Диплом, курсовая, контрольная работа
Помощь в написании студенческих работ

Выявление точечных мутаций в ДНК методом лигирования олигонуклеотидов: селективность этапов гибридизации и лигирования

Диссертация: Выявление точечных мутаций в ДНК методом лигирования олигонуклеотидов: селективность этапов гибридизации и лигирования
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Большинство методов выявления точечных мутаций включают несколько этапов: амплификацию, селективное получение специфического продукта и его детекцию. Первый этап — это амплификация исходного нуклеотидного материала (геномной ДНК или РНК), количества которого, как правило, не хватает для анализа из-за недостаточной чувствительности большинства методов. На втором этапе проводят селективную реакцию… Читать ещё >

Содержание

  • СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
  • ВВЕДЕНИЕ б 1. ПРИНЦИПЫ СЕЛЕКТИВНОСТИ В МЕТОДАХ ВЫЯВЛЕНИЯ ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЙ В НК (обзор литературы)
    • 1. 1. Детекция известных мутаций
      • 1. 1. 1. Рестрикционный анализ
      • 1. 1. 2. Аллель специфичная гибридизация
      • 1. 1. 3. Методы выявления мисматчей в дуплексе олигонуклеотид/ДНК
        • 1. 1. 3. 1. Химическая реакция
        • 1. 1. 3. 2. ДНКзимы
        • 1. 1. 3. 3. Flap-эндонуклеозы
        • 1. 1. 3. 4. Методы лигирования
        • 1. 1. 3. 5. Методы, основанные на использовании ДНК-полимераз
    • 1. 2. Детекция новых мутаций
      • 1. 2. 1. Конформационный анализ
        • 1. 2. 1. 1. Конформационный полиморфизм одноцепочечной ДНК
        • 1. 2. 1. 2. Полиморфизм длин фрагментов при действии эндонуклеазой Cleavase I
      • 1. 2. 2. Гетеродуплексный анализ фрагментов ДНК 23 1.2.2.1 Физико-химические методы
        • 1. 2. 2. 2. Методы химического расщепления гетеродуплексов
        • 1. 2. 2. 3. Методы детекции, основанные на использование мисматч узнающих белков
    • 1. 3. Методы секвенирования
      • 1. 3. 1. Секвенирование при синтезе
        • 1. 3. 1. 1. Секвенирование по Сэнгеру
        • 1. 3. 1. 2. Секвенирование при полимеризации
      • 1. 3. 2. Секвенирование при расщеплении
        • 1. 3. 2. 1. Химическое расщепление
        • 1. 3. 2. 2. Экзонуклеазное расщепление 36
  • Заключение
  • 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТ
    • 2. 1. Исходные материалы
      • 2. 1. 1. Реактивы и препараты
      • 2. 1. 2. Буферы и растворы
      • 2. 1. 3. Праймеры
    • 2. 2. Основные методы 40 2.2.1 Синтез и выделение олигонуклеотидов
      • 2. 2. 2. Получение и выделение ПЦР-фрагментов
      • 2. 2. 3. Метод лигирования олигонуклеотидов
      • 2. 2. 4. УФ-иммобилизация и колориметрическое выявление на капроне 43 2.2.5 Исследование термической денатурации 44 2.2.6. Расчет термодинамических параметров комплексообразования
  • 3. ВЫЯВЛЕНИЯ ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЙ В ДНК МЕТОДОМ ЛИГИРОВАНИЯ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ: СЕЛЕКТИВНОСТЬ ЭТАПОВ ГИБРИДИЗАЦИИ И ЛИГИРОВАНИЯ (результаты и обсуждение)
    • 3. 1. Разработка подхода к выявлению точечных мутаций
      • 3. 1. 1. Концепция метода
      • 3. 1. 2. Оптимизация условий анализа
        • 3. 1. 2. 1. Подбор концентрационных условий
        • 3. 1. 2. 2. Влияние дозы УФ-облучения на эффективность выявления ДНК
        • 3. 1. 2. 3. Эффективность лигирования тандемов олигонуклеотидов на различных ДНК-матрицах
        • 3. 1. 2. 4. Влияние длины ПЦР-фрагмента на эффективность его колориметрического выявления
      • 3. 1. 3. Колориметрическое выявление точечных мутаций
        • 3. 1. 3. 1. Детекция тринуклеотидной делеции и вставки модель CFTR)
        • 3. 1. 3. 2. Детекция однонуклеотидных замен (модель ВИЧ-1) 63 3.2.Селективность гибридизации
      • 3. 2. 1. Описание модели
      • 3. 2. 2. Анализ функции селективности
      • 3. 2. 3. Изменение селективности при варьировании концентрации зовда
      • 3. 2. 4. Изменение селективности при варьировании структуры зонда
      • 3. 2. 5. Изменение селективности при выявлении различных мисматчей
      • 3. 2. 6. Анализ полученных результатов
    • 3. 3. Селективность дотирования
      • 3. 3. 1. Дизайн модельной системы
      • 3. 3. 2. Термическая стабильность модельных дуплексов
      • 3. 3. 3. Лигирование комплементарных комплексов
      • 3. 3. 4. Дискриминация одиночных мисматчей вблизи одноцепочечного разрыва
    • 3. 4. Программа для выбора максимально селективных зондов
  • ВЫВОДЫ
  • СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
  • ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ В настоящей работе использованы символы и сокращения структурных компонентов нуклеиновых кислот и их производных в соответствии с рекомендациями Комиссии по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии (IUPAC) и международного союза биохимиков (IUB), а также следующие обозначения:

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота дцЦНК двуцепочечная ДНК

N нуклеотидное звено

ПЦР полимеразная цепная реакция е.а. единица активности фермента о.е. оптические единицы

ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография

ПААГ полиакриламидный гель трис трис-(гидроксиметил)-аминометан

Taq полимераза ДНК-зависимая ДНК-полимераза Thermus aquaticus

SNP Single Nucleotide Polymorphism (однонуклеотидный полиморфизм)

OLA Oligonucleotide Ligation Assay (метод лигирования олигонуклеотидов)

LNA замкнутая (locked) нуклеиновая кислота

PNA пептидил нуклеиновая кислота, а степень ассоциации олигонуклеотидов в дуплексной форме fa функция селективности гибридизации

Тт температура плавления (температура, при которой степень ассоциации комплекса олигонуклеотидов равна 0.5)

Тпих температура, при которой функция селективности достигает максимума

BCIP 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат динатриевая соль

NBT нитротетразолиевый синий

DMFA диметилформамид

DMSO диметилсульфоксид

EDTA этилендиаминтетрауксусная кислота

DTT 1,4-дитиотреитол

SDS додецилсульфат натрия

Префикс «d» опущен при написании структуры олигодезоксирибонуклеотидов, нуклео-тидных пар для краткости написания опущен.

Выявление точечных мутаций в ДНК методом лигирования олигонуклеотидов: селективность этапов гибридизации и лигирования (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Развитие методов секвенирования ДНК привело к накоплению колоссального объёма информации, как о первичной структуре нуклеиновых кислот различных биологических объектов, так и о полиморфизмах в генетическом материале [1]. Наличие точечных мутаций позволяет судить о предрасположенности или присутствии генетических заболеваний, как моногенной, так и полигенной природы [2]. Мутации подобного типа часто являются причинами лекарственной устойчивости различных патогенных микроорганизмов и вирусов [3, 4], вызывающих, например, такие социально-значимые заболевания как туберкулез, гепатиты, СПИД и др. Все это свидетельствует о необходимости развития технологий достоверного выявления точечных мутаций, что позволит приблизиться к реализации персонифицированного подхода в профилактике и лечении различных заболеваний.

Описаны различные подходы выявления точечных мутаций в генетическом материале. Наиболее распространенными среди них являются аллель-специфичная ПЦР, TaqMan [5−7], минисеквенирование [8] и лигирование набора олигонуклеотидов [9,10]. Во всех этих подходах селективность выявления обеспечивается за счет ферментов, обладающих способностью различать полностью комплементарный комплекс и комплекс, содержащий мисматч. Так, ДНК-лигазы способны дискриминировать наличие некомплементарной пары вблизи одноцепочечного разрыва в ДНК-дуплексе, что нашло применение в подходе OLA (oligonucleotide ligation assay). Наличие мисматча существенно снижает эффективность формирования фосфодиэфирной связи, т. е. образование продукта лигирования позволяет судить о присутствии специфической последовательности ДНК. Однако в литературе отсутствует систематическая информация об эффективности дискриминации мисматчей в нике в зависимости от типа нуклеотидов.

С другой стороны большинство методов выявления точечных мутаций [5, 7, 9, 11−14] содержит этап гибридизации олигонуклеотидных зондов с НК-мишенью, который может быть использован для обеспечения дополнительной селективности выявления. Тем не менее формальное определение селективности гибридизации как количественного параметра до сих пор не нашло широкого применения.

Цели и задачи исследования:

Целью данной работы являлось систематическое исследование селективности метода ферментативного лигирования олигонуклеотидов и разработка на основе метода нового подхода к выявлению точечных мутаций в ДНК.

В ходе исследования решались следующие задачи:

— разработка нового подхода к выявлению точечных мутаций в ДНК;

— анализ влияния различных параметров на селективность гибридизации зонда с анализируемой ДНК при выявлении в ней точечных мутаций;

— создание систематической базы данных, описывающей эффективность дискриминации ДНК-лигазой фага Т4 любых одиночных мисматчей вблизи сайта лигирова-ния;

— разработка программного обеспечения для выбора олигонуклеотидных зондов, обеспечивающих наибольшую селективность выявления точечных мутаций методом ферментативного лигирования.

1. ПРИНЦИПЫ СЕЛЕКТИВНОСТИ В МЕТОДАХ ВЫЯВЛЕНИЯ ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЙ В НК (обзор литературы).

Большинство методов выявления точечных мутаций включают несколько этапов: амплификацию, селективное получение специфического продукта и его детекцию. Первый этап — это амплификация исходного нуклеотидного материала (геномной ДНК или РНК), количества которого, как правило, не хватает для анализа из-за недостаточной чувствительности большинства методов. На втором этапе проводят селективную реакцию, продукт которой позволяет судить о том содержит ли последовательность точечную мутацию или нет. И последний этап — это детекция специфического сигнала от продукта, полученного в результате селективной реакции, при его отделении, если необходимо, от исходной метки. Следует отметить, что возможны как совмещения некоторых этапов, например амплификации и селективной реакции, так и отсутствиенеко-торых из них, кроме второго этапа, который присутствует во всех случаях.

Данный обзор посвящен рассмотрению принципов, используемых в различных методах выявления точечных мутаций в НК, на основе которых происходит образование специфического продукта, свидетельствующего о наличии или наоборот отсутствии замены. Под селективностью понимается способность различения схожих нуклео-тидных последовательности, отличающихся друг от друга точечной мутацией. Селективная реакция может иметь совершенно разную природу, например, физико-химическую, ферментативную или химическую, при этом может происходить изменение массы, конформации, флуоресценции и т. д.

1Л. Детекция известных мутаций.

Представленные в этой части литературного обзора методы применяются в случае, когда известна первичная последовательность анализируемого сайта, тип и локализация выявляемой точечной мутации.

выводы.

1. В рамках метода лигирования олигонуклеотидов предложен новый подход к колориметрическому выявлению точечных мутаций с помощью ДНК-лигазы фага Т4. Подход основан на отделении тандема коротких олигонуклеотидов от комплекса продукта лигирования с анализируемой ДНК длиной более 100 нт. за счет её избирательной УФ-иммобилизации на капроновой мембране. Показано, что предложенный подход позволяет с высокой селективностью выявлять в ДНК однонуклеотидные замены, а также гомои гетерозиготные варианты тринуклеотидных делеций/вставок.

2. Впервые проведено систематическое исследование селективности этапа гибридизации зондов с ДНК и этапа образования фосфодиэфирной связи при выявлении точечных мутаций в ДНК методом ферментативного лигирования олигонуклеотидов. а) Показано, что наиболее адекватным способом количественной оценки селективности гибридизации зонда является расчет функции селективности (ФС), представляющей собой отношение степеней ассоциации комплексов зонда с нормальной и мутантной ДНК. Проведен анализ ФС и впервые показано, что температура, при которой достигается максимум ФС, несколько превышает температуру плавления комплементарного комплекса. Показано, что для зондов, отличающихся по длине, максимальное значение ФС для заданной температуры выше при использовании более длинного зонда. Впервые получены уравнения, позволяющие оценить степень изменения величины максимума ФС при варьировании концентрации зонда, его длины или типа точечной мутации в ДНК. б) С использованием ДНК-лигазы фага Т4 при лигировании всех 96 вариантов одиночных мисматчей вблизи одноцепочечного разрыва ДНК экспериментально определены факторы дискриминации (ФД), представляющие собой отношение скоростей лигирования комплементарного комплекса и комплекса, содержащего несовершенную пару оснований. Максимальные ФД наблюдаются для гомопури-новых и гомопиримидиновых мисматчей. ФД мисматчей, расположенных с 5'-стороны от одноцепочечного разрыва, в среднем в 23 раза выше, чем ФД аналогичных мисматчей с З'-стороны.

3. Разработан алгоритм предварительной оценки селективности выявления точечных мутаций в известных последовательностях ДНК методом лигирования олигонуклеотидов. Создано программное обеспечение, использующее данный алгоритм для нахождения структуры двухили трехкомпонентного тандема, который бы обеспечивал в заданных экспериментальных условиях максимальную селективность выявления мутации.

1.4.

Заключение

.

Как следует из приведенного литературного обзора, разработка методов выявления точечных замен в ДНК [6, 122, 123] является в настоящее время одним из бурно развивающихся направлений. Условно методы выявления могут быть разделены на три группы. В первую попали методы, детектирующие наличие известных мутаций (RFLP и гибридизационный анализ). Данные методы получили наибольшее распространение и продолжают развиваться. Во вторую группу можно объединить методы, направленные на идентификацию как известных, так и неизвестных мутаций. Часть из этих методов позволяет лишь судить о наличии мутации, но ни о положении, ни об её типе (SSCP, CFLP, НА, DGGE, TGGE, DHPLC, MutS, H, L система). Другие позволяют локализовать её, не говоря о типе (РНК и ДНК-эндонуклеазы). Третьи могут ответить на все эти вопросы (ССМ, ДНК-гликозилазы). Использование перечисленных выше подходов всегда требует знание первичной последовательности, т. е. первоначального секвенирования. В третий блок входят методы секвенирования, дающие полную информацию о нуклеотидной последовательности анализируемой ДНК и использующиеся для выявления новых SNP.

Выявление известных точечных мутаций, ассоциированных с определенным фенотипом, является наиболее востребованным, что отражается на количестве предлагаемых методов их детекции. Для описанных в литературе методов, как правило, показана только принципиальная возможность выявления мутации. Отсутствие систематических данных по селективности методов затрудняет их сравнение между собой, а с другой стороны усложняет или вовсе не позволяет их использование при разработке новых тест-систем.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Исходные материалы 2.1.1. Реактивы и препараты.

В работе были использованы следующие реактивы и ферменты: полинуклеотид-киназа Т4, ДНК-лигаза фага Т4, конъюгат стрептавидин-щелочная фосфатаза, любезно предоставленный M.JI. Филипенко (ИХБФМ СО РАН), Taq ДНК-полимераза (ИХБФМ СО РАН), протеиназа К (Медиген, Россия), ДНК фага X гидролизованную Hind Ill-фрагментов (Сибэнзим, Россия), хромогенные субстраты BCIP и NBT («Molecular probes», США), Tween-20 (Fisher, США), капроновая мембрана (Hiiu Kalur, Эстония) DMFA, NaCl, N-гидроксисукцинимидный эфир биотина («Molecular Probes», США).

ПЦР-фрагменты гена env ВИЧ-1/bru (180 н.п.) и ВИЧ-1/rf (180 н.п.) были любезно предоставлены Гашниковой Н. П. (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор»).

Кровь больного муковисцидозом (гомозигота по deIF508) предоставлена отделением пульмонологии (МДКБСП № 3, г. Новосибирск).

2.1.2. Буферы и растворы.

Название Состав.

Буфер ТЕ 50 мМ трисНС1 рН 8.3,0.1 мМ EDTA.

Буфер ТВЕ 50 мМ трис-борат, рН 8.3,50 мМ борная кислота, 0.1 мМ EDTA.

Буфер ligA 20 мМ трис-HCl рН 7.5,10 мМ MgCl2,0.1 М NaCl, 10 мМ DTT, 1 мМ АТР.

Буфер ligB 20 мМ трис-HCl рН 7.5,10 мМ MgCl2,0.1 М NaCl, 10 мМ DTT.

Буфер ПЦР 67 мМ трис-HCl рН 8.9, 16 мМ (NH4)2S04, 1.5 мМ MgCl2, 85 мкг/мл BSA, 0.01% Tween-20,5 мМ DTT.

Буфер АР-7.5 20 мМ трис-HCl рН 7.5,100 мМ NaCl, 2 мМ MgCl2.

Буфер АР-9.5 20 мМ трис-HCl, рН 9.5,100 мМ NaCl, 2 мМ MgCl2.

Буфер АРТ-7.5 20 мМ трис-HCl, рН 7.5,100 мМ NaCl, 2 мМ MgCl2,0.5% Tween-20.

Буфер D ЮмМ трис-EDTA рН 7,0.4 М NaCl, 0.3% SDS.

Буфер Т ЮмМ какодилат NapH 7.5,0.1 М NaCl, 10 мМ MgCl2,.

P-pNBT 75 мг/мл в 70% водном DMFA.

Р-р BCIP 50 мг/мл в 50% водном DMFA.

2.1.3. Праймеры.

Праймеры для получения ПЦР-фрагментов гена env ВИЧ-1.

С01 ACAATTATTGTCTGGTATAG прямой.

С02 AGGTATCTTTCCACAGCCAG обратный.

Праймеры для получения ПЦР-фрагментов гена CFTR человека.

Pi TGCCTGGCACCATTAAAG прямой.

Р2 GGAGGCAAGTGAATCCTG прямой рЗ GGGTAAGCTACTGTGAATGGAT обратный р4 CAATGGTTATTTATATGGCAGC обратный рб TTCCTGGATTATGCCTG прямой.

Р7 GCATGCTTTGATGACGC обратный.

2.2. Основные методы.

2.2.1. Синтез и выделение олигонуклеотидов.

Синтез олигодезоксирибонуклеотидов проводили на автоматическом синтезаторе ASM-700 (Biosset, Россия) с использованием стандартных синтонов (Glen Research, США) для фосфитамидитного протокола.

Выделение олигодезоксирибонуклеотидов и их производных после полного деблокирования проводили ионообменной и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией на хроматографе («Waters», США) на колонках 3.9×300 мм. Для ионообменной хроматографии использовали носитель Полисил СА-500 (12мкм) (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», Россия) и градиент концентрации КН2РО4 от 0 до 0.3 М (рН 6,5) в 30% ацетонитриле. Обращенно-фазовую хроматографию проводили на колонке с носителем LiChroprep RP-18 (10 мкм) («Merck», Германия) в градиенте концентрации ацетонитрила от 0 до 20% (30%) в водном растворе UCIO4 (50 мМ).

Концентрирование растворов олигонуклеотидов и их производных после хро-матографического выделения проводили на вакуумном ротационном испарителе Rota-vapor RE120 (Bichi, Швейцария) при давлении 10−15 мм рт.ст.

Определение концентрации олигонуклеотидов проводили спектрофотометри-чески на приборе «Милихром 4», Россия, используя суммарные величины молярных коэффициентов поглощения faeo) монои динуклеотидов на длине волны 260 нм [124].

УФ-спектры записывали на спектрофотометре UV-2100 («Shimadzu», Япония).

5'-32Р-Меченые олигонуклеотиды получали по методу [125], используя [у-32Р] АТР (ИХБФМ СО РАН). Меченую ДНК выделяли при помощи электрофореза в 20%.

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА.

ПААГ и элюировали из геля буфером ТЕ.

Биотинилированные по 3'-концу дезоксирибонуклеотиды синтезированы по методу, описанному в работе [126]. 5'-конец биотинилировали, исходя из олигонуклео-тидного производного, несущего на 5'-концевом фосфате остаток 1,3-диамино пропана по тому же методу [126].

Элекгрофоретический анализ олигонуклеотидов проводили в денатурирующем (7 М мочевина) 20% ПААГ (акриламид / КК'-метиленбисакриламид 30:1), используя ТВЕ буфер.

2.2.2. Получение и выделение ПЦР-фрагментов.

Подбор праймеров для гена CFTR осуществлялся с помощью программы Gene Runer 3.05 (Hastings Software, США). Уникальность выбранных праймеров проверялась в поисковой программе BLAST на сайте http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Анализ показал отсутствие высокой гомологии с какими-либо другими известными участками генома человека.

Выделение геномной ДНК из крови проводили следующим образом: к 1 мл крови и/или кровяному сгустку добавляли 1 мл бидистиллированной (б/д) воды, перемешивали, центрифугировали 4 мин при 4000 об/мин («Eppendorf» 5415С, Германия) и удаляли супернатант. Осадок ядерных элементов ресуспендировали в 1 мл буфера D и добавляли 40 мкг протеиназы К. После перемешивания раствор инкубировали 2 часа при 65 °C, затем при 37 °C в течение ночи, периодически встряхивая. К раствору добавляли 500 мкл 5 М NaCl, перемешивали и центрифугировали при 14 000 об/мин в течение 5 минут («Eppendorf 1547, Германия). Супернатант переносили в новую пробирку и добавляли 0.5 объема изопропанола, пробирки встряхивали, выдерживали 5 мин при комнатной температуре и центрифугировали при 14 000 об/мин 5 минут. Осадок ДНК последовательно промывали 70% и 96% этанолом, сушили на воздухе при комнатной температуре и растворяли в б/д воде.

Полимеразную цепную реакцию проводили в 10 мкл смеси, содержащей ПЦР буфер, по 0.2 мМ каждого dNTP, по 2 мкМ прямого и обратного праймеров, 1 мкг геномной ДНК или 0.01 мкг ПЦР-фрагмент, 1.5 е.а. Taq полимеразы. Термоциклирование проводили на амплификаторе «Mastercycler 5330 plus» («Eppendorf», Германия) по программе: 25−30 циклов (94 °С — 1 мин, 52 °C — 45 с, 72 °C -1 мин).

ПЦР-фрагмент ВИЧ-1 Ibru (135 н.п.) получали реамплификацией ПЦР-продукта ШЧ-МЪги (180 н.п.). ДНК-фрагменты гена CFTR 567 (1463−2029) и 564 н.п. (дикий и мутантный типы) получали, проводя ПЦР с геномной ДНК. ПЦР-фрагменты длиной 91(1615−1705), 230(1625−1854), 392(1463−1854), 405(1625−2029) п.н. и 88,227, 389 и 402 п.н. получали реамплификацией ПЦР-фрагментов 567 и 564 п.н., соответственно.

Осаждение ПЦР-фрагментов: при необходимости раствор ПЦР-фрагментов предварительно концентрировали добавлением н-бутанола. Далее проводили осаждение, добавляя 1/3 объема насыщенного раствора ацетата аммония и 3.2 объема 96% этилового спирта. Реакционную смесь выдерживали при -20 °С в течение 12 ч, далее центрифугировали при 14 000 об/мин в течение 15 мин. Осадок ДНК последовательно промывали 70% и 96% этанолом, сушили на воздухе при комнатной температуре и растворяли в б/д воде.

Препаративная наработка и выделение ПЦР-фрагментов: после проведения ПЦР в 10 пробирках по 50 мкл, реакционную смесь (500 мкл) концентрировали до объёма 100 мкл н-бутанолом и ДНК-фрагменты осаждали этанолом. Полученный осадок растворяли в 20 мкл, и ДНК-фрагменты разделяли в нативном 10% ПААГ, после чего визуализовали их в УФ-свете с помощью хроматографической пластины DC-Alufolien Kieselgel 60 F254 («Merck», Германия) и вырезали части геля, содержащие требуемый ампликон. ДНК-фрагменты элюировали из геля тремя порциями по 200 мкл буфера ТЕ в термошейкере «Thermomixer compact» («Eppendorf1, Германия) при 45 °C, 1400 rpm. Элюент объединяли, концентрировали н-бутанолом и ДНК осаждали этанолом. Осадок ДНК растворяли в воде и определяли концентрацию спектрофотометрически по поглощению раствора на 260 нм.

Анализ продуктов ПЦР проводили с помощью электрофореза в нативном 10% ПААГ (акриламид / ИД-метиленбисакриламид 30:1), используя буфер ТВЕ. В качестве маркеров длины использовали ДНК-фрагменты 100 — 1000 н.п. Ml5 («Сибэнзим», Россия).

Секвенирование ПЦР-фрагментов проводили в центре коллективного пользования ИХБФМ и ИЦиГ СО РАН на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310 Genetic Analyzer. Реакционная смесь объёмом 5 мкл содержала ПЦР-фрагмент 10*7 М, праймер 2−10″ 7 М, 2 мкл BigDye Terminator Mix (флуоресцентно меченные дидезокси-нуклеотидтрифосфаты, дезоксинуклеотидтрифосфаты, AmpliTaq ДНК-полимераза).

2.2.3. Метод лигирования олигонуклеотидов.

Лигирование на ПЦР-фрагментах: Перед смешиванием всех компонентов реакции, ПЦР-фрагмент и олигонуклеотиды прогревались в общей смеси до 100 °C 5 мин. после чего раствор помещался в лёд. Конечная реакционная смесь объёмом 10−30 мкл содержала олигонуклеотиды (10'5 М), биотинилированный олигонуклеотид (10*7М), ДНК-матрицу (10*7 М), 25 е.а. Т4 ДНК-лигазы, буфер ligA. Лигирование стандартно проводили при 25 °C в течение 30 мин, если не оговорено иначе.

Лигирование на коротких ДНК-матрицах: Реакционная проба (10 мкл), содержала 2−10'5 М декануклеотида, З'-нуклеотид которого входил в ник, 410″ 6 М дека-нуклеотида, 5'-нуклеотид которого входил в ник, 20-мерную ДНК-матрицу (4-Ю^М), 0.25 е.а. Т4 ДНК-лигазы, 0.1 мМ АТР, буфер ligB. Лигирование проводили при 25 °C в течение 10 мин, если не оговорено иначе.

Электрофоретический анализ продуктов лигирования проводили в денатурирующем (20%) или нативном ПААГ (10−15%). После авторадиографирования геля на рентгеновскую пленку «Curix» («Agfa», Бельгия), пленку сканировали на приборе UMAX PowerLook 1000 (Германия). Количественную оценку результатов проводили с помощью программы «Gel-Pro Analyzer 4.0» («Media Cybernetics», США), которая позволяет оценивать интенсивность окраски каждой из полос в шкале серых тонов. Степень образования продуктов реакции рассчитывали как отношение интенсивностей в полосах, соответствующих продукту реакции к исходному радиоактивно меченному олигонуклеотиду.

Активность Т4 ДНК-лигазы определяли, принимая за 1 е.а. количество фермента, необходимое для того, чтобы обеспечить лигирование 50% Hind Ill-фрагментов ДНК фага X за 30 мин при 16 °C в 20 мкл реакционной смеси при концентрации ДНК.

0.3 мкг/мкл.

2.2.4. УФ-иммобилизация и колориметрическое выявление на капроне.

Реакционную смесь (3−7 мкл) после проведения лигирования наносили на капроновую мембрану, помещенную на лист бумаги (Whatman ЗММ), пропитанный 3 М NaCl, и облучали УФ-светом (две ртутные лампы низкого давления (ЭДБ-30, Россия)) с расстояния 17 см. Мембрану отмывали буфером АРТ-7.5 2 раза по 10 мин.

Колориметрическое выявление продуктов лигирования проводили, выдерживая мембрану с конъюгатом стрептавидин-щелочная фосфатаза (1 мкг/мл буфера АР-7.5) 30 мин. Мембрану отмывали буфером АРТ-7.5 3 раза по 5 мин и буфером АР-9.5 5 мин. Реакцию проявления проводили, выдерживая капрон с хромагенными субстратами (1 мл АР-9.5 + 4 мкл р-ра NBT + 8 мкл р-ра BCIP) в течение 10−20 мин и останавливали промывкой б/д водой. Окраску в точках нанесения регистрировали на сканере (Mustek), интенсивность окрашевания пятен оценивали в шкале серых тонов по величине интегральной оптической плотности (IOD) с помощью программы Gel-Pro Analyzer 4.0 («Media Cybernetics», США).

2.2.5. Исследование термической денатурации.

Исследование термической денатурации олигонуклеотидных дуплексов проводили в буфере Т при концентрации олигонуклеотидных компонентов 5*10″ 6 М каждого на установке с терморегулируемой оптической кюветой на базе УФ-детектора жидкостного хроматографа «Милихром» (Научприбор, Россия) не менее чем на четырех длинах волн в диапазоне 230−290 нм. Регистрацию кривых плавления в многоволновом режиме проводили с пошаговым автоматическим переключением монохроматора. Время интегрирования сигнала на каждой длине волны не превышало 1.2 с. Каждая кривая плавления состояла из набора не менее чем 600 температурных значений оптической плотности с частотой 10 точек/°С.

2.2.6. Расчет термодинамических параметров (энтальпии д# и энтропии aS) Расчет дHN и дSN для комплементарных ДНК комплексов:

Термодинамические характеристики дHN и дSN в 1 М NaCl для комплементарных комплексов были рассчитаны с использованием параметров SantaLucia J. для модели ближайших соседей [127]. Для расчетов термодинамических параметров комплек-сообразования среднестатистического олигомера длины / +1 (без учета концевых эффектов) использовались выражения: д HN"lp&HN (1.1).

Sn*IpaSn (1.2) где дЯ^=-8.36 ккал/моль энтальпия, а д5л,=-22.4 кал/(моль*К) энтропия формирования среднестатистического динуклеотидного шага спирали ДНК, полученные при усреднении параметров [127].

Расчет д Ни и д Нм для ДНК комплексов, содержащих мисматч:

Термодинамические характеристики дЯм и дЯм в 1 М NaCl для комплексов, содержащих одиночные мисматчи, рассчитывали, исходя из параметров формирования динуклеотидного шага спирали ДНК, полученных в работах [127−132]. Параметры ддЯ и ддS рассчитывали как разницу соответствующих значений, полученных для комплементарного и содержащего одиночный мисматч дуплексов: ддЯ =aHnдНи и.

ДД|S —&Sf/ —aSи.

Величины ддЯи ддS для каждого типа мисматча X/Y (таблица 1) усредненного по окружению рассчитывали по дд H (X/Y) =.

2>Я r NXN} кN’YN’J и ДДS (X/Y)=дд S.

NXN.

N’YN' п п.

Среднестатистическая дестабилизация дуплекса при наличии одиночного мисматча характеризуется величинами ддЯ=-16.4 ккал/мольи дд5=-41.2 кал/(моль*К). Соотношение среднестатистических энтальпий комплексообразования и дестабилизации, таким образом, составляет дд Н -16.4 я д Ни -8.36.

1.3).

Показать весь текст

Список литературы

  1. www.ncbi.nlm.nih.gov/proiects/SNP/
  2. Hirschhom J.N., Daly M.J. Genome-wide association studies for common diseases and complex traits//Nat. Rev. Genet. 2005. V. 6 P. 95−108
  3. Newton C.R., Graham A., Heptinstall L.E., Powell S.J., Summers C., Kalsheker N., Smith J.C., Markham A.F. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS) //Nucleic Acids Res. 1989. V. 17 P. 2503−2516
  4. Whitcombe D., Newton C.R., Little S. Advances in approaches to DNA-based diagnostics // Curr. Opin. Biotechnol. 1998. V. 9 P. 602−608
  5. И.А., Ребриков Д. В. Методы детекции однонуклеотидных полиморфизмов: аллель-специфичный ПЦР и гибридизация с олигонуклеотидной пробой // Генетика 2007. V. 26 Р. 22−32
  6. Chen X., Zehnbauer В., Gnirke A., Kwok P.Y. Fluorescence energy transfer detection as a homogeneous DNA diagnostic method // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1997. V. 94 P. 10 756−10 761
  7. Barany F. Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1991. V. 88 P. 189−193
  8. Nelson N.C., Hammond P.W., Matsuda Е., Goud A.A., Becker М.М. Detection of all single-base mismatches in solution by chemiluminescence // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24 P. 4998−5003
  9. Kalinina O., Lebedeva I., Brown J., Silver J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25 P. 1999−2004
  10. Friedman К.J., Highsmith W.E., Jr., Prior T.W., Perry T.R., Silverman L.M. Cystic fibrosis deletion mutation detected by PCR-mediated site-directed mutagenesis // Clin. Chem. 1990. V. 36 P. 695−696
  11. Rohlfs E.M., Learning W.G., Friedman K.J., Couch F.J., Weber B.L., Silverman L.M. Direct detection of mutations in the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1 by PCR-mediated site-directed mutagenesis // Clin. Chem. 1997. V. 43 P. 2429
  12. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis//J. Mol. Biol. 1975. V. 98 P. 503−517
  13. Conner B.J., Reyes A.A., Morin C., Itakura K., Teplitz R.L., Wallace R.B. Detection of sickle cell beta S-globin allele by hybridization with synthetic oligonucleotides // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1983. V. 80 P. 278−282
  14. Lilley D.M., Wilson T.J. Fluorescence resonance energy transfer as a structural tool for nucleic acids // Curr. Opin. Chem. Biol. 2000. V. 4 P. 507−517
  15. Cardullo R.A., Agrawal S., Flores C., Zamecnik P.C., Wolf D.E. Detection of nucleic acid hybridization by nonradiative fluorescence resonance energy transfer // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1988. V. 85 P. 8790−8794
  16. Bonnet G., Tyagi S., Libchaber A., Kramer F.R. Thermodynamic basis of the enhanced specificity of structured DNA probes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1999. V. 96 P. 6171−6176
  17. Maskos U., Southern E.M. Parallel analysis of oligodeoxyribonucleotide (oligonucleotide) interactions. I. Analysis of factors influencing oligonucleotide duplex formation // Nucleic Acids Res. 1992. V. 20 P. 1675−1678
  18. Relogio A., Schwager C., Richter A., Ansorge W., Valcarcel J. Optimization of oli-gonucleotide-based DNA microarrays // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30 P. e51
  19. Roberts R.W., Crothers D.M. Specificity and stringency in DNA triplex formation // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1991. V. 88 P. 9397−9401
  20. Bonnet G., Tyagi S., Libchaber A., Kramer F.R. Thermodynamic basis of the enhanced specificity of structured DNA probes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1999. V. 96 P. 6171−6176
  21. Tsourkas A., Behlke M.A., Rose S.D., Bao G. Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons//Nucleic Acids Res. 2003. V. 31 P. 1319−1330
  22. Livshits M.A., Ivanov I.B., Mirzabekov A.D., Florent’ev V.L. DNA sequencing by hybridization with an oligonucleotide matrix (SHOM). The theory of DNA elution after hybridization. //Mol. Biol. (Mosk) 1992. V. 26 P. 1298−1313
  23. Dai H., Meyer M., Stepaniants S., Ziman M., Stoughton R. Use of hybridization kinetics for differentiating specific from non-specific binding to oligonucleotide microarrays // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30 P. e86
  24. Parinov S., Barsky V., Yershov G., Kirillov E., Timofeev E., Belgovskiy A., Mirzabekov A. DNA sequencing by hybridization to microchip octa-and decanucleotides extended by stacked pentanucleotides // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24 P. 2998−3004
  25. Pyshnyi D.V., Lokhov S.G., Podyminogin M.A., Ivanova E.M., Zarytova V.F. A new strategy of discrimination of a point mutation by tandem of short oligonucleotides // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2000. V. 19 P. 1931−1941
  26. Maldonado-Rodriguez R., Espinosa-Lara M., Loyola-Abitia P., Beattie W.G., Beattie K.L. Mutation detection by stacking hybridization on genosensor arrays // Mol. Bio-technol. 1999. V. 11 P. 13−25
  27. Maldonado-Rodriguez R., Beattie K.L. Analysis of nucleic acids by tandem hybridization on oligonucleotide microarrays // Methods Mol. Biol. 2001. V. 170 P. 157−171
  28. Pyshnyi D.V., Pyshnaya I., Levina A., Goldberg E., Zarytova V., Knorre D., Ivanova E. Thermodynamic analysis of stacking hybridization of oligonucleotides with DNA template // J. Biomol. Struct. Dyn. 2001. V. 19 P. 555−570
  29. Pyshnyi D.V., Goldberg E.L., Ivanova E.M. Efficiency of coaxial stacking depends on the DNA duplex structure // J. Biomol. Struct. Dyn. 2003. V. 21 P. 459−468
  30. Pyshnyi D.V., Ivanova E.M. The influence of nearest neighbours on the efficiency of coaxial stacking at contiguous stacking hybridization of oligodeoxyribonucleotides // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2004. V. 23 P. 1057−1064
  31. Ratilainen Т., Holmen A., Tuite E., Nielsen P.E., Norden B. Thermodynamics of sequence-specific binding of PNA to DNA // Biochemistry 2000. V. 39 P. 7781−7791
  32. Mouritzen P., Nielsen A.T., Pfundheller H.M., Choleva Y., Kongsbak L., Moller S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA) // Expert. Rev. Mol. Diagn. 2003. V. 3 P. 27−38
  33. Wang S., Friedman A.E., Kool E.T. Origins of high sequence selectivity: a stopped-flow kinetics study of DNA/RNA hybridization by duplex- and triplex-forming oligonucleotides //Biochemistry 1995. V. 34P. 9774−9784
  34. Narayan C.C., Eric Т.К. Very High Affinity DNA Recognition by Bicyclic and Cross-Linked Oligonucleotides //J. Am. Chem. Soc.- 1995. V. 117 P. 10 434−10 442
  35. Guo Z., Liu Q., Smith L.M. Enhanced discrimination of single nucleotide polymorphisms by artificial mismatch hybridization // Nat.Biotechnol. 1997. V. 15 P. 331−335
  36. Pyshnaya I.A., Pyshnyi D.V., Lomzov A.A., Zarytova V.F., Ivanova E.M. The influence of the non-nucleotide insert on the hybridization properties of oligonucleotides // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2004. V. 23 P. 1065−1071
  37. Pyshnyi D.V., Lomzov A.A., Pyshnaya I.A., Ivanova E.M. Hybridization of the bridged oligonucleotides with DNA: thermodynamic and kinetic studies // J. Biomol. Struct. Dyn. 2006. V. 23 P. 567−580
  38. Ellington A.D., Szostak J.W. Selection in vitro of single-stranded DNA molecules that fold into specific ligand-binding structures // Nature 1992. V. 355 P. 850−852
  39. Cairns M.J., King A., Sun L.Q. Nucleic acid mutation analysis using catalytic DNA // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28 P. E9
  40. Н.Г., Грязнова О. И., Соколова Н. И., Шабарова З. А. Химические реакции в двуспиральных нуклеиновых кислотах II. Введение точечных модификаций в сахаро-фосфатный остав ДНК // Биорган. химия 2006. V. 12 Р. 921−928
  41. Xu Y., Kool Е.Т. High sequence fidelity in a non-enzymatic DNA autoligation reaction // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27 P. 875−881
  42. Landegren U., Kaiser R., Sanders J., Hood L. A ligase-mediated gene detection technique // Science 1988. V. 241 P. 1077−1080
  43. Wu D.Y., Wallace R.B. The ligation amplification reaction (LAR)~amplification of specific DNA sequences using sequential rounds of template-dependent ligation // Genomics 1989. V.4P. 560−569
  44. Harada K., Orgel L.E. Unexpected substrate specificity of T4 DNA ligase revealed by in vitro selection //Nucleic Acids Res. 1993. V. 21 P. 2287−2291
  45. James K.D., Boles A.R., Henckel D., Ellington A.D. The fidelity of template-directed oligonucleotide ligation and its relevance to DNA computation // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26 P. 5203−5211
  46. Tsytovich A.V., Dolinnaia N.G., Shabarova Z.A. T4-DNA ligase: substrate properties of synthetic DNA-duplexes with structural anomalies. // Mol. Biol. (Mosk) 1988. V. 22 P. 690−699
  47. Shilov I.A., Koroleva O.N., Drutsa V.L. Features of connecting short oligonucleotides with phage T4 DNA ligase. // Mol. Biol. (Mosk) 1993. V. 27 P. 647−654
  48. Barany F. Genetic disease detection and DNA amplification using cloned thermostable ligase // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1991. V. 88 P. 189−193
  49. Chen X., Livak K.J., Kwok P.Y. A homogeneous, ligase-mediated DNA diagnostic test // Genome Res. 1998. V. 8 P. 549−556
  50. Tang Z., Wang K., Tan W., Li J., Liu L., Guo Q., Meng X., Ma C., Huang S. Realtime monitoring of nucleic acid ligation in homogenous solutions using molecular beacons // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31 P. el48
  51. Stewart J., Kozlowski P., Sowden M., Messing E., Smith H.C. A quantitative assay for assessing allelic proportions by iterative gap ligation // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26 P. 961−966
  52. Liu Q., Thorland E.C., Heit J.A., Sommer S.S. Overlapping PCR for bidirectional PCR amplification of specific alleles: a rapid one-tube method for simultaneously differentiating homozygotes and heterozygotes // Genome Res. 1997. V. 7 P. 389−398
  53. Nazarenko I.A., Bhatnagar S.K., Hohman R.J. A closed tube format for amplification and detection of DNA based on energy transfer // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25 P. 2516−2521
  54. Holland P.M., Abramson R.D., Watson R., Gelfand D.H. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'—3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1991. V. 88 P. 7276−7280
  55. Lee L.G., Connell C.R., Bloch W. Allelic discrimination by nick-translation PCR with fluorogenic probes//Nucleic Acids Res. 1993. V. 21 P. 3761−3766
  56. Heid C.A., Stevens J., Livak K.J., Williams P.M. Real time quantitative PCR // Genome Res. 1996. V. 6 P. 986−994
  57. Orita M., Iwahana H., Kanazawa H., Hayashi K., Sekiya T. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1989. V. 86 P. 2766−2770
  58. Rossetti S., Englisch S., Bresin E., Pignatti P.F., Turco A.E. Detection of mutations in human genes by a new rapid method: cleavage fragment length polymorphism analysis (CFLPA) // Mol. Cell Probes 1997. V. 11 P. 155−160
  59. White M.B., Carvalho M., Derse D., O’Brien S.J., Dean M. Detecting single base substitutions as heteroduplex polymorphisms // Genomics 1992. V. 12 P. 301−306
  60. Myers R.M., Maniatis Т., Lerman L.S. Detection and localization of single base changes by denaturing gradient gel electrophoresis // Methods Enzymol. 1987. V. 155 P. 501−527
  61. Ke S.H., Wartell R.M. Influence of nearest neighbor sequence on the stability of base pair mismatches in long DNA- determination by temperature-gradient gel electrophoresis //Nucleic Acids Res. 1993. V. 21 P. 5137−5143
  62. Guldberg P., Guttler F. A simple method for identification of point mutations using denaturing gradient gel electrophoresis // Nucleic Acids Res. 1993. V. 21 P. 22 612 262
  63. Liu W., Smith D.I., Rechtzigel K.J., Thibodeau S.N., James C.D. Denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) used in the detection of germline and somatic mutations//Nucleic Acids Res. 1998. V. 26 P. 1396−1400
  64. Hecker K.H., Taylor P.D., Gjerde D.T. Mutation detection by denaturing DNA chromatography using fluorescently labeled polymerase chain reaction products // Anal. Biochem. 1999. V. 272 P. 156−164
  65. Novack D.F., Casna N.J., Fischer S.G., Ford J.P. Detection of single base-pair mismatches in DNA by chemical modification followed by electrophoresis in 15% poly-acrylamide gel // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1986. V. 83 P. 586−590
  66. Cotton R.G., Rodrigues N.R., Campbell R.D. Reactivity of cytosine and thymine in single-base-pair mismatches with hydroxylamine and osmium tetroxide and its application to the study of mutations // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1988. V. 85 P. 43 974 401
  67. Verpy E., Biasotto M., Meo Т., Tosi M. Efficient detection of point mutations on color-coded strands of target DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1994. V. 91 P. 1873−1877
  68. Ren J., Ulvik A., Refsum H., Ueland P.M. Chemical mismatch cleavage combined with capillary electrophoresis: detection of mutations exon 8 of the cystathionine beta-synthase gene // Clin. Chem. 1998. V. 44 P. 2108−2114
  69. Lambrinakos A., Humphrey K.E., Babon J. J., Ellis T.P., Cotton R.G. Reactivity of potassium permanganate and tetraethylammonium chloride with mismatched bases and a simple mutation detection protocol // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27 P. 1866−1874
  70. Lishanski A., Ostrander E.A., Rine J. Mutation detection by mismatch binding protein, MutS, in amplified DNA: application to the cystic fibrosis gene // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1994. V. 91 P. 2674−2678
  71. Wagner R., Debbie P., Radman M. Mutation detection using immobilized mismatch binding protein (MutS) // Nucleic Acids Res. 1995. V. 23 P. 3944−3948
  72. Ellis L.A., Taylor G.R., Banks R., Baumberg S. MutS binding protects heteroduplex DNA from exonuclease digestion in vitro: a simple method for detecting mutations // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22 P. 2710−2711
  73. Smith J., Modrich P. Mutation detection with MutH, MutL, and MutS mismatch repair proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1996. V. 93 P. 4374−4379
  74. Beaulieu M., Larson G.P., Geller L., Flanagan S.D., Krontiris T.G. PCR candidate region mismatch scanning: adaptation to quantitative, high-throughput genotyping // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29 P. 1114−1124
  75. Xu J.F., Yang Q.P., Chen J.Y., van Baalen M.R., Hsu I.C. Determining the site and nature of DNA mutations with the cloned MutY mismatch repair enzyme // Carcinogenesis 1996. V. 17 P. 321−326
  76. Maulik G., Botchway S., Chakrabarti S., Tetradis S., Price В., Makrigiorgos G.M. Novel non-isotopic detection of MutY enzyme-recognized mismatches in DNA via ultrasensitive detection of aldehydes // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27 P. 1316−1322
  77. Chakrabarti S., Price B.D., Tetradis S., Fox E.A., Zhang Y., Maulik G., Makrigiorgos G.M. Highly selective isolation of unknown mutations in diverse DNA fragments: toward new multiplex screening in cancer // Cancer Res. 2000. V. 60 P. 3732−3737
  78. Myers R.M., Larin Z., Maniatis T. Detection of single base substitutions by ribonucle-ase cleavage at mismatches in RNA.-DNA duplexes // Science 1985. V. 230 P. 12 421 246
  79. Шабарова 3.A., Богданов A.A. Химия нуклеиновых кислот и их компонентов // Москва: издательство «Химия» 1978.
  80. Youil R., Kemper B.W., Cotton R.G. Screening for mutations by enzyme mismatch cleavage with T4 endonuclease VII // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1995. V. 92 P. 8791
  81. Del T.B., Jr., Poff H.E., III, Novotny M.A., Cartledge D.M., Walker R.I., Earl C.D., Bailey A.L. Automated fluorescent analysis procedure for enzymatic mutation detection // Clin. Chem. 1998. V. 44 P. 731−739
  82. Mashal R.D., Koontz J., Sklar J. Detection of mutations by cleavage of DNA hetero-duplexes with bacteriophage resolvases // Nat. Genet. 1995. V. 9 P. 177−183
  83. Howard J.T., Ward J., Watson J.N., Roux K.H. Heteroduplex cleavage analysis using SI nuclease // Biotechniques 1999. V. 27 P. 18−19
  84. Oleykowski C.A., Bronson Mullins C.R., Godwin A.K., Yeung A.T. Mutation detection using a novel plant endonuclease // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26 P. 4597−4602
  85. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1977. V. 74 P. 5463−5467
  86. Smith L.M., Sanders J.Z., Kaiser R.J., Hughes P., Dodd C., Connell C.R., Heiner C., Kent S.B., Hood L.E. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis // Nature 1986. V. 321 P. 674−679
  87. Bowling J.M., Bruner K.L., Cmarik J.L., Tibbetts C. Neighboring nucleotide interactions during DNA sequencing gel electrophoresis // Nucleic Acids Res. 1991. V. 19 P. 3089−3097
  88. Yamakawa H., Ohara О. A DNA cycle sequencing reaction that minimizes compressions on automated fluorescent sequencers // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25 P. 1311−1312
  89. Louis J.R., Robert J.L. Nondestructive laser vaporization of high molecular weight, single-stranded DNA // J. Am. Chem. Soc.- 1991. V. 113 P. 9665
  90. Edwards J.R., Itagaki Y., Ju J. DNA sequencing using biotinylated dideoxynucleotides and mass spectrometry // Nucleic Acids Res. 2001. V. 29 P. El04
  91. Hyman E.D. A new method of sequencing DNA // Anal. Biochem. 1988. V. 174 P. 423−436
  92. Ronaghi M., Uhlen M., Nyren P. A sequencing method based on real-time pyrophosphate // Science 1998. V. 281 P. 363,365
  93. Garcia C.A., Ahmadian A., Gharizadeh В., Lundeberg J., Ronaghi M., Nyren P. Mutation detection by pyrosequencing: sequencing of exons 5−8 of the p53 tumor suppressor gene // Gene 2000. V. 253 P. 249−257
  94. Nordstrom Т., Ronaghi M., Forsberg L., de F.U., Morgenstern R., Nyren P. Direct analysis of single-nucleotide polymorphism on double-stranded DNA by pyrosequencing // Biotechnol. Appl. Biochem. 2000. V. 31 (Pt 2) P. 107−112
  95. ИЗ. Четверин А. Б., Четверина E.B. Научные и практические приложения молекулярных колоний // Молекулярная биология 2007. V. 41 Р. 284−296
  96. Mitra R.D., Shendure J., Olejnik J., Edyta K.O., Church G.M. Fluorescent in situ sequencing on polymerase colonies //Anal. Biochem. 2003. V. 320 P. 55−65
  97. Seo T.S., Bai X., Kim D.H., Meng Q., Shi S., Ruparel H., Li Z., Turro N.J., Ju J. Four-color DNA sequencing by synthesis on a chip using photocleavable fluorescent nucleotides // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2005. V. 102 P. 5926−5931
  98. Maxam A.M., Gilbert W. A new method for sequencing DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A 1977. V.74P. 560−564
  99. Ohara R., Tanaka A., Ohara O. Automated fluorescent DNA sequencing by a simplified solid-phase chemical sequencing method // Biotechniques 1997. V. 22 P. 653−656
  100. Isola N. R, Allman S.L., Golovlov V.V., Chen C.H. Chemical cleavage sequencing of DNA using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry // Anal. Chem. 1999. V. 71 P. 2266−2269
  101. Eigen M., Rigler R. Sorting single molecules: application to diagnostics and evolutionary biotechnology// Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1994. V. 91 P. 5740−5747
  102. Nie S., Emory S.R. Probing Single Molecules and Single Nanoparticles by Surface-Enhanced Raman Scattering // Science 1997. V. 275 P. 1102−1106
  103. Landegren U., Nilsson M., Kwok P.Y. Reading bits of genetic information: methods for single-nucleotide polymorphism analysis // Genome Res. 1998. V. 8 P. 769−776
  104. Kwok P.Y. Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms // Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2001. V. 2 P. 235−258
  105. Ed.G.D.Fasman Handbook of biochemistry and molecular biology: Nucleic Acids // Cleveland: CRC Press 1975. V. 1 P. 589
  106. Berkner K.L., Folk W.R. Polynucleotide kinase exchange reaction: quantitave assay for restriction endonuclease-generated 5'-phosphoroyl termini in DNA // J. Biol. Chem. 1977. V. 252 P. 3176−3184
  107. A.B., Иванова E.M., Кобец Н. Д. Синтез олигодезоксириботимиди-дата, содержащего алкилирующую группу и остаток биотина, для направленной модификации хроматина // Биоорган, химия 1993. V. 19 Р. 81
  108. SantaLucia J., Jr. A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1998. V. 95 P. 1460−1465
  109. Allawi H.T., SantaLucia J., Jr. Thermodynamics and NMR of internal G. T mismatches in DNA // Biochemistry 1997. V. 36 P. 10 581−10 594
  110. Allawi H.T., SantaLucia J., Jr. Nearest-neighbor thermodynamics of internal A. C mismatches in DNA: sequence dependence and pH effects // Biochemistry 1998. V. 37 P. 9435−9444
  111. Allawi H.T., SantaLucia J., Jr. Nearest neighbor thermodynamic parameters for internal G. A mismatches in DNA // Biochemistry 1998. V. 37 P. 2170−2179
  112. Peyret N., Seneviratne P.A., Allawi H.T., SantaLucia J., Jr. Nearest-neighbor thermodynamics and NMR of DNA sequences with internal A. A, C. C, G. G, and T. T mismatches // Biochemistry 1999. V. 38 P. 3468−3477
  113. Allawi H.T., SantaLucia J., Jr. Thermodynamics of internal C. T mismatches in DNA // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26 P. 2694−2701
  114. С.М., Адаричев В. А., Дымшиц Г. М. Иммобилизация ДНК на микропористых мембрана с помощью УФ-облучения // Биоорган, химия 1992. V. 18 Р. 52−62
  115. Pyshnyi D.V., Lokhov S.G., Podyminogin М.А., Ivanova E.M., Zarytova V.F. A new strategy of discrimination of a point mutation by tandem of short oligonucleotides // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2000. V. 19 P. 1931−1941
  116. Saiki R.K., Walsh P. S., Levenson C.H., Erlich H.A. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1989. V. 86 P. 6230−6234
  117. Pyshnyi D.V., Lokhov S.G., Podyminogin M.A., Ivanova E.M., Zarytova V.F. A new strategy of discrimination of a point mutation by tandem of short oligonucleotides // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2000. V. 19 P. 1931−1941
  118. Riordan J.R., Rommens J.M., Kerem В., Alon N., Rozmahel R., Grzelczak Z., Zielenski J., Lok S., Plavsic N., Chou J.L.,. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA // Science 1989. V. 245 P. 10 661 073
  119. Kerem В., Rommens J.M., Buchanan J.A., Markiewicz D., Cox Т.К., Chakravarti A., Buchwald M., Tsui L.C. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis // Science 1989. V. 245 P. 1073−1080
  120. A.B., Долинная Н. Г., Шабарова 3.A. Т4-ДНК-лигаза: субстратные свойства синтетических ДНК-дуплексов со структурными аномалиями // Молекуляр. биол. 1988. V. 22 Р. 690−699
  121. Vessman J., Stefan R.I., Van Staden J.F., Danzer K., Lindner W., Burns D.T., Fajgelj A., Muller H. Selectivity in analytical chemistry // Pure and Applied Chemistry 2001. V. 73 P. 1381−1386
  122. SantaLucia J., Jr., Hicks D. The thermodynamics of DNA structural motifs // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2004. V. 33 P. 415−440
  123. Monia B.P., Johnston J.F., Ecker D.J., Zounes M.A., Lima W.F., Freier S.M. Selective inhibition of mutant Ha-ras mRNA expression by antisense oligonucleotides // J. Biol. Chem. 1992. V. 267 P. 19 954−19 962
  124. Hearst J.E. A photochemical investigation of the dynamics of oligonucleotide hybridization//Annu. Rev. Phys. Chem. 1988. V. 39 P. 291−315
  125. Shortreed M.R., Chang S.B., Hong D., Phillips M., Campion В., Tulpan D.C., An-dronescu M., Condon A., Hoos H.H., Smith L.M. A thermodynamic approach to designing structure-free combinatorial DNA word sets // Nucleic Acids Res. 2005. V. 33 P. 4965−4977
  126. Jacobsen N., Bentzen J., Meldgaard M., Jakobsen M.H., Fenger M., Kauppinen S., Skouv J. LNA-enhanced detection of single nucleotide polymoiphisms in the apolipo-protein E // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30 P. elOO
  127. Jacobsen N., Fenger M., Bentzen J., Rasmussen S.L., Jakobsen M.H., Fenstholt J., Skouv J. Genotyping of the apolipoprotein В R3500Q mutation using immobilized locked nucleic acid capture probes // Clin. Chem. 2002. V. 48 P. 657−660
  128. Seela F., Peng X., Li H. Base-pairing, tautomerism, and mismatch discrimination of 7-halogenated 7-deaza-2'-deoxyisoguanosine: oligonucleotide duplexes with parallel and antiparallel chain orientation//J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127 P. 7739−7751
  129. You Y., Moreira B.G., Behlke M.A., Owczarzy R. Design of LNA probes that improve mismatch discrimination // Nucleic Acids Res. 2006. V. 34 P. e60
  130. Livshits M.A., Mirzabekov A.D. Calculation of kinetics of hybridization of DNA with oligonucleotides fixed in a gel layer. // Mol. Biol. (Mosk) 1996. V. 30 P. 11 581 164
  131. Shuman S. Vaccinia virus DNA ligase: specificity, fidelity, and inhibition // Biochemistry 1995. V. 34 P. 16 138−16 147
  132. Aoi Y., Yoshinobu Т., Tanizawa K., Kinoshita K., Iwasaki H. Ligation errors in DNA computing // Biosystems 1999. V. 52 P. 181−187
  133. Bhagwat A.S., Sanderson R.J., Lindahl T. Delayed DNA joining at 3' mismatches by human DNA ligases // Nucleic Acids Res. 1999. V. 27 P. 4028−4033
  134. Tong J., Barany F., Cao W. Ligation reaction specificities of an NAD (+)-dependent DNA ligase from the hyperthermophile Aquifex aeolicus // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28 P. 1447−1454
  135. Gupta N.K., Ohtsuka E., Weber H., Chang S.H., Khorana H.G. Studies on polynucleotides. LXXXVII. The joining of short deoxyribopolynucleotides by DNA-joining enzymes // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1968. V. 60 P. 285−292
  136. Olivera B.M., Lehman I.R. Enzymic joining of polynucleotides. 3. The polydeoxyade-nylate-polydeoxythymidylate homopolymer pair // J. Mol. Biol. 1968. V. 36 P. 261 274
  137. Koroleva O.N., Drutsa V.L. Controlled ligation of oligodeoxyribonucleotides of DNA-ligase of the T4 phage. //Mol. Biol. (Mosk) 1988. V. 22 P. 1632−1641
  138. Shilov I.A., Koroleva O.N., Drutsa V.L. Features of connecting short oligonucleotides with phage T4 DNA ligase. // Mol. Biol. (Mosk) 1993. V. 27 P. 647−654
  139. Cai L., Ни C., Shen S., Wang W., Huang W. Characterization of bacteriophage T3 DNA ligase // J. Biochem. (Tokyo) 2004. V. 135 P. 397−403
  140. Odell M., Shuman S. Footprinting of Chlorella virus DNA ligase bound at a nick in duplex DNA // J. Biol. Chem. 1999. V. 274 P. 14 032−14 039
  141. Doherty A.J., Dafforn T.R. Nick recognition by DNA ligases // J. Mol. Biol. 2000. V. 296 P. 43−56
  142. Ng P. S., Bergstrom D.E. Protein-DNA footprinting by endcapped duplex oligodeoxyribonucleotides //Nucleic Acids Res. 2004. V. 32 P. el07
  143. Koo H.S., Crothers D.M. Calibration of DNA curvature and a unified description of sequence-directed bending // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 1988. V. 85 P. 1763−1767
  144. Wu D.Y., Wallace R.B. Specificity of the nick-closing activity of bacteriophage T4 DNA ligase // Gene 1989. V. 76 P. 245−254
  145. Lehman I JR. DNA ligase: structure, mechanism, and function // Science 1974. V. 186 P. 790−797
  146. Nilsson S.V., Magnusson G. Sealing of gaps in duplex DNA by T4 DNA ligase // Nucleic Acids Res. 1982. V. 10 P. 1425−1437
  147. Rossi R., Montecucco A., Ciarrocchi G., Biamonti G. Functional characterization of the T4 DNA ligase: a new insight into the mechanism of action // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25 P. 2106−2113
  148. Raae A. J., Kleppe R.K., Kleppe K. Kinetics and effect of salts and polyamines on T4 polynucleotide ligase // Eur. J. Biochem. 1975. V. 60 P. 437−443
  149. С.Д., Гуревич К. Г. Биокинетика. Практический курс // М.: Фаир-Пресс 1999.
  150. Cherepanov A.V., de V.S. Kinetics and thermodynamics of nick sealing by T4 DNA ligase // Eur. J. Biochem. 2003. V. 270 P. 4315−4325
  151. Pyshnyi D.V., Goldberg E.L., Ivanova E.M. Efficiency of coaxial stacking depends on the DNA duplex structure // J. Biomol. Struct. Dyn. 2003. V. 21 P. 459−468
  152. Pyshnyi D.V., Ivanova E.M. The influence of nearest neighbours on the efficiency of coaxial stacking at contiguous stacking hybridization of oligodeoxyribonucleotides // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 2004. V. 23 P. 1057−1064
  153. Nelder J.A., Mead R. A simplex method for function minimization // Computer Journal 1965. V. 7 P. 308−313
Заполнить форму текущей работой

На отлично!