Нарушения формирования осевых структур мейотических хромосом у штаммов шампиньона двуспорового с пониженной частотой рекомбинации

Актуальность проблемы исследования. Ранний мейоз эукариотических организмов насыщен динамическими событиями, в той или иной степени взаимно влияющими друг на друга. Развитие таких событий определяет судьбу последующих этапов мейоза — сбои в системах ранних мейотических процессов могут вызвать мейотический арест или впоследствии нарушить расхождение хромосом во время анафаз I и II. Кроме того, процессы раннего мейоза имеют глобальное биологическое значение, обеспечивая генотипическую изменчивость организмов за счет общей мейотической рекомбинации.

Совокупность процессов раннего мейоза состоит из нескольких основных систем со своими, зачастую общими для таких систем, контролирующими генами. Прежде всего, среди подобных систем можно выделить систему мейотической рекомбинации. Это сложная система процессов, несколькими путями приводящая к конверсии генов и кроссинговеру (Rohr et al., 1997; Boer, Heyting, 2006). Во-вторых — система хромосомного внутриядерного движения, которая включает в себя и сближение гомологичных хромосом, и движение хромосом за счет перемещения закрепленных в ядерной мембране хромосомных теломер и прочее (Zickler, Kleckner, 1998). В-третьих, система мейотической когезии сестринских хроматид, обеспечивающая формирование когезинового кора хромосом, состоящего из мейозспецифичных когезиновых белков (Page, Hawley, 2004). В-четвертых, система образования нуклеопротеиновых осей мейотических хромосом — осевых элементов хромосом (ОЭ) и синаптонемных комплексов (СК) (Богданов, 2003). Сборка ОЭ происходит на базе когезинового кора каждой мейотической хромосомы, СК формируются их двух ОЭ, скрепленных поперечными филаментами, во время синапсиса гомологичных хромосом.

Распространенный способ установления роли мейотических генов и связи между собой вышеописанных процессов — анализ мутантов, с нарушениями в раннем мейозе. Причем в качестве цитогенетического индикатора наличия таких нарушений часто используют структуру ОЭ и СК. Дефекты сборки ОЭ и СК, хорошо визуализируемые в тотальных препаратах мейотических хромосомных осей, позволяют констатировать наличие мейотических нарушений. Характер таких дефектов, в некоторых случаях, дает возможность предположить механизмы возникновения мейотических нарушений (Zickler, Kleckner, 1998; Zolan et al., 1988; Celerin et al., 2000; Gerecke, Zolan., 2000; Merino et al., 2000; Shinohara et al, 2003; Bhuiyan, Schmekel, 2004; Hederson, Keeney, 2004).

Существуют варианты атипичного прохождения раннего мейоза, относящиеся к другой категории, нежели дефекты у мутантов раннего мейоза. Речь идет о направленных нарушениях мейотических процессов, то есть, о нарушениях, прошедших отбор, выполняющих определенную функцию в организме, онтогенезе или жизненном цикле организма.

К подобным нарушениям можно отнести направленное подавление мейотической рекомбинации. Существуют, например, «холодные точки рекомбинации» — участки генома/хромосом с «запрещенной» рекомбинацией — субтеломерные области, прицентромерные и.т.д. (Rohr et al., 1997). Но особый интерес представляет направленная супрессия рекомбинации у грибов со вторично-гомоталличным жизненным циклом, у которых рекомбинационный «запрет» распространен если не на большую, то на значительную часть генома (Дьяков, 1999; Захаров, 2005).

Одним из таких видов, среди штаммов которого есть вторично-гомоталличные, является широко распространенный в культуре шампиньон двуспоровый, Agaricus bisporus (Lange) Inbach.

У большинства штаммов данного вида частота мейотической рекомбинации значительно снижена. О характере и распределении.

Молекулярно-генетическими методами показан крупный участок на первой хромосоме с подавленной рекомбинацией (далеенерекомбинантный участок), включающий МАГ-локус и, скорее всего, центромеру. Нерекомбинантные регионы есть и в других хромосомах шампиньона (Royse, May, 1982; Summerbell et al., 1989; Kerrigan et al., 1993; Callac et al., 1997).

Однако нарушение рекомбинации происходит не у всех штаммов шампиньона. Наличие или отсутствие супрессии рекомбинации генетически детерминированы и предопределены при наследовании типа развития мицелия (Callac et al., 1997).

Тип развития мицелия — вторично-гомоталличный или гетероталличный, задается детерминирующим локусом BSN. Генотип Ъ/Ь такого локуса несут штаммы со вторично-гомоталличным, или двуспоровым, жизненным циклом (Imbernon et al., 1996). Подобные штаммы наиболее распространены в культуре и среди природных изолятов. Завершив мейоз, ядра в базидиях таких штаммов расходятся преимущественно по два в каждую спору, причем гетерокариотическими, и прорастают мицелием способным к половому плодоношению без стороннего партнера (Miller, 1971; Elliott, 1972; Miller&Kananen, 1972; Raper et al., 1972).

У изредка выделяемых из природы гетероталличных, или четырехспоровых, штаммов шампиньона с фенотипом t локуса BSN, не выявлено значительных нарушений рекомбинации в мейозе. Их преимущественно одноядерные базидиоспоры прорастают самостерильным мицелием, нуждающемся в половом партнере для замыкания жизненного цикла (Callac et al., 1993; Kerrigan et al., 1994). c* нарушении по геному шампиньона известно мало. неслучайно базидиоспоры чаще всего оказываются.

Таким образом, шампиньон, имеющий большую практическую ценность, парадоксально слабо изучен генетически и цитогенетически, и ставит перед исследователями проблему, решение которой актуально для фундаментального понимания разнообразия механизмов мейоза эукариот. Проблема заключена в понимании характера и механизмов рекомбинационных нарушений у шампиньона двуспорового. Решение этой проблемы возможно путем многоэтапного сравнительного исследования мейоза разных по типу развития штаммов шампиньона.

Настоящая работа является первым этапом такого исследования. Используя вышеописанные индикаторные свойства ОЭ и СК и цитогенетические методы их тотального изучения, в настоящем исследовании предпринята попытка выявления и осмысления природы особенностей сборки ОЭ и СК в связи с нарушениями рекомбинации у двуспоровых штаммов шампиньона.

Важно, что в качестве сравнения мы имели возможность исследовать имеющийся в коллекции кафедры микологии и альгологии МГУ четырехспоровый штамм шампиньона, характеризующийся отсутствием значительных нарушений рекомбинации.

Цель и задачи исследования

Цель настоящего исследованиясравнительный анализ особенностей формирования осевых структур мейотических хромосом и других ядерных структур у штаммов шампиньона Agaricus bisporus с разными жизненными циклами и установление возможных причин нарушения мейотической рекомбинации у двуспоровых штаммов.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработка метода получения тотальных препаратов распластанных ядер шампиньона, пригодных для электронно-микроскопического анализа синаптонемных комплексов.

2. Анализ связи между этапами морфогенеза плодовых тел шампиньона и становлением мейоза, направленный на выявление этапов развития плодовых тел, позволяющих получить максимальный выход ядер на стадии профазы I мейоза.

3. Анализ ультраструктуры ядер четырехспорового штамма шампиньона (не имеющего значительных нарушений рекомбинации) на стадии профазы I. Кариотипированиена основе анализа синаптонемных комплексов. Установление особенностей морфологии различных внутриядерных структур, в частности, рекомбинационных узелков.

4. Анализ особенностей формирования осевых структур мейотических хромосом у двуспоровых штаммов шампиньона, которым свойственно снижение частоты мейотической рекомбинации.

5. Морфологический и статистический анализ различий в ультраструктуре ядер между двуи чётырехспоровым штаммами шампиньона.

Научная новизна работы. Впервыеполучены препараты распластанных мейотических ядер из ферментативно выделенных протопластов шампиньона. Подобный метод распластывания, на основе ферментативного выделения протопластов, ранее использовали только для исследований дрожжей, но не мицелиальных грибов.

Впервые установлена связь между стадиями морфогенеза плодовых тел шампиньона и становлением мейоза.

Впервые шампиньон кариотипирован на основе анализа СК четырехспорового штамма, впервые детально описаны с помощью электронно-микроскопического анализа различные стадии раннего мейоза шампиньона. Обнаружены и описаны разные типы рекомбинационных узелков шампиньона и некоторые другие внутриядерные структуры.

Впервые выявлены и проанализированы значительные внутриядерные нарушения на стадиях раннего мейоза у двуспоровых штаммов шампиньона, в частности, нарушения формирования ОЭ и СК.

Предложена модель, объясняющая особенности рекомбинационных событий у шампиньона, основанная на предположении о генетически-детерминированных онтогенетических рекомбинационных нарушениях. Такие нарушения обеспечиваются существованием двух функциональных подсистем — подсистемы регион-специфической регуляции в первой и, возможно, других хромосомах шампиньона и подсистемы регион-неспецифического нарушения сборки ОЭ и нарушения рекомбинации в случайно распределенных по генотипу регионах.

Практическая значимость полученных результатов.

Настоящее исследование имеет преимущественно фундаментальное значение и вносит вклад в понимание природы регуляции рекомбинации, особенностей мейоза шампиньона, обеспечения апогамных жизненных циклов и.т.д.

Однако данная работа может иметь в дальнейшем практическое значение. Культивируемый шампиньон — важный сельскохозяйственный объект. Селекционная работа с данным видом затруднена по-причине традиционного использования в культуре вторично-гомоталличных штаммов. Вторично-гомоталличный жизненный цикл осложняет проведение гибридизации между штаммами. Также атипичность раннего мейоза, возможно, приводит к снижению выживаемости спорового потомства.

Получение сортов шампиньона с классическими сортовыми признаками, но отсутствием рекомбинационных нарушений, может привести к увеличению продуцирования гомокариотических спор, важных для селекции, и улучшению выживаемости спорового потомства шампиньона.

НЕКОТОРЫЕ ТЕРМИНЫ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ.

Базидия — мейоспорангий базидиомицетов, в котором происходит кариогамия и мейоз, постмейотические ядра распределяются в экзогенные 8 мейоспоры (базидиоспоры). В простом случае базидия одноклеточнахолобазидия. У некоторых групп базидиомицетов встречаются многоклеточные базидии — фрагмобазидии (базидия с перегородками) и гетеробазидии (базидия, разделенная на функционально дивергентные пробазидию и базидию).

Боковой элемент (БЭ) — два БЭ входят в состав СК. Формируются БЭ на основе ОЭ каждого из пары спаренных гомологов.

Гетерокариотический мицелий (спора) — мицелий (спора) со специфическим для грибов ядерным статусом — такой мицелий (спора) содержит ядра, несущие разные совместимые состояния локуса спаривания. Обычно гетерокарион образуется в интервале (у базидиомицетов такой интервал составляет большую часть жизненного цикла) между плазмогамией совместимых мицелиев и кариогамией родительских ядер.

В широком смысле гетерокариотическим могут называть любой мицелий, несущий ядра, полученные из разных мицелиев.

Гомокариотический мицелий (спора) — мицелий (спора), содержащий ядра одного типа, то есть несущие одно и то же состояние локуса спаривания.

Гимений — палисадный слой клеток, покрывающий поверхность гименофора многих сумчатых и базидиальных грибов, включающий как мейоспорангии, так и стерильные элементы гимения.

Гименофор — часть плодового тела гриба, несущая гимений. Весьма разнообразен по морфологии у различных грибов. У шампиньона так называемый пластинчатый гименофор.

Осевой элемент (ОЭ) — осевая нуклеопротеидная структура мейотических хромосом. Является осью неспаренного гомолога в ранней профазе I мейоза.

Поликомплекс (ПК) — многолинейная белковая структура, не связанная с хроматином. Видимо, формируется за счет избыточного белкового материала ОЭ и СК, можно обнаружить в ядре или цитоплазме после расформирования СК в диплотене или в случае нарушений сборки ОЭ иСК.

Рекомбинационный узелок (РУ) — шаровидная или удлиненная структура, связанная с ОЭ, БЭ или ЦЭ. Представляет собой 9 нуклеопротеидный комплекс рекомбинационных ферментов и различных вспомогательных белков. Функции РУ зависят от его типа.

Синаптонемный комплекс (СК) — мейозспецифическая трехлинейная нуклеопротеидная осевая структура хромосом. Образуется в профазе I деления мейоза у большинства эукариот в процессе синапсиса гомологичных хромосом и состоит из двух боковых элементов (бывших индивидуальных осевых элементов каждого из двух гомологов) и центрального элемента (ЦЭ).

Сумка — аналог базидии у сумчатых грибов. В отличие от базидии, сумка формирует эндогенные споры.

Центральный элемент (ЦЭ) — линейный элемент СК, занимающий его центральное пространство, сформированный перекрывающимися участками поперечных филаментов СК.

Частное покрывало — часть плодового тела у базидиомицетов с типом развития плодового тела, как у некоторых агариковых грибов. Представлено в виде тонкой пленки, закрывающей гименофор на ранних стадиях развития плодового тела.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ.

БЭ — боковой элемент СК;

ДНР — двунитевой (-ые) разрыв (-ы) ДНК;

ДТТ (DTT) — дитиотретол;

МЭС (MES) — морфолиноэтансульфоновая кислота;

ОЭ — осевой элемент;

ПК — поликомплекс;

ПКП — поликомплекс-подобная структура;

РУ — рекомбинационный узелок;

СК — синаптонемный комплекс;

ФВК — фосфорновольфрамовая кислота;

ФМСФ (PMSF) — фенилметилсульфонилфлюорид;

ЦЭ — центральный элемент СК;

ЭДТА (EDTA) — этилендиаминтетраацетат.

ВЫВОДЫ.

1. Разработанный метод распластывания мейотических ядер из базидий шампиньона, основанный на ферментативном выделении протопластов, эффективен для цитогенетического исследования профазы I шампиньона двуспорового Agaricus bisporus. В частности, метод применен для анализа ультраструктуры осей мейотических хромосом, используемой в качестве цитогенетического индикатора нарушений мейотической рекомбинации.

2. На эффективность метода распластывания мейотических ядер шампиньона и качество получаемых препаратов наибольшее влияние оказывают факторы: а. Температура заключительных стадий выгонки плодовых тел шампиньона (температура влияет на интенсивность мейоза) — б. Использование плодовых тел шампиньона со вскрытым частным покрывалом (в плодовых телах с целым частным покрывалом мейоз нарушен) — в. Состав и концентрации ферментов для получения протопластов из базидий (влияние на продуктивность выделения протопластов) — г. Правильное использование детергентов при получении препаратов распластанных ядер шампиньона (завышенные концентрации и пролонгированное действие детергентов негативно сказываются на качестве препаратов). д. Условия контрастирования и выбор метода в зависимости от цели контрастирования (осевые структуры или рекомбинационные узелки).

3. Становление типичного мейоза (профазы I) происходит только после вскрытия частного покрывала плодового тела, что приводит к частичной синхронизации типичного мейоза шампиньона. До вскрытия частного покрывала плодового тела мейоз шампиньона протекает с рядом нарушений.

4. Профаза I мейоза у четырехспорового штамма шампиньона в целом типична для большинства эукариот. Исключение составляют незначительные нарушения ультраструктуры осевых элементов хромосом в некоторых ядрах, распластанных на стадиях лептотены и ранней зиготены, и редкая встречаемость распластанных ядер на стадии диплотены.

5. Кариотипированием, на основе анализа синаптонемных комплексов четырехспорового штамма шампиньона, показано п= 13 (длины синаптонемных комплексов от «1 до 5 мкм).

6. На стадиях лептотены-зиготены (но не поздней зиготены-пахитены) идентифицируются рекомбинационные узелки. Рекомбинационные узелки, условно определенные (на основе морфологии и локализации) как ранние, связаны чаще всего с осевыми элементами хромосом. «Поздние» рекомбинационные узелки, более крупные, всегда расположены в центральном пространстве синаптонемных комплексов.

7. С помощью сравнительного электронно-микроскопического анализа распластанных ядер штаммов шампиньона с разными жизненными циклами установлено, что у двуспоровых штаммов шампиньона, характеризующихся снижением частоты рекомбинации: а. Нарушено формирование осевых элементов хромосом и синаптонемных комплексовб. Редуцировано количество рекомбинационных узелковв. Во многих ядрах нарушен процесс слияния ядрышекг. Нередко в ядрах присутствуют поликомплекс-подобные структуры.

8. Атипичностъ сборки осевых структур хромосом двуспоровых штаммов шампиньона имеет ряд важных особенностей (установлено с помощью статистического и морфологического анализов, в сравнении с четырехспоровым штаммом шампиньона): а. Осевые элементы хромосом формируются лишь на отдельных участках некоторых хромосом. Причем распределение участков формирования осевых элементов носит случайный характер. б. Участки хромосом, сформировавшие осевые элементы, сближаются и синаптируют (исключение см. в следующем пункте). в. Не синаптируют осевые элементы постоянного участка первого бивалента или постоянные участки нескольких длинных бивалентов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В настоящем исследовании, посвященном цитогенетическому изучению профазы I мейоза шампиньона, был решен круг разнообразных задач: разработан метод, установлены особенности мейоза на разных этапах морфогенеза плодовых тел, электронно-микроскопически исследованы особенности ядерной ультраструктуры на стадии профазы I у штаммов шампиньона с разными жизненными циклами, проведен анализ различий формирования осевых структур мейотических хромосом между разными штаммами и предложена гипотетическая схема, поясняющая природу направленных нарушений рекомбинации у шампиньона.

Для того чтобы изучить морфологические характеристики, установить особенности и выявить нарушения распластанных ядер шампиньона на стадии профазы I мейоза, нами был разработан эффективный метод получения тотальных препаратов осевых структур мейотических хромосом. Методические результаты нашего исследования, которые сами по себе обладают научной новизной, позволили нам получить крайне интересные и новые результаты при анализе профазы I мейоза шампиньона.

Разработанный метод получения препаратов распластанных ядер из базидий шампиньона представляет собой синтез различных адаптированных методов, применяемых для исследований других видов грибов и прочих организмов. Метод распластывания мейотических ядер был впервые применен для цитогенетического исследования профазы I шампиньона двуспорового. Можно говорить о том, что наш метод распластывания за счет использованного в нем подхода (осуществляемого через ферментативное выделение протопластов мейоспорангиев), на примере шампиньона, впервые применен для мицелиальных грибов в целом.

Составная часть нашего метода распластывания — выделение протопластов из базидий шампиньона — разработана на основе предложенных другими авторами способов выделения протопластов из гимения шампиньона и культур клеток дрожжей. Разработанный метод выделения протопластов обеспечивает достаточно высокий продуктивный выход протопластов и необходимую для дальнейшей работы их сохранность.

Другая составная часть нашего метода распластывания — само распластывание полученных протопластов, представляет собой модифицированный метод по Лойдл (Loidl et al., 1991), также используемый при исследовании дрожжей.

Контрастирование препаратов распластанных мейотических ядер шампиньона основано на способах контрастирования тотальных препаратов СК мышей и злаков. Подобранные нами условия распластывания ядер и их контрастирования обеспечивают получение качественных электронно-микроскопических препаратов ядер на стадии профазы шампиньона, дают возможность исследовать совокупности ОЭ и СК, ультраструктуру осевых структур мейотических хромосом, другие ядерные структуры.

Впервые установлена связь между становлением мейоза у шампиньона и морфогенезом плодовых тел. Обнаружено, что до момента вскрытия частного покрывала плодового тела ранний мейоз в базидиях плодового тела протекает атипично — в распластанных ядрах обнаруживаются осевые структуры мейотических хромосом, но ультраструктура их плохо выражена, хроматин уплотнен. Становление типичного мейоза шампиньона, с четко выраженными структурами, соответствующими профазе I в распластанных ядрах, синхронизировано с разрывом частного покрывала плодовых тел.

Электронно-микроскопический анализ распластанных ядер на стадии профазы I четырехспорового штамма шампиньона показал типичность профазы I у этого штамма. Хотя ряд особенностей профазы I обнаружены и у четырехспорового штамма (наличие нарушений структуры ОЭ в некоторых ядрах, распластанных, обычно, на стадиях лептотены и ранней зиготеныредкая встречаемость ядер на стадии диплотены, возможно, из-за скоротечности данной стадии).

Описан СК-кариотип шампиньонавпервые исследованы разные стадии профазы I и изучены особенности формирования, как осевых структур хромосом и рекомбинационных узелков, так и других ядерных структур.

Один из самых важных результатов нашего исследованияобнаружение и анализ значительных внутриядерных нарушений, в частности, нарушений формирования ОЭ и СК у двуспоровых штаммов шампиньона. Морфология осевых структур мейотических хромосом, как и в многочисленных работах, посвященных ранним мейотическим нарушениям у других организмов (Zolan et al., 1988; Celerin et al., 2000; Gerecke, Zolan., 2000; Merino et al., 2000; Shinohara et al., 2003; Hederson, Keeney, 2004), сыграла роль цитогенетического индикатора наличия рекомбинантных нарушений у шампиньона. О нарушении рекомбинации у вторично-гомоталличных штаммов шампиньона известно давно (как и у некоторых других вторично-гомоталличных грибов) (Royse, May, 1982; Summerbell et al., 1989; Kerrigan et al., 1993; Дьяков, 1999; Захаров, 2005), и такое явление, наряду с отрывочными цитогенетическими данными, и ранее позволяло предполагать наличие дефектов сборки ОЭ и СК у шампиньона (Fletcher, 1981). Однако четкое подтверждение тому и исчерпывающий анализ особенностей формирования таких атипичных ОЭ и СК впервые получены в результате проведения данного исследования.

Статистический и морфологический анализ внутриядерных нарушений у шампиньона позволил нам сделать предположение о характере и механизмах таких естественных нарушений. Нами было предположено наличие у шампиньона генетически-детерминированной (зависимой от локуса BSN) изменчивости рекомбинации, состоящей из двух подсистем. Подсистема регион-специфической регуляции функционирует в определенном участке (вероятнее всего прицентромерном) первой хромосомы (или в определенных участках нескольких длинных хромосом) и сопровождается асинапсисом в данном участке. Подсистема регион-неспецифических нарушений сборки ОЭ, и, возможно, нарушений рекомбинации, может иметь нерегуляторную природу (мутация, косегрегирующая с BSN Ъ) и быть обусловленной неполной дисфункцией гена/генов мейотической когезии или структурных генов ОЭ.

Однако для действительного установления механизмов супрессии рекомбинации, нарушения сборки осевых структур хромосом и нарушений мейоза в базидиях закрытых плодовых тел, необходимо дальнейшее проведение исследования шампиньона с помощью других цитогенетических и генетических методов.

Так следующим этапом, продолжающим настоящее исследование, мог бы быть этап, включающий иммуноцитохимический анализ ранних мейотических белков. Ввиду консервативности таких белков (особенно, белков рекомбинации), возможно использование коммерческих антител против антигенов животных и растений. Иммуноцитохимически возможно установить наличие и активность изучаемых белков, что может быть информативно в том случае, если у шампиньона действительно есть элементы регион-неспецифической супрессии рекомбинации.

Итог данного исследования подводят краткие выводы, сформулированные на основе результатов исследования и их обсуждения.