Роль туберина в регуляции аутофагии на примере туберозного склероза

Непрерывное обновление содержимого эукариоти ческой клетки происходит в результате точно сбалансированной работы процессов синтеза и деградации. Процесс деградации белка — консервативный клеточный процесс, который обеспечивает повторное использование аминокислот, а также осуществляет контроль качества внутриклеточных белков. В клетке существует две основные системы, которые участвуют в деградации белков — протеосомная и лизосомальная [1- 2]. В то время как протеосомная система осуществляет деградацию, в основном, короткоживущих белков и участвует в регуляции клеточных сигнальных систем, лизосомальная система является основным механизмом клеточной деградации долгоживущих внутриклеточных компонентов: белков, жировых накоплений, белковых агрегатов, органелл и т. д. Существует несколько основных способов доставки внутриклеточных компонентов в лизосомы, таких как макроаутофагия, микроаутофагия и шаперон-опосредованная аутофагия, при этом макроаутофагия (в дальнейшемаутофагия, от греческого cinto — само и phagos — поедать) является основным процессом, участвующим в доставке макромолекул и органелл в лизосомы. В процессе аутофагии участки цитоплазмы и дефектные органеллы окружаются мембранами, образуя органеллы, называемые аутофагосомами. Последние впоследствии сливаются с лизосомами, где происходит их деградация [2- 3- 4].

В последнее время было идентифицировано множество генов, участвующих в регуляции различных стадий аутофагии (Autophagyrelated genes, или Atg). В частности, инактивация генов Atg5 и Beclinl (Atgo) приводит к полному прекращению аутофагии в клетке [5- 6].

В настоящее время накоплено множество данных о связи аутофагии с развитием различных заболеваний. Особый интерес представляют сведения об участии аутофагии в развитии опухолевых заболеваний, согласно которым в зависимости от типа опухоли, микроокружения и уровня малигнизации аутофагия может как замедлять, так и способствовать развитию опухолей [7- 8- 9]. Поскольку для большинства онкологических заболеваний в настоящее время не существует эффективных способов лечения, открывается возможность найти мишени для терапевтического воздействия на опухоль среди компонентов системы клеточной деградации [10- 11- 12- 13].

Онкологические заболевания — это комплексные полигенные заболеванияв развитие которых вовлечено множество различных сигнальных каскадов, регулирующих клеточную дифференцировку, пролиферацию и выживаемость [14- 15]. Абсолютное большинство опухолевых заболеваний характеризуется активацией сигнального пути PI3K7Akt/mTORCl. Результатом активации данного сигнального пути является активация киназного комплекса mTORCl, высококонсервативной серин/треониновой протеинкиназы, регулирующей процессы белкового синтеза, транскрипции, клеточного деления, апоптоза и метаболизма [16]. Привлекательной генетической моделью для изучения роли киназного комплекса mTORCl в регуляции опухолевого роста служит заболевание туберозный склероз (ТС), возникающее в результате инактивирующих мутаций в генах TSC1 или TSC2. Продукты генов TSC1 и TSC2, гамартин и туберин, соответственно, образуют гетеродимер, который, при наличии ростовых факторов, глюкозы, кислорода и аминокислот фосфорилируется и инактивируется, в результате чего происходит активация киназного комплекса mTORCl [17- 18]. Соответственно, мутации в генах TSC1 или TSC2 приводят к постоянной и неконтролируемой активации киназного комплекса mTORCl и как следствие к активации клеточной пролиферации и процессов анаболизма. Привлекательность модели ТС для изучения роли киназного комплекса mTORCl и аутофагии в развитии опухолей определяется тем, что при инактивации гена TSC2 происходит активация комплекса mTORCl без активации множества других сигнальных путей, которые регулируются другими участниками каскада PI3K/Akt/mTORCl.

Настоящая работа посвящена исследованию молекулярных механизмов регуляции аутофагии при инактивации гена TSC2, а также изучению роли аутофагии в регуляции биоэнергетических функций клеток с инактивированным геном TSC2, их способности к опухолевому росту и регрессии в результате инактивации генов, необходимых для осуществления аутофагии. В работе также описана ранее неизвестная функция белка рабин-8 в регуляции киназного комплекса mTORC 1.

Целью диссертационной работы являлся комплексный анализ молекулярных механизмов регуляции аутофагии супрессором опухолевого роста туберином, а также изучение роли аутофагии в регуляции биоэнергетических функций клеток в норме и при развитии опухолей на различных генетических моделях.

В связи с вышеуказанной целью ставились следующие задачи:

1. Исследовать влияние гена TSC2 на процесс аутофагии.

2. Проанализировать, зависит ли регуляция активности аутофагии от активности киназного комплекса mTORCl.

3. Изучить влияние аутофагии на биоэнергетические функции клеток с инактивированным геном TSC2, на активацию процессов их клеточной смерти, а также на их способность к опухолевому росту.

4. Проанализировать возможность использования модуляторов аутофагии для лечения опухолей с инактивированным геном TSC2 в качестве самостоятельных агентов или в комбинации с противоопухолевыми агентами, используемыми в настоящее время.

5. Изучить влияние белка рабин-8 на регуляцию активности киназного комплекса mTORCl.

Научная новизна работы. В ходе работы впервые прямо продемонстрирована возможность регуляции аутофагии геном супрессором опухолевого роста Tsc2- показано, что регуляция аутофагии туберином происходит через регуляцию киназного комплекса mTORCl. Показано влияние дальнейшего ингибирования аутофагии на различные аспекты жизнедеятельности клеток с инактивированным геном Tsc2, такие как активность митохондрий, синтез АТР и возможность активации клеточной смерти. Впервые было показано, что гены Atg5 и Beclinl необходимы для опухолевого роста, вызванного инактивацией гена Tsc2. Также описано ранее неизвестное участие белка рабин-8 в регуляции киназного комплекса mTORCl.

Практическая значимость диссертации. При отсутствии эффективных терапевтических средств для лечения опухолевых заболеваний и, в частности, ТС, в настоящее время активно ведется поиск и изучение различных процессов, вовлеченных в развитие опухолей. В данной работе установлено, что нормальное функционирование аутофагии необходимо для развития опухолей при ТС. Показано, что использование ингибиторов аутофагии замедляет рост опухолей при ТС и, в комбинации с ингибиторами киназного комплекса mTORCl, усиливает регрессию опухолей. Таким образом, полученные данные позволяют говорить о потенциальной возможности использования ингибиторов аутофагии в качестве терапевтических агентов для лечения ТС.

Личный вклад соискателя. Автором самостоятельно выполнен основной объем исследований, проведены обработка и анализ полученных экспериментальных данных, сформулированы основные положения диссертации, составляющие ее новизну и практическую значимость, а также подготовлены материалы публикаций в научных журналах. Подготовка образцов для трансмиссионной электронной микроскопии и их анализ выполнены при участии М. Jarnik (Fox Chase Cancer Center, Филедельфия, США). Анализ дыхательной активности митохондрий выполнен с помощью J. Wu (National Heart Lung and Blood Institute, Бетесда, США). Анализ и сортировка клеток с помощью проточного флуоресцентного цитометра проводились в специализированном отделе (Fox Chase Cancer Center, Филедельфия, США).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Аутофагия — процесс, при котором участки цитоплазмы и дефектные органеллы доставляются в лизосомы, где происходит их деградация. Образующиеся аминокислоты, нуклеотиды и триглицериды используются для синтеза новых белков, нуклеиновых кислот и липидов. У высших эукариот описано несколько способов доставки органелл и макромолекул в лизосомы (аутофагии). Эндоцитоз участвует в доставке макромолекул с клеточной поверхности в лизосомы. Часть цитоплазмы может быть захвачена лизосомами путем инвагинации лизосомальной мембраны: процесс, называемый микроаутофагией. Таким же способом происходит и захват пероксисом, так называемая пексофагия. Существует направленный и селективный транспорт цитозольных белков в лизосомальное пространство, который зависит от наличия в этих белках специфического мотива (КРЕК (£) и опосредуется лизосомально-ассоциированным белком ЬАМР-2а и белком теплового шока Нзс73. Макроаутофагия — это основной лизосомальный путь, ответственный за неселективную доставку цитоплазматического материала во время клеточного голодания и утилизацию дефектных органелл. В дальнейшем мы будем рассматривать только процессы макроаутофагии и называть ее аутофагией.

Интенсивность аутофагии может быть различной. Аутофагия на низком уровне происходит во всех клетках, осуществляя гомеостатические функции через утилизацию белков и органелл. Процесс быстро активируется в клетках, испытывающих недостаток питательных веществ, ростовых факторов и энергии. Аутофагия также активируется в клетках, подвергающихся структурным перестройкам в ходе развития, или в случае необходимости для клетки избавиться от продуктов окислительного стресса, инфекционных агентов или белковых агрегатов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В последние несколько лет резко возрос интерес к изучению аутофагии не только как гомеостатическому процессу, обеспечивающего деградацию внутриклеточных белков и способствующего клеточному обновлению, но и как к процессу, играющему важнейшую роль при развитии различных патологий. Одной из таких патологий является развитие опухолей, в результате инактивации генов супрессоров опухолевого роста или активации онкогенов. До настоящего времени до конца не выяснено, как изменяется активность аутофагии в результате генетических изменений при образовании опухолевых клеток, каковы молекулярные механизмы, лежащие в основе этих изменений и как влияет изменение уровня аутофагии на рост опухолевых клеток.

При сравнении уровня аутофагии в различных клеточных линиях с интактным и инактивированным геном TSC2 нами установлено, что инактивация гена TSC2 приводит к снижению уровня аутофагии как в нормальных условиях, так и в условиях клеточного стресса. Аутофагия также снижена в опухолевых клетках с инактивацией гена TSC2 от больных ТС по сравнению с окружающими нормальными клетками. Использование ингибитора киназного комплекса mTORClрапамицина показало, что снижение уровня аутофагии в клетках с инактивированным геном TSC2 происходит в результате активации mTORCl и его ингибирование приводит к нормализации уровня аутофагии. Также в результате нашего исследования была выявлена ранее неизвестная функция белка рабин-8, регулирующего активность киназного комплекса тТ (ЖС1 в результате взаимодействия с ГТФ-азой ШгеЬ.

Чтобы выяснить последствия снижения уровня аутофагии в клетках, мутантных по гену ТБС2, аутофагию ингибировали двумя способами — с помощью короткошпилечных РНК против генов Atg5 и ВесИп1 или с помощью хлорохина — фармакологического ингибитора аутофагии. Показано, что ингибирование аутофагии снижало окислительную функцию митохондрий и синтез АТФ, индуцировало клеточную смерть в условиях ограниченного количества питательных веществ в среде, а также приводило к замедлению опухолевого роста.