, это связано с процессами пролиферации активированных клонов незрелых клеток и клеток-предшественников в ответ на антигенную стимуляцию. Таким образом, в этот период популяция МНК пополнялась большим количеством клеток, которые либо не определялись методом ELISPOT, либо мы их не принимали во внимание при учёте реакции (в связи с мелким размером точки). Т. И. Дергачёва с соавт. (2000) связывают процессы изменения количества клеток определённых специфичностей с их миграцией из органов иммунной системы, что, возможно, имело место и в наших опытах.

Третья фаза выделялась в период с 5-х суток после иммунизации и до конца срока наблюдения и характеризовалась повторным увеличением количества АСК с последующим его уменьшением, свидетельствующим об окончании первичного иммунного ответа. В это время увеличение количества АСК практически во всех органах происходило за счёт клеток антиген-специфических клонов.

При вторичном иммунном ответе вышеперечисленные фазы и процессы происходили в течение не более 5-ти суток и регистрировались не во всех органах. Например, в лимфатических узлах мы установили лишь один период увеличения и уменьшения количества АСК. Таким образом, мы предполагаем, что рассмотренные выше фазы характерны в большей степени для первичного иммунного ответа и их выраженность зависит от природы антигена.

Зависимость, подобная изменениям АСК, была нами установлена и для Т-клеток. Однако метод Е-РОК не позволяет определить, за счёт какой субпопуляции происходит изменение их количества в суспензии МНК, поскольку С02-рецептор имеется у всех Т-лимфоцитов и части NK-клеток. Тем не менее, мы предполагаем, что увеличение происходило, главным образом, за счёт CD4+ ТЬ2-лимфоцитов, ответственных за формирование гуморального иммунитета. Косвенно это подтверждается увеличением количества АСК и использованием в качестве модели мышей линии BALB/c, которые генетически более склонны к гуморальному иммунному ответу, нежели клеточному [Shibuya К., Robinson D., Zonin F., et al. 1998].

Следует отметить, что подобных столь подробных исследований по изучению динамики формирования иммунного ответа в лимфоидных органах и тканях на клеточном уровне до настоящего времени практически не проводилось. Поэтому, некоторые полученные нами данные ещё нуждаются в подтверждении.

В процессе проведения экспериментов, нами отмечен тот факт, что в ряде случаев большое количество АСК не свидетельствует о высоком уровне антител в супернатанте МНК (обычно в первые дни после иммунизации). На наш взгляд, это связано с тем, что не все выявляемые ЕЫЗРОТ-методом клетки являются активными АСК. Например, титрО-антител в супернатанте МНК, как правило, был значительно выше, чем титр 1§ М-антител даже в случае незначительной разницы в количестве клеток. По-видимому, это связано с тем, что в лимфоидных органах постоянно присутствуют незрелые В1-клетки, которые, как известно, секретируют только 1§-М. Такие клетки синтезируют очень незначительное количество иммуноглобулина, по сравнению сО-секретирующими, которые являются полноценными АСК. Незрелая В-клетка имеет на своей мембране антигенные рецепторы в виде 1§-М, при её взаимодействии с сенсибилизированной НЦ-мембраной лунки, эти рецепторы собираются на одном полюсе клетки в виде «шапочки», и остаются связанными с НЦ-мембраной после отмывания клетки [Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д., 2000]. Косвенным образом это подтверждается значительной вариабельностью размеров точек на нитроцеллюлозной мембране. По нашему мнению, чем больше точка — тем активней клетка. Однако, достоверную статистическую зависимость уровня антител в супернатанте от размера точек нам выявить не удалось.

Одной из главных задач, стоящей перед нами, было проведение сравнительного анализа динамики формирования различных типов иммунного ответа и определение роли различных лимфоидных органов мышей в процессе иммуногенеза. Для этого нами были проведены исследования, направленные на изучение количественных изменений общих и антиген-специфическихМ-, ^АСК и Е-РОК в лимфоидных органах мышей в процессе иммуногенеза и получены новые данные, позволяющие оценить их значение в продукции активированных клеток в ответ на вирусные и бактериальный антигены. Результаты сравнительного анализа распределения секретирующих клеток и Е-РОК позволили заключить следующее.

На ранней стадии иммунного ответа (как первичного, так и вторичного) основную роль в иммуногенезе играли лимфатические узлы. Установлено, что уже через 24 часа после иммунизации мышей (как ассоциированной вакциной против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной инфекции свиней, так и вакциной против рожи свиней) в лимфоузлах происходило резкое увеличение количества общих и вирус-специфическихМ-СК, пик которых зарегистрирован на 1−3 сутки после инъекции вакцин. На этом фоне, происходило постепенное увеличение количества 1§-0-СК, и незначительное увеличение 1§ А-СК. Достоверное увеличение изотипспецифических АСК сопровождалось активным синтезом антител соответствующей специфичности, выявляемых в супернатанте культивируемых МНК. Появление первых вирус-специфическихМ-и 1§-0-антител в сыворотке крови (приблизительно через 72 часа после инъекции) по времени совпадает с максимальным количеством вирус-специфических АСК в лимфоузлах.

Первичный иммунный ответ в селезенке характеризовался повышением как общего количества секретирующих клеток, так и количества вирус-специфических АСК. Достоверное увеличение числа вирус-специфических АСК всех изотипов начиналось на 2-е сутки после инъекции вакцины, максимальное значение их зафиксировано на 7-е сутки п.и., затем количество АСК, начинало постепенно уменьшаться. При этом полученные результаты свидетельствуют о том, что увеличение общего количества 10-, 1§-М-,А-секретирующих клеток происходило, главным образом, за счёт вирус-специфических клеток. Увеличение вирус-специфических 1§-МиО-СК в селезенке совпадало с повышением уровня вирус-специфических антител данных изотипов в сыворотке крови иммунизированных животных (2−4-е сутки для 1§-М и 7−9-е для 1§ 0).

Процесс окончания первичного иммунного ответа в селезенке начинался на 9−12 сутки п.и. и продолжался в течение всего срока наблюдения (до 18-х суток). При этом, происходило значительное снижение количества Е-РОК,Ми 1§-0-СК и резкое падение титра специфических антител к ВТГС и РВ в сыворотке крови иммунизированных животных. Вместе с тем, достаточно высокий уровеньО-антител (титр 1:200−1:400) сохранялся и на 18-е сутки после первичного введения антигена.

При вторичном иммунном ответе в селезёнке мышей, иммунизированных ассоциированной вакциной, не наблюдалось значительного увеличения количества АСК, однако, в сыворотке крови уровень вирус-специфических антител всех изотипов увеличивался к 5-м суткам после иммунизации. Иммунный ответ в селезёнке мышей, вакцинированных против рожи свиней и зараженных вирулентным штаммом Е. гкшюраШае (можно рассматривать как вторичный ответ), проходил несколько иначе. Нами установлено, что на 7-е сутки п.з. у иммунизированных животных общее количество секретирующих клеток было сопоставимо с количеством 1§ 0- СК в костном мозге. На наш взгляд, это может быть связано с тем, что в зависимости от вирулентности антигена и его локализации в организме, могут изменяться сроки формирования вторичного иммунного ответа (в последнем случае 7-е сутки п.з. являются сроком наблюдения, что, по-видимому, недостаточно), также как и приоритетность лимфоидных органов в продукции АСК.

Анализ литературных данных свидетельствует о том, что в настоящее время практически нет научных данных о количественном соотношении различных типов АСК в костном мозге, полученных с помощью современной методологии с применением высокоспецифических антител к отдельным эпитопам иммуноглобулинов. Недостаточно изучена роль этого органа в формировании первичного и вторичного иммунного ответа у животных в процессе иммуногенеза. Вместе с тем его значение для функционирования иммунной системы огромно. Так, по мнению C.A.Janeway et al. (1999), костный мозг является важным местом продукции IgGантител. У гипериммунизированных животных, продуцирующих специфические IgGантитела в ответ на антигенную стимуляцию, до 90% антител секретируются плазматическими клетками в костном мозге. Е. И. Соколов и др. (1998) приводят данные о том, что у взрослой мыши в костном мозге сосредоточено до 80% всех клеток, секретирующих иммуноглобулины. При этом, следует отметить тот факт, что большинство исследований, направленных на подсчет специфических АСК в костном мозге, было проведено с использованием метода гемолитических бляшек по Jerne, который имеет существенные ограничения для детекции клеток, секретирующих антитела, направленные к растворимым антигенам [Scheffel J.W., Setcavage Т.М., Kim У.В., 1979; Bianchi A.T.J., Sholten J.W., Jongenelen I.M.C.A., Koch G, 1990].

Впервые нами были проведены широкомасштабные исследования, направленные на изучение количественных изменений общих и вирус — специфических IgG-, IgM-, IgAАСК и Е-РОК в костном мозге мышей в процессе иммуногенеза и получены новые данные, позволяющие оценить значение этого центрального органа иммунной системы в продукции активированных клеток.

Ранее костный мозг никогда не считался таким же общепризнанным местом синтеза антител, как селезенка, лимфатические узлы и ЛТК после первичной иммунизации. Вероятно это связано с тем, что синтез антител в костном мозге зависит от наличия Вклеток памяти, поэтому в процессе формирования первичного иммунного ответа количество АСК, определяемое методом гемолитических бляшек, почти не определялось или же было весьма незначительно. С помощью ELISPOT-метода, используя специфические антитела и систему биотин-авидин, мы показали, что костный мозг является не только основным органом, синтезирующим АСК во вторичном иммунном ответе, но и принимает участие в формировании первичного ответа. Анализ полученных нами результатов свидетельствует о том, что на различных этапах поствакцинального (первичного) иммунного ответа в костном мозге мышей (иммунизированных как ассоциированной вакциной против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной инфекции свиней, так и вакциной против рожи свиней) зарегистрировано более чем двукратное увеличение количества общих и вирус-специфических АСК. Вместе с тем, анализ роли костного мозга, как органа продукции АСК, по сравнению с двумя важнейшими лимфоидными органами — селезенкой и лимфоузлами, позволяет заключить, что именно лимфоузлы и селезенка играют доминирующую роль в первичном иммунном ответе.

Наиболее вероятным объяснением активности вирус-специфических АСК костного мозга после первой инъекции является то, что во всех экспериментах до иммунизации в этом органе были обнаружены специфические АСК. Иными словами, возможно, что на самом деле такая реакция относится ко вторичному ответу. Цитированные выше авторы установили, что удаление селезенки предотвращает появление АСК в костном мозге, из-за прекращения миграции активированных антигеном В-клеток памяти из селезенки в костный мозг. В этом случае лимфоузлы способны заменить селезенку. После чего было сделано предположение о том, что для появления АСК в костном мозге, антиген должен присутствовать не только в нем, но и в периферических лимфоидных органах.

Немногочисленные литературные данные и результаты проведенных опытов свидетельствуют о том, что и вторичный иммунный ответ можно разделить на несколько фаз. Первая фаза (продолжительность 1−3 суток) характеризуется значительным увеличением АСК всех изотипов в лимфоузлах, костном мозге и селезенке. Ранее зарубежными авторами с помощью метода гемолитических бляшек было показано, что в первой фазе вторичного иммунного ответа в селезенке значительно больше АСК, чем в костном мозге, а во второй фазе число таких клеток в костном мозге значительно больше, чем во всех других органах вместе взятых. Образующиеся при этом в костном мозге антитела относятся как к IgM-, так и к IgGи IgA-изотипам [Лефковитс И., Пернис Б., 1983; Janeway С.A. et al., 1999].

Наши результаты, полученные с помощью ELISPOT-метода, свидетельствуют о том, что действительно, начиная с 4−6 суток после повторной антигенной стимуляции, костный мозг является главным местом синтеза антител. Однако и в первой фазе он играет важную роль в иммунном ответе. При этом, по нашим данным (на модели ассоциированной вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной инфекции свиней) общее количество изотипспецифических АСК в селезенке было значительно меньше чем в костном мозге. Однако, как уже было описано ранее, у мышей, иммунизированных вакциной против рожи свиней и зараженных вирулентным штаммом Е. rhusiopathiae, общее количество IgGсекретирующих клеток на 7-е сутки п.з. в костном мозге и в селезенке было приблизительно одинаковым. Достоверная разница наблюдалась в соотношении IgM-CK (1750 клеток на 104 МНК в костном мозге и 700 клеток в селезенке) и Е-РОК (32% в костном мозге и 5% клеток в селезенке соответственно). В любом случае, суммируя полученные нами и цитированными выше исследователями данные, можно заключить, что костному мозгу принадлежит ведущая роль во вторичном иммунном ответе.

В процессе формирования вторичного иммунного ответа резкое увеличение количества общих и вирус-специфических IgG-, IgM-, IgAи Е-РОК в костном мозге закономерно приводило к адекватному повышению титра вирус-специфических антител в сыворотке крови животных. Уровень антител сохранялся на высоком уровне достаточно длительное время на фоне постепенного снижения количества АСК в костном мозге, которое, по-видимому, объясняется, во-первых, поступлением этих клеток в кровь и последующей их миграцией и, во-вторых, за счёт пролиферации и увеличения количества других клонов клеток, также относящихся к МНК.

При проведении экспериментов нами были обнаружены общие и вирусспецифические IgG-, IgMи IgAАСК в тимусе. Сам по себе этот факт не представляет ничего удивительного. Уже первые исследования клеточного состава тимуса показали наличие в нём В-клеток [Sainte-Marie G., 1965; Hawarg W.S. et al., 1974; Lennert K., Keiserling E., Muller-Hermelink H., 1975; Kendall M.D., 1981], что объяснимо с позиции современного представления о регуляции иммуногенеза. В настоящее время доказано, что созревание и активация Т-лимфоцитов невозможны без их взаимодействия с антиген-стимулированными В-клетками. Таким образом, становится очевидным, что основным назначением тимических В-клеток является участие в активации тимоцитов и, скорее всего, активированные В-клетки попадают в тимус, как и в костный мозг, из лимфатических узлов и селезёнки. В ранних исследованиях, данные по АСК тимуса авторы пытались получить с помощью метода гемолитических бляшек. Однако, в силу малой активности тимических АСК, получить достоверные результаты с помощью этого метода не удалось. Только с появлением ELISPOT-метода началось изучение количественных изменений АСК в тимусе на качественно новом уровне (B.Cukrowska et al., 1996).

Более интересным является тот факт, что в супернатанте МНК тимуса нами установлен достаточно высокий уровень антител, обнаруживаемых методом ИФА, несмотря на то, что в настоящее время известен фактор, выделяемый некоторыми тимическими клетками, который тормозит созревание и функционирование В-лимфоцитов в качестве полноценных АСК. Это можно объяснить только одним: клетки, выделяющие этот фактор, не относятся к мононуклеарным и при выделении МНК в градиенте плотности, в суспензию не попадают, а в его отсутствие ничто не мешает антиген-стимулированным АСК выполнять свои функции in vitro.

Таким образом, наши данные подтверждают, во-первых, наличие активированных В-клеток в тимусе, и, во-вторых, то, что тимические клетки активируются в те же периоды, что и клетки в остальных лимфоидных органах. При этом увеличение количества тимических АСК совпадало с увеличением количества розеткообразующих клеток.

При анализе изменений общего количества Ig-секретирующих клеток всех изотипов и вирус-специфических АСК, установлено, что точное совпадение сроков увеличения количества-СК наблюдается только у 1^М-СК (на 2-е сутки после иммунизации). Увеличение же количества вирус-специфических 1§-0-АСК сопровождается снижением общего количества клеток данного изотипа. Из этого можно сделать вывод, что за счёт вирус-специфических АСК увеличивается только общее количество 1§-Мсекретирующих клеток, увеличение же количества клеток других изотопов связано, видимо, с их неспецифической стимуляцией.

Впервые нами были проведены исследования и показана возможность изучения на мышах иммунного ответа АСК слизистых оболочек кишечника и лёгких. Получены данные по количественному определениюО-, 1§-М-, 1§-Асекретирующих клеток в перитонеальной полости и в крови опытных и контрольных животных. Установлено, что первичный иммунный ответ на ВТГС и РВ в лимфоидной ткани кишечника сопровождается изменением количества вирус-специфических АСК всех изотипов. При вторичном иммунном ответе значительных изменений не установлено. При изучении иммунного ответа на бактериальный антиген, нами выявлены изменения в содержанииМ-, ^А-секретирующих клеток в ЛТК с 1 по 7-е сутки п.и., при этом в количественном отношении преобладалиАСК. Таким образом, следует отметить интересный факт, что, по нашим данным, АСК ЛТК также принимают участие в иммунном ответе на антиген, введённый парентерально.

При проведении экспериментов мы также обнаружили значительное количество АСК и Е-РОК в лимфоидной ткани легких и перитонеальной полости. Однако полученные данные по этим двум органам еще требуют дополнительного уточнения и подтверждения. Очевидно, что ЛТЛ представляет собой очень интересный объект для исследований, особенно при использовнии патогенов с тропизмом к респираторному тракту. Примером исследований в этом направлении может служить работа А. Васоп й а1. (2000), которые изучали иммуномодулирующий эффект биополимеров (хитозана и джелана) введенных в состав субъединичной вакцины против вируса гриппа. В качестве модели авторы использовали мышей ВАЬВ/с, вакцинированных различными способами и препаратами, иммуногенную активность которых оценивали по количеству вирусспецифических АСК в ЛТЛ и титру антител в сыворотке крови и носовых секретах.

Помимо ЛТЛ вызывает интерес и определение АСК в перитонеальной полости. Результаты нашей работы и проведенный анализ литературы не позволяют однозначно ответить на вопрос, являются ли обнаруженные нами АСК циркулирующими или они составляют постоянную популяцию в перитонеальной полости.

При проведении экспериментов, направленных на определениеО-, 1§-М-,А-секретирующих клеток и антител в крови, нами установлено, что АСК в крови, также как и специфические антитела в сыворотке присутствовали непостоянно, а появлялись в определённые фазы иммунного ответа.

Сравнительный анализ динамики формирования иммунного ответа у вакцинированных и интактных мышей в первые сутки после заражения вирулентным штаммом Е. гктюраШае показал, что увеличение количества 1§ 0-, 1§-М-,А-секретирующих клеток у интактных животных происходит в лимфатических узлах, а у вакцинированных — в селезёнке и костном мозге (эти органы наиболее активны при повторной встрече с антигеном). Максимальное количество АСК всех изотипов было зарегистрировано через шесть часов после заражения. При этом доминирующими были 1§ М-секретирующие клетки. На наш взгляд, это связано с тем, что макрофаги при первой встрече с антигеном, представляющим сложность для процессинга и презентации, выделяют цитокины, приводящие к стимуляции всех клонов АСК, а не только антиген-специфических. Таким образом, были стимулированы все активированные на данный момент АСК лимфоузлов. Наши результаты по данному разделу работы не позволяют однозначно заключить, развивался ли иммунодефицит В-системы иммунитета у интактных мышей перед гибелью или адекватная иммунная реакция организма на заражение не успевала развиться. Также не совсем понятна ситуация с предварительно иммунизированными животными. На фоне значительного увеличения количестваО-, ^М-,Асекретирующих клеток на 3−7-е сутки после заражения у вакцинированных мышей наблюдалось снижение уровня сывороточного (хотя его уровень был выше, чем в контроле).

Таким образом, в результате проведенных нами экспериментов, изучена динамика формирования гуморального иммунного ответа у мышей на клеточном уровне после однои двукратного введения ассоциированной вакцины против ВТГС и РВ и вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2 с последующим экспериментальным заражением Е. гЫторсйЫае. Определена роль различных лимфоидных органов мышей в процессе формирования гуморального иммунного ответа на разных стадиях иммуногенеза. Сравнительный анализ полученных данных показал сходство и различия в процессе формирования иммунного ответа на антигены различной природы и патогенности. Установлено, что лимфатические узлы и селезенка играют доминирующую роль в формировании первичного (после введения ассоциированной вакцины против ВТГС и РВ) и поствакцинального (после введения вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2) иммунного ответа, в котором также принимают участие костный мозг и ЛТК. При этом отмечено, что первичный иммунный ответ можно разделить на периоды увеличения и уменьшения количества АСК. Во вторичном иммунном ответе (после повторного введения ассоциированной вакцины) ведущая роль принадлежит костному мозгу и частично лимфоузлам (только в первой фазе ответа) как органам синтеза АСК. В постинфекционном иммунном ответе (после контрольного заражения штаммом 1329 Е. гктюраМае) ведущую роль наряду с клетками костного мозга играютС-СК селезенки (на 3−7-е сутки п.з.) и лимфоузлов (на 3-е сутки п.з.).

Резюмируя весь изложенный в настоящей работе материал, можно сделать общее заключение о том, что проведенные комплексные исследования позволили теоретически и экспериментально обосновать перспективные подходы к анализу гуморальных факторов иммунитета с помощью разработанных современных методов иммуноанализа. Многие вопросы специфической профилактики, диагностики инфекционных и инвазионных заболеваний невозможно решать без глубокого знания природы, функциональных свойств и количественных показателей 1§-М-, 1§-Асекретирующих клеток в различных лимфоидных органах и тканях, динамики их количественных изменений в процессе иммуногенеза и той роли, которую они играют в иммунном ответе.

Показать весь текст

Список литературы

  1. У.А., Хаитов P.M., Галактионов В. Г. Очерки современной иммунологии. // Ташкент: Медицина, 1981. -255с.
  2. Л.Ф. Влияние магнитного поля на антителообразование. // Тр. Томского НИИ вакцин и сывороток, 1969, т.20, с.350−352.
  3. Н.В., Гербек Г. В., Максименко Г. В. Клеточная кинетика тимуса при антигенных и неантигенных воздействиях// Архив патологии, 1973, т.35, № 10, с.45−54.
  4. O.A. Поли- и моноклональные антитела в анализе гуморального иммунного ответа, структуры и функциональных свойств иммуноглобулинов животных. // Дисс. на соиск. уч. степени доктора биологических наук, М., 1998, -258 с.
  5. A.A., Медуницын Н. В. Клеточная теория иммунитета И.И. Мечникова и концепция антиинфекционной резистентности. // ЖМЭИ, 1995, № 3, с.36−42.
  6. Г. В., Васильев Н. В. Динамика клеточных изменений в селезёнке при действии раздражителей антигенной и неантигенной природы. //ЖМЭИ, 1971, № 8, с. 146−147.
  7. Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В. П. Методы культуры ткани в гематологии. // Томск, 1992.
  8. Э.Я., Пумен П. П. Рекомбинантные вирусные капсиды новое поколение иммуногенных белков и вакцин. // Ж. Всесюзн. хим. об-ва им. Д. И. Менделеева, 1988, т. ЗЗ (5), с.531−536.
  9. Т.И., Шурлыгина A.B., Старкова Е. В. и др. Субпопуляционный состав лимфоцитов регионарных лимфатических узлов, тимуса и селезёнки при экспериментальном воспалении внутренних половых органов у крыс-самок. // Иммунология, 2000, № 5, с. 17−19.
  10. В.Т. Основы иммунопатологии. // Н. Новгород.: издательство НГМА, 1998, -208с.
  11. A.M., Шахов В. П. Роль межклеточных взаимодействий в регуляции гемопоэза. // Томск, 1989.
  12. И.Ю. Получение и характеристика моноклональных антител к иммуноглобулинам класса «М» рогатого скота.// Дисс. на соиск. уч. степени кандидата биологических наук, М., 1994, -134 с.
  13. Г. Ф. Иммуномодулирующее действие вакцин: новые аспекты известной проблемы. //Иммунология, 2000, № 4, с.20−23.
  14. И. В., Лопухин Ю. М., Арион В. Я. Кожа как иммунный орган: клеточные элементы и цитокины. //Иммунология, 1994, № 1, с. В -13.
  15. К.А., Тухтаев K.P. Органы иммунной системы (структурные и функциональные аспекты). // Ташкент: Фан, 1987, -184 с.
  16. Р.Х. Современные биохимические методы исследования в ветеринарии и зоотехнии. ИМ, Колос, 1971, -288с.
  17. С.А., Калинина Н. М. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в реакции воспаления и иммунитета. //Иммунология, 1995, № 3, с. 30−44.
  18. Дж. Лимфоциты. Методы. // М., Мир, 1990, с.30−61.
  19. A.B. Клиническая иммунология. // М., Медицинское информационное агентство, 1999, -604с.
  20. Л. В., Ганковская Л. В. Иммуноцитокины и локальная иммунокоррекция. // Иммунология, 1995, № 1, с.4−7.
  21. И., Пернис Б. Иммунологические методы исследований. // М., Мир, 1983.
  22. Д.Ф. Ветеринарные препараты. // М., Колос, 1981.
  23. М.В., Пинегин Б. В. Основные свойства дендритных клеток. // Иммунология, 2001, № 4, с. 7−16.
  24. Р.В.- Иммунология. // М., Медицина, 1982, -368 с.
  25. Р.В., Хаитов P.M., Пинегин Б. В. Иммунодиагностика иммунодефицитов. // Иммунология, 1997, № 4, с.4−7.
  26. А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ. // М.: Мир, 2000, -592 с.
  27. М.Р., Аминова Г. Г., Григоренко Д. Е., Русина А. К. Вариабельность лимфоидных образований пищеварительного тракта у новорожденных. // Морфология, 1992, т. 102, № 3, с. 106−117.
  28. М.Р., Этинген Л. Э. Иммунная система человека. // М.: Медицина, 1996, -304 с.
  29. В.Е., Гордон Д. С. Люминисцентно-гистохимическая характеристика ранней реакции люминисцентносодержащих структур тимуса на антигенные воздействия. // Чебоксары: Изд-во Чувашского ун-та, 1992, -352с.
  30. Е.В. Антигензависимые неспецифические иммуноглобулины. Природа и возможные механизмы образования. // Успехи соврем, биол., 1993, тЛ 13, № 6, с.675−701.
  31. С.М. О природе ШИК-позитивного пигмента ретикулярных клеток червеобразного отростка кролика. // Бюлл. эксперим. биологии и медицины, 1965, т.59, № 3, с.107−110.
  32. Е.И., Глан П. Ф., Гришина Т. И. Клиническая иммунология. // М.: Медицина, 1998, -272с.
  33. Д.В. Иммуноглобулины человека. Клинико-прикладные аспекты. // Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук, М., 1975, -23с.
  34. Ю.Н. Факторы иммунологической защиты у овец в системе мать-плод-новорожденный. // Дисс. на соиск. уч. степ, доктора биологических наук. М., 1984, -302с.
  35. Ю.Н., Верховский O.A., Жаданов А. И. Количественная оценка различных типов клеток иммунной системы позвоночных в процессе онто- и иммуногенеза ELISPOT-методом // Ж. Сельскохозяйственная биология, 2000, № 4, с.3−12.
  36. Ю.Н., Верховский O.A., Слугин И. В. Основы иммунологии и иммунопатологии собак. // Москва, 2000, -248с.
  37. Ю.Н., Верховский O.A. Достижения и перспективы развития ветеринарной иммунологии.//Труды ВИЭВ, 1998, т.71, с. 114−124.
  38. ., Найп Д. Вирусология. //М., «Мир», 1989, т.1, с.37−42.
  39. А .Я. Секреторная функция переходного эпителия и гистогенетическая активность секретов. //Доклады АН СССР, 1958, т.119, № 1, с. 185−188.
  40. Г. Иммунологические методы. // М., Медицина, 1987, -472с.
  41. P.M., Игнатьева Г.А, Сидорович И. Г. Иммунология. // М., Медицина, 2000, -432с.
  42. Хэм А., Кормак Д., (Наш A.W., Cormak D.). Гистология (в 5 томах). // М.: Мир, 1983, т.2 (Лимфоидная ткань), с. 191- 252.
  43. В.М. Иммунологические аспекты резистентности телят. // Дисс. на соиск. уч. ст. доктора ветеринарных наук, М., 1985, -323с.
  44. И.Н., Борисова Т. К., Емельянцева Ю. А., Сидорова Е. В. Роль различных субпопуляций B-лимфоцитов в образовании неспецифических иммуноглобулинов, индуцированных введением антигена. // Бюлл. эксперим. биологии и медицины, 1999, № 12, с.681−683.
  45. В.П. Феномен трёхклеточной кооперации макрофаг Т-лимфоцит -кроветворная клетка в гемопоэтическом островке костного мозга при стрессе // Иммунология, 1999, № 3, с.25−27.
  46. А .Я. Тимус и его роль в иммунных реакциях организма // Сб.ст., Томский университет, Томск, 1985, -111с.
  47. И. А., Гердынцева Н. В., Васильев Н. В. Регуляция функциональной активности нейтрофилов цитокинами. //Иммунология, 1994, № 1, с.4−7.
  48. А.А. Межклеточная кооперация при иммунном ответе. Выбор клеткой формы ответа. //Иммунология, 1999, № 1, с. 17−24.
  49. А.А. Симбиотические взаимоотношения клеток иммунной системы. // Иммунология., 2001, № 4, с. 16−20.
  50. Andreu-Sanchez J.L., Faro J., Alonso J.M., Paige Ch.J., Martinez A.C., Marcos M. Ontogenic characterization of thymic В lymphocytes. Analysis in different mouse strains. // Eur. J. Immunol., 1990, v.20, p. 17−67.
  51. Arvilommi H. ELISPOT for detecting antibody- secreting cells in response to infection and vaccination.// APMIS (Denmark), 1996, v. 104(6), p.401−410.
  52. Bellone G., Astarita P., Artusio E. et al. Bone marrow stroma-derived prolactin is involved in basal and platelet- activating factor- stimulated in vitro erythropoiesis. // Blood, 1997, v.90(l), p.21−27.
  53. Benedetti R., Massouh E., Flo J. The bone marrow as a site of antibody production after a mucosal immunization. //Immunol.Lett., 1995, v.48(2), p.109−115.
  54. Benner R., Meima F., Van Der Meulen G.M., Van Ewijk W. Antibody formation in bone marrow. III. Effects of route of priming and antigen dose. // Immunology, 1974, v.30, p.449
  55. Bessis M. LMlot erythroblastique, unite fonctionelle de la moelle osseuse. // Rev. Hemat., 1958, v, 13(l), p.8−12.
  56. Bianchi A.T.J., Koch G. Detection of immunoglobulin-secreting cells. // Immunology Methods Manual, 1997, v.2, p. 1038−1044.
  57. Bianchi A.T.J., Zwart R.J., Jeurissen S.H.M. and Moonen-Leusen H.W.M. Development of the B- and T- cells compartments in porcine lymphoid organs from birth to adult life: an immunohistological approach. //Vet. Immunol. Immonopathol., 1992, v.33, p.201.
  58. Bienenstock J. Local immune response. // Am. J. vet. Res. 1975, v.36(4), p.488−491.
  59. Bienenstock J., Johnson N., Perey D.J.E. Bronchial lymphoid tissue. 1. Morphologic characteristics. // Lab. Invest. 1973, v.28(6), p.686−692.
  60. Bienenstock J.D., Befiis D. Gut-associated and bronchus-associated lymphoid tissue. // Am. J. Anat, 1984, v, 170(3), p.437−445.
  61. Bienestock Y., Rudziik O., Clancy R., Day R., Perey D. Rabbit IgA-reconstitution experiments with bronchus associated lymphoid tissue (BALT) and peyers patches (GALT). // Fed. Proc., 1974, v.33(3), p.594.
  62. Bockman D.E. Fine structure of normal human thymus from children and adults. Meeting.// J. Retic. Soc., 1977, v.22(S), p.36.
  63. Brun J.G., Ulvestad E., Fagerhol M.K., Jonsson R. Effects of human calprotectin (LI) on in vitro immunoglobulin synthesis. // Scand.J.Immunol., 1994, v.40(6), p.675−680.
  64. Chen J., Kuchroo V., Inobe J. Requlatory T cell clones induced by oral tolerance: suppression of autoimmune encephalomyelitis. // Science, 1994, v.256, p. 1237−1240.
  65. Chen W.-K., Campbell T., VanCott J.L., Saif L.J. Enumeration of isotype-specific antibody-secreting cells to cell derived from gnotobiotic piglets inoculated with porcine rotavirus. // Vet. Immunol. Immonopathol., 1995, v.45, p.265−284.
  66. Cui Y., Chang L.J. Computer-assisted, quantitative cytokine enzyme- linked immunospot analysis of human immune effector cell function. // Biotechniques, 1997, v.22 (6), p. 1146−1149.
  67. Cukrowska B., Tlaskalova H. ELISPOT assay: detection and enumiration of IgM, IgG, and IgA-secreting cells // Immunology, 1995, v.63, p.301−319
  68. Cukrowska B., Sinkora J., Mandel L. et al. Thymic B cells of pig fetuses and germ- free pigs spontaneously produce IgM, IgG and IgA: detection by ELISPOT method. // Immunology, 1996, v.87, p.487−492.
  69. Cukrowska B., Sinkora J., Rehakova Z. et al.- Isotype and antibody specificity of spontaneously formed immunoglobulins in pig fetuses and germ-free piglets: production by CD5″ B cells. // Immunology, 1996, v.88, p.611−617.
  70. Czerkinsky C.C., Nilsson L-A., Nygren H. et al. A solid-phase enzyme- linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody- secreting cells. // J. Immunol. Meth., 1983, v.65 (1−2), p. 109−121.
  71. D’Orazio Th., Niederkorn J. A novel role for TGF-beta and IL-10 in the induction of immune privilege. // J. Immunol., 1998, v. 160(5), p.2089−2099.
  72. Daugaharty H., Messmer T.O., Fields B.S. ELISPOT assay for Chlamydia-specific, antibody-producing cells correlated with conventional complement fixation and microimmuno-fluorescence. //J.Clin.Lab.Anal., 1997, v. 11(1), 45−52.
  73. Djbashi M., Terashima K., Imai Y. Electron-microscopic study of differentiation of antibody-producing cell in mouse lymph nodes after immunization with horseradish peroxidase. // J. hist. Cyt. 1982, v.30(l), p.67−74.
  74. Durkin H., Thorbecke G. Antigen-specific homing of B-cells to lymphoid follicles of rabbit. // Fed proc., 1972, v.31(2), A775.
  75. Durkin H., Thorbecke G. Relationship of germinal centers in lymphoid tissue to immunologic memory. 5. Effect of prednisolone administered after peak of primary response. // J. immunol., 1971, v. 106(4), p. 1079.
  76. Egesten A., Gullberg U., Olsson I., Richter J. Phorbol ester- induced degranulation in adherent human eosinophil granulocyte is dependent on CD11/CD18 leukocyte integrins. // J. Leukoc. biol., 1993, v.53 (3), p.287−293.
  77. Ermak T.E., Owen R.L., Jones A.L., Strober S. Distribution of B-cells, T-cells, and null-cells in peyer patches of mice after total lymphoid irradiation (TLI) — meeting abstract. // Clin. Res., 1986, v.34(l), A-46.
  78. Freedman A.S., Pedrazzini A., Nadler L.M. B-cell monoclonal antibodies and their use in clinical oncology (Review). // Cancer inv., 1991, v.9(l), p.69−84.
  79. Fujihashi K., McGhee J.R., Beagley K.W. et al. Cytokine-specific ELISPOT assay. Single cell analysis of IL-2, IL-4 and IL-6 producing cells. // J. Immunol. Meth., 1993, v. 160 (2), p. 181 189.
  80. Galve-de Rochemonteix B., Wiktorowicz K., Kushner I. et al. C-reactive protein increases production of IL-1 beta, and TNF-alpha, and expression of mRNA by human alveolar macrophages. // J. leukocyte biol. 1997, v.53(4), p.439−445.
  81. Goldberg E.D., Dygai A.M., Shakhov V.P. et al. Lymphocytic mechanisms of myelopoiesis regulation under stress. //Biomed. Sci., 1991, v.1, p. 341−366.
  82. Good R.D. Biology of cell-mediated immune response. review // Malnutrition and the immune response, 1977, v. 7, p.29−46.
  83. Haaijman J.J., Coolen J., Deen C. et al. Monoclonal antibodies directed against human immunoglobulins: preparation and evaluation procedures. // Reviews on Immunoassay Technology, Ed. S.B.Pal. The Macmillan Press LTD, 1988, p.59−93.
  84. Haas C., Ryffel B., Le Hir M. IFN-gamma is essential for the development of autoimmune glomerulonephritis in MRL/Irp mice. // J. Immunol., 1997, v, 158(l 1), p.5484−5491.
  85. Hagivara E., Pando J., Ishigatsubo Y., Klinman D.M. Altered frequency of type 1 cytokine secreting cells in the peripheral blood of patients with primary sjogrens-syndrome. // J. rheumatology, 1998, v.25(l), p.89−93.
  86. Holmgren J., Czerkinsky C., Lycke N., Svennerholm A.M. Mucosal immunity: implication for vaccine development. // Immunobiology, 1992, v.184(2−3), 157−179.
  87. Iczkowitz J.M., Gershwin M.E. Pulmonology immunology. // Bronchial asthma, 1981, v.4, p. 13−21.
  88. Inaba M., Kuma S., Inaba K., Ogata H., Iwai H., Yasumizu R., Muramatsu S., Steiman R.M., Ikehara.S. Unusual phenotype of B cells in the thymus of normal mice. // J. Exp.Med., 1988, v. 168, p.811.
  89. Isaacson P.G., Norton A.J., Addis B.J. The human thymus contains a novel population of B lymphocytes. //Lancet, 1987, v.2, p. 1488.
  90. Janeway C.A., Travers P, Walport M., Capra J.D. Immunobiology. The Immune System in Health and Disease. // Current Biology Publications/Churchill Livingstone/Garland Publishing Inc., 1999.
  91. Jerne N.K. and Nordin A.A. Plaque formation in agar by single antibody- producing cells. // Science, 1963, v. 140, p.405.
  92. Jerne N.K., Henry C., Nordin A.A. et al. Plaque-forming cells: methodology and theory. // Transplant. Rev., 1974, v. 18, p.130−142.
  93. Kanik K.S., Hagawara E., Yarboro C.H. et al. Distinct patterns of cytokine secretion characterize new onset synovitis versus chronic rheumatoid arthritis. // J. Rheumatology, 1998, v.25(l), p. 16−22.
  94. Kasemirowski J.A., Aduan R.P., Reynolds H.Y. Pulmonary host defense-coordinated interaction of mechanical, cellular and humoral immune systems of lung. // B. Eur. Phys. 1977, v. 13(1), p.103−116.
  95. Kendall M.D. The morphology of thymic cells (Meeting abstract) // J. Anat., 1981, v. 132(may), p.440.
  96. King C L, Low C.C., Nutman T.B. IgE production in human helminth infection. Reciprocal interrelationship between IL-4 and IFN-gamma. // J.Immunol., 1993, v, 150(5), p.1873- 1880.
  97. Klein J., Horejsi V. Immunology. 2hd ed. // Oxford- Cambrige, Mass.: Blackwell Science, 1997, p.496 -498.
  98. Kuby J. Immunology. 3rd ed. //New York, 1997, p.399 — 400.
  99. Kusunoki T., Hailman E., Juan T., Lichenstein H.S., Wright S.D. Molecules from Staphylococcus aureus that bind CD 14 and stimulate innate immune responsees. // J. exp. med., 1995, v. 182(6), p. 1673−1682.
  100. Kyhse-Andersen J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from Polyacrylamide to nitrocellulose. // J. Biophys. Biochem. Meth., 1984, v. 10, p.203−209.
  101. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature, 1970, v.227, p.680−685.
  102. Lennert K., Keiserling E., Muller-Hermelink H. T-associated plasma-cells. // Lancet, 1975, 7914, p. 1031−1032.
  103. Lewis P.J., S. van Drunen Littel- van den Hurk and L.A.Babiuk. Altering the cellular location of an antigen expressed by a DNA-based vaccine modulates the immune response. // J. Virol., 1999, v.73(12), p. 10 214−10 223.
  104. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. and Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. // J. Biol. Chem., 1951, v. 193, p.265−275.
  105. Liblau R.S., Singer S.M., McDevitt H.O. Thl and Th2 CD4+ T cells in the pathogenesis of organ-specific autoimmune diseases. // Immunol. Today., 1995, v. 16(1), p.34−38.
  106. Lycke N. A sensitive method for the detection of specific antibody production in different isotypes from single lamina propria plasma cells. // Scand. J. Immunol., 1986, v.24(4), p. 393 403.
  107. Makela M.J., Nikkari S., Meurman O. et al. Virus- specific, antibody-secreting cells during upper respiratory infections. // J.Med.Virol., 1995, v.47(4), p.416−420.
  108. Marcelletti J., Juh-Ichi O., Katz D. Collagen-induced arthritis in mice. Relationship of collagen-specific and total IgE synthesis to disease. //J. Immunol., 1991, v, 147(12), p.4185−4191.
  109. McCulloch E.A., Till J., 1981. Blast cells in acute mieloblastic Leukemia-a model // Blood cells, 1981, v.7(l), p.63−77.
  110. Mosmann T.R., Sad S. The expanding universe of T-cell subsets: Thl, Th2 and more. // Immunol. Today., 1996, v. 17(3), p. 138−146.
  111. Munk M.E., Mayer P., Anding P. et al. Increased numbers of interleukin-12-producing cells in human tuberculosis. //Infect. Immun., 1996, v.64 (3), p. 1078−1080.
  112. Nango K.H., Inaba M., Adachi Y., Than S., Ishida T., Kuomoto T., Uyama M., Ikehara S. Ontogeny of thymic B cells in normal mise. // Cell. Immunol., 1991, v. 133, p. 109.
  113. Nossal G.J.V., Ada G.L., Austin C.M. Antigens in immunity. 4. Cellular localization of 1251.+131 — labelled flagella in lymph nodes. //Aust. J. Exp. Biol., 1964, v.42(P3), p.311.
  114. Nowacki W., Cederblad B, Renard C. et al. Age-related increase of porcine natural interferon alpha producing cell frequency and of interferon yield per cell. // Vet. Immunol. Immunopathol, 1993, v.37(2), p. 113−122.
  115. Nowacki W., Charley B. Enrichment of coronavirus- induced interferon-producing blood leukocytes increases the interferon yield per cell: a study with pig leukocytes. // Res.Immunol., 1993, v. 144 (2), p. 111−120.
  116. Olson J., Yoffey J. Oligosynthetic and polysynthetic lymph nodes. A new classification. // J. Anat, 1966, v. 102, p.422.
  117. Owen J.J.T., Jenkinson E.J. Embriology of the lymphoid system // Progr. Allergy., 1981, v.29, p.1−29.
  118. Owen R. L, Jones A.L. Epithelian cell specialization within human peyers patches -ultrastructural study of intestinal lymphoid follicles. // Gastroenty, 1974, v.66(2), p. 189−203.
  119. Owen R.L., Jones A.L. Scanning electron microscopic evaluation of peyers patches in rats and humans. // Anat. Rec., 1973, v. 175(2), p.404.
  120. Pabst R. Is BALT a major component of the human lung immune system? // Immunol. Today., 1992, v. 13(4), p. 119−122.
  121. Plesch B. E. C. Histology and immunohistochemistry of bronchus associated lymphoid tissue (BALT) in the rat (reviev). // Adv. Exp. Med., 1982, v. 142, p.491−497.
  122. Pompidou A. Histochemical studies of cytoplasmatic inclusions in reticulum cells of lymphatic follicles of normal rabbit. // Acta. Histoch., 1971, v.39(l), p. 134.
  123. Pospischil A. Structure and function of intestinal peyers patches in various animal species cc708.//A. Tier., 1989, v, 131(16), p.595−603.
  124. Rowlen D.A. The effekt of splenectomy on the formation of circulating antibody in the adult male albino rat// J. Immunol., 1950, v.64(4), p.289−295.
  125. Sainte-Marie G., Leblond C.P. Elaboration of a model for formation of lymphocytes in thymic cortex of young adult rats. // Blood, 1965, v.26, p.765.
  126. SchefFel J.W., Setcavage T.M. and Kim Y.B. IgM and IgG direct plaque- forming cells develop during the immune response of miniature swine to sheep erythrocytes. // Cell. Immunol., 1979, v.44, p. 109−124.
  127. Scheibenbogen C., Lee K.H., Stevanovic C. et al. Analysis of the T cell response to tumor and viral peptide antigens by an IFNgamma- ELISPOT assay. // Int. J. Cancer, 1997, v.71(6), p.932−936.
  128. Scott P. IL-12: initiation cytokine fore cell-mediated immunity comment. // Science., 1993, v.260, p.496−497. Comment on: Science, 260 (5107), p.547−549.
  129. SebuwufuP.H. Ultrastructure of human fetal cilia//Digestion, 1968, v.1, p. 193.
  130. Sedgwick J.D. and Holt P.G. A solid-phase immunoenzymatic technique for the enumeration of specific antibody- secreting cells. // J. Immunol. Meth., 1983, v.57(1−3), p.301−309.
  131. Sedgwick J.D. ELISPOT assay. // In: Encyclopedia of Immunology.- Academic Press, 1998, p.796−798.
  132. Segal B., Klinman D., Shevach E. Microbial products induce autoimmune disease by an IL-12-dependent pathway. //J. Immunol., 1997, v, 158(ll), p.5087−5090.
  133. Shadahira Y., Tadashi Y., Monobe Y. Very late activation antigen 4-vascular cell adhesion molecule 1 interaction is involved in the formation of erythroblastic islands. // J. Exp. med., 1995, v. 181(1), p.411−415.
  134. Simon A., Seipeit E., Sieper J. Divergent T-cell cytokine patterns in inflammatory arthritis. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 1994, v.91(18), p.8562−8566.
  135. Slifka M.K., Ahmed R. Limiting dilution analysis of vims- specific memory B-cells by an ELISPOT assay. //J. Immunol. Meth., 1996, v. 199(1), p.37−46.
  136. Spencer J., Choy M., Hussell T., Papadaki J., Isaacson P.G. Properties of human thymic B cells. //Immunology, 1992, 75, p.596.
  137. Splichal I., Rehakova Z., Sinkora M. et al. In vivo study of interferon-alpha-secreting cells in pig foetal lymphohaematopoietic organs following in utero TGEV coronavirus injection. // Res. Immunol., 1997, v. 148(4), p.247−256.
  138. Sportn M.B., Roberts A.B. Peptide growth-factors are multifunctional. //Nature., 1988, v.322(6161), p.217−219.
  139. Sriskandan S., Evants T.J., Cohen J. Bacterial superantigen induced human lymphocyte responses are nitric oxide dependent and mediated by IL-12 and IFN-gamma. // J. Immunol., 1996, v. 156(7), p.2430−2435.
  140. Tanguay S., Killion J.J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA- based assays for detection of individual cytokine-secreting sells. // Lymphokine Cytokine Res., 1994, v. 13 (4), p.259−263.
  141. Till J., McCulloch E.A., 1980. Hematopoietic stem-cells differentiation. Review // Bioc. Bioph. A., 1980, p.605(4), p.431−459.
  142. Toma Y.A., Peteif F.P. Human vermiform appendix immunocompetent cell topography and cell-to-cell interaction insitu. //J. Immunol., M., 1978, 20, p.333−347.
  143. Toro Y. Influence of intestinal epithelium to plasma-cell differentiation injected into thymus. // Acta morphol. H 1977, v.25(4), p.219−238.
  144. Twisk A.J.T., Groeneved H.P., Kraal G. The effect of bacterial lipopolysaccharide (LPS) on high endotelial venules end interdigitating cells in mouse lymph nodes. // Immunobiol., 1988, v. 176(4−5), p.410−412.
  145. Van Rooijen N. The insitu immune response in lymph nodes. A review. // Anat. Rec., 1987, v.218(4), p.359−364.
  146. Veerman A.G.P., Ewik W. White pulp compartment in the spleen of rats and mice: A light and electron microscope study of lymphoid and nonlymphoid cell types in T and B areas// Cell Tiss. Res., 1975, v. 156, p.417−441.
  147. Veldman J.E., Keuning F.J., Molendar I. Site of initiation of plasma-cell reaction in rabbit limph node ultrastructural evidence for distinct antibody-forming cell precursors. // Vir. Arch. B., 1978, v.28(3), p.187−202.
  148. Wood R.L., Booth G.D., Cutlip R.C. Susceptibility of vaccinated swine and mice to generalized infection with specific serotypes of Erysipelothrix rhusiopathiae. // Am. J. Vet. Res., 1981 v.42(4), p.608−614.
  149. Shimoji Y., Yokomizo Y., Sekizaki T., Mori Y. and Kubo M. Presence of a capsule in rysipelothrix rhusiopathiae and its relationship to virulence for mice. // Infect. Immun., 1994, v. 62(7), p.2806−2810.
  150. Shimoji Y., Mori Y., Sekizaki T., Shibahara T., and Yokomizo Y. 7 Construction and Vaccine Potential of Acapsular Mutants of Erysipelothrix rhusiopathiae: Use of Excision of Tn9/<5 To Inactivate a Target Gene // Infect. Immun, 1998, v.66, p.3250−3254.
  151. Yurov G.K., Neugodova G.L., Verkhovsky O.A., Naroditsky B.S. Thiophilic adsorption: rapid purification of F (ab)2 and Fc fragments of IgGl antibodies from murine ascitic fluid. // J. Immunol. Meth., 1994, v. 177, p.29−33.
  152. Zuckermann F.A., R.J.Husmann, R. Schwartz et al. Interleukin-12 the virus-specific interferon gamma response of pigs to an inactivated pseudorabies virus vaccine. // Vet. Immunol. Immunopathol., 1998, v.63, p.57−67.
Заполнить форму текущей работой

На отлично!