BI
Системы рестрикции — модификации (Р-М) широко распространены среди различных микроорганизмов. К настоящему времени обнаружено и охарактеризовано свыше 3000 различных систем Р-М с более чем 200 специфичностями (Roberts and Macelis, 1998). Основная функция систем Р-М II типа, компонентами которой являются эндонуклеазы рестрикции (ЭР) и модифицирующие ДНК-метилтрансферазы (МТ), сводятся к защите бактериальной клетки-хозяина от проникновения чужеродной ДНК. Имеются также данные о том, что ферменты рестрикции и модификации могут оказывать влияние на такие важнейшие клеточные процессы, как репликация, транскрипция, транспозиция и рекомбинация.
ЭР и МТ широко используют в качестве инструментов в генно-инженерных работах при получении рекомбинантных ДНК в биологии, в медицине и в сельскохозяйственной биотехнологии. Это, в первую очередь, определяет актуальность прикладного аспекта изучения систем Р-М, заключающегося в поиске штаммов с новыми специфичностями, в получении высокоэффективных продуцентов ферментов.
Ферменты систем Р-М являются также привлекательной моделью для изучения белок-нуклеинового и белок-белкового взаимодействия, благодаря широкому разнообразию последовательностей узнаваемой ДНК, высокой специфичности ферментов и тому обстоятельству, что для многих из них известны аминокислотные последовательности и для более чем 15 белков сделан рентгеноструктурный анализ. В последнее время системы Р-М все больше привлекают исследователей с точки зрения изучения регуляции экспрессии генов. Продукты генов системы — МТ и ЭР — являются белками, составляющими защитную систему клетки, регуляция экспрессии их генов важна для выживания хозяйского организма. Основной смысл регуляции активностей генов в системах Р-М — предотвращение авторестрикции, т. е. клеточная ДНК должна быть полностью модифицирована к моменту появления эндонуклеазной активности. Поскольку многие гены систем Р-М локализованы на плазмидах, генная регуляция важна не только для предотвращения фрагментации ДНК хозяйского организма, но и для проникновения и установления системы Р-М в новой клетке-хозяине. Механизмы регуляции активности генов в системах Р-М различны и требуют детального изучения для каждой из систем. Объектом нашего исследования является система Р-М С/гШ, обнаруженная на природной плазмиде в штамме Citrobacter freundii 4111. Гены системы R-M CfrBl расположены дивергентно и их промоторные области в значительной степени перекрываются. Уникальный для всей последовательности генов сайт CfrBl локализован в межгенной области. Перекрывание промоторных областей генов и расположение уникального сайта CfrBl в этой области перекрывания делает эту систему привлекательной моделью для исследования регуляции экспрессии генов.
Настоящая диссертационная работа посвящена исследованию структурно-функциональной организации системы рестрикции-модификации CfrBl, характеристике специфичности ферментов, кодируемых генами этой системой, и изучению механизма регуляции экспрессии генов cfrBIM и cfrBIR. Исходя из этого, в работе последовательно решались следующие задачи:
1. Идентифицировать генетические детерминанты системы Р-М CfrBl, обнаруженной на природной плазмиде клинического штамма Citrobacter freundii.
2. Клонировать гены cfrBIM и cfrBIR и определить их нуклеотидные последовательности. Охарактеризовать генетическую организацию системы Р-М CfrBl.
3. Сконструировать штаммы с увеличенным синтезом ферментов системы, для получения высокоактивных и гомогенных препаратов МТ и ЭР.
4. Определить последовательность узнавания и место гидролиза фосфодиэфирной связи для R. C/rBI.
5. Определить тип модификации, осуществляемый M. C/rBI, и положение цитозинового основания в сайте CfrBl, подвергающегося метилированию.
6. Изучить механизм регуляции экспрессии генов системы Р-М CfrBl.
Работа выполнена в ВНТК «Генная активность» Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН.
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
выводы.
1. Определена первичная структура генов системы рестрикции-модификации CfrBl и установлено, что гены системы расположены дивергентно относительно друг друга. В области перекрывания промоторов генов cfrBIM и cfrBIR расположен уникальный для всей последовательности системы рестрикции-модификации сайт CfrBl.
2. Сконструированы штаммы-продуценты эндонуклеазы рестрикции CfrBl и ДНК-метилтрансферазы CfrBl. Разработана схема очистки гомогенного препарата фермента ДНК-метилтрансферазы CfrBl.
3. Определен сайт узнавания и место гидролиза фосфодиэфирной связи эндонуклеазы рестрикции CfrBl. Показано, что метилтрансфераза CfrBl относится к классу N4-цитозиновых метилтрансфераз и метилирует наружный цитозин в последовательности 5'-4mCCWWGG -3'.
4. Предложена и экспериментально подтверждена новая модель регуляции экспрессии генов систем рестрикции-модификации. Впервые показано участие N4mC остатков ДНК в регуляции экспрессии генов на уровне транскрипции.