Структурно-функциональная организация обонятельной системы рыб

Принцип организации ОС у животных филогенетически далеких таксонов (моллюски, насекомые, десятиногие раки и позвоночные) одинаков. Столь удивительная общая морфологическая схожесть ОС, не гомологичной по происхождению, у этих животных определяется, во-первых, каскадом генов раннего развития и транскрипции — Нох, Dix и Pax, которые у них гомологичные (Franco et al., 2001; Ledje et al., 2002; Long et al., 2003), и, во-вторых, — конвергентной адаптацией (Eisthen, 2002). Построение ОС у животных различных phyla подобное, но не идентичное. Различия наблюдаются как на молекулярном, так и на морфологическом уровне. К настоящему времени накоплено много примеров, показывающих, что у очень далеких таксонов молекулярное обеспечение и морфологическое построение ОС близко, а у филогенетически родственных несколько отличается (Krieger, Breer, 1999; Zufall et al., 2000; Scott et al., 2001; Sullivan, Beltz, 2001; Eisthen, 2002).

Среди позвоночных животных большой интерес представляют костистые рыбы вследствие их филогенетического положения и адаптивных возможностей. Это самая большая группа позвоночных, включающая приблизительно 24 000 видов и составляющая больше, чем 99% Actinopterygii, лучеперых рыб (Taylor, 2001; Christoffels, 2004).

Несмотря на большое сходство у позвоночных двух филогенетических линий, Actinopterygii и Sarcopterygii, построение ОС несколько различается анатомически, морфологически и, по-видимому, нейрохимически, что связано с задачами системы и средой обитания. ОС Sarcopterygii, особенно у млекопитающих, изучена более подробно, чем первой группы. Прогресс ОС в обеих группах в первую очередь связан с увеличением количества генов рецепторных белков. Это привело к усложнению морфологической организации обонятельной луковицы (OJI). Хотя слоистость OJI у костистых рыб выражена менее ярко, чем у млекопитающих, синоптическая организация клубочкового нейропиля не уступает им (Satou, 1990). Однако нейрохимическая организация OJI рыб только начинает исследоваться (Edwards, Michel, 2002, 2003), а отдельные работы по исследованию распределения холинергических ферментов OJI рыб показывают, что холинергическая система в OJI рыб может существенно отличаться от амфибий и млекопитающих. Ионные и молекулярные механизмы трансдукции у рыб также менее изучены (Kaneko et al., 2001).

Из-за недостаточной изученности ОС костистых рыб не возможно делать выводы о причинах (адаптация к условиям среды, анцестральные признаки или положение животного в эволюционном ряду) различий в морфологической и молекулярной организации ОС Actinopterygii и Sarcopterygii.

В связи с этим исследования по таким проблемам, как нейрохимическая организация OJI, первичные механизмы трансдукции обонятельного сигнала, гомеостаз ионного окружения апикальной части обонятельных рецепторных нейронов и защита её от неблагоприятных эндогенных и экзогенных факторов у костистых рыб, являются актуальным направлением в сенсорной и эволюционной физиологии.

Цель работы: установить особенности структурно-функциональной организации обонятельной выстилки и луковицы костистых рыб и выяснить обуславливающие их причины.

Для достижения цели решались следующиезадачи:

1. На гистои цитологических уровнях исследовать морфологию и сенсорные функции обонятельного эпителия при воздействии низких значений pH и сублетальной концентрации ксенобитика, 0,0-диметил-0-(2,2-дихлорвинил) фосфата (ДЦВФ).

2. Установить концентрацию основных ионов (Na+, К+, С1-) в слизи на поверхности обонятельной выстилки, выяснить механизм, создающий ионный гомеостаз в слизи и установить участвующие в этом процессе структуры.

3. Установить роль ионов натрия, калия и хлора в генерации рецепторного потенциала.

4. Провести исследование влияния холинергических и NO-ергических веществ на рецепторный потенциал (ЭОГ) у интактных рыб и адаптированных к следовым концентрациям кальция.

5. Провести биохимическое, гистохимическое и итохимическое исследование распределения ацетилхолинэстеразы (ацетилхолин ацетилгидролаза, АХЭК.Ф. 3.1.1.8) и холинацетилрансферазы (ацетил-КоА: холин-О-ацетилтрансфераза, ХАТФК.Ф. 2.3.1.6) в обонятельной луковице у рыб из различных систематических групп и выяснить роль эндогенного ацетилхолина обонятельной луковицы в процессах восприятия запаха.

6. Сопоставить полученные результаты с имеющимися в литературе данными по затронутой проблеме на других филогенетических группах животных и установить, какие особенности организации ОС костистых рыб обусловлены конвергентной адаптацией, а какие — анцестральными признаками.

Научная новизна. В работе впервые рассмотрена холинергическая нейрохимическая организация ОС рыб. Впервые установлено, что удельная активность АХЭ в ОС рыб зависит от обонятельной способности как вида, так и особи. Показано, что распределение АХЭ в ОЛ асимметрично: в медиальной части этого фермента больше, чем в латеральной. В этих же частях луковицы АХЭ потенциируется одорантами различных классов. Впервые установлена зависимость удельной активности АХЭ обонятельной луковицы рыб от состояния афферентного входа. Впервые выявлено, что в ОЛ рыб имеются АХЭ-позитивные митральные клетки и веретеновидные клетки. Активность фермента в них зависит от афферентного входа. Внутриклеточная ультраструктурная локализация АХЭ свидетельствует, что эти клетки могут синтезировать ацетилхолин. Впервые показано, что в некоторых асимметричных синапсах АХЭ локализуется на преи постсинаптических мембранах. Исходя из их морфологии и расположения в ОЛ, можно предположить, что они относятся к аксо-дендритным синапсам между рецепторными аксонами и дендритом митральной клетки, а также к денро-дендритными между интернейроном и релейным нейроном. Впервые установлено, что в ОЛ рыб содержатся ХАТФ-позитивные нейроны и синапсы. Впервые показано, что в О Л рыб имеются М1 и М2 холинорецепторы (ХР). Функциональная активность подтипа М1-ХР проявляется только при запоминании запаха, (долговременная посттетаническая потенциация после тетанизации обонятельного нерва), в то время как М2-ХР осуществляют модулирующее влияние на релейные нейроны, участвуя, скорее всего, в первичной обработке обонятельного сигнала. Предлагается гипотеза, что обонятельная луковица рыб, независимо от степени развития обоняния, имеет собственную холинергическую систему. Впервые установлено, что в обонятельном эпителии рыб имеются специализированные микровиллярные клетки, ответственные за защиту ОВ от ксенобиотиков. Впервые определено, что у пресноводных рыб концентрация ионов хлора в обонятельной слизи сравнима с их содержанием в плазме. Поддержание столь высокой концентрации ионов в слизи, которая непосредственно контактирует с пресной водой, осуществляется специализированными ионтранспортирующими клетками. Впервые установлено, что в возникновении рецепторного потенциала (ЭОГ) ведущая роль принадлежит ионам хлора и кальция и показано, что при дефиците ионов кальция во внешней среде в процессах трансдукции обонятельного сигнала может участвовать Са2+ из внутриклеточных депо кальция.

Теоретическое и практическое значение работы. Проведенное исследование вносит несомненный вклад в решение фундаментальной проблемы эволюции развития обонятельной системы у животных. Описанные взаимодействия на клеточном, молекулярном и функциональном уровнях в обонятельной выстилке и луковице костистых рыб свидетельствуют, что у них присутствует много анцестральных признаков, различия между филогенетическими группами позвоночных обусловлены ходом эволюции и принципиальных отличий в ОС не наблюдается. Однако по организации холинергического входа в обонятельную луковицу костистые рыбы резко отличаются от 8агсор1егуди и очень схожи с беспозвоночными. Это еще один пример конвергентной адаптации в развитии обонятельной системы животных.

На основании анализа собственных и литературных данных разработан простой и экспрессный способ определения функционального развития обонятельной и зрительной сенсорных систем у рыб (авторское свидетельство № 1 423 075).

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Защиту апикальной части обонятельного эпителия от ксенобиотиков и излишка одорантов выполняют специализированные клетки эпителия — микровиллярные опорные клетки лимфоидного типа.

2. В рецепторном отделе обонятельной выстилки рыб поддержание ионного гомеостаза обеспечивают специализированные ионтранспортирующие клетки.

3. Ведущим ионом в трансдукции обонятельного сигнала у рыб является хлор. Вследствие повышенной концентрации в рецепторной клетке (за счет электрогенного транспорта) при открытии хлорных кальций-зависимых каналов он выходит из клетки и создается входящий деполяризующийся ток. Хлорными каналами в основном управляют инозитол-1,4,5-трифосфат и ионы кальция.

4. Обонятельная луковица костистых рыб имеет холинергический вход и собственную холинергическую систему, которая участвует как в первичной обработке обонятельного сигнала, так и в запоминании запаха.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Представленные в диссертации материалы были доложены на: «Всес. совещании «Сенсорная физиология морских рыб» (Мурманск, 1984) — Всес. конференции «Экология и биологическая продуктивность Баренцевого моря» (Мурманск, 1986) — V Всес. конференции по водной токсикологии (Одесса, 1988) — VI Всес. симпозиуме «Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций» (Петрозаводск, 1988) — VI Всес. симпозиуме «Механизмы сенсорной рецепции» .

Москва, 1988) — Всес. совещании «Хемокоммуникация животных» (Москва, 1989) — X Всес. совещании по эволюционной физиологии памяти Л. А. Орбели (Ленинград, 1990) — VII научной конференции по экологической физиологии и биохимии рыб (Петрозаводск, 1992) — The 15th Intracenter Workshop. (Columbia, USA, 1992) — I Междунар. симпозиуме «Зооиндикация и эктотоксикология животных в условиях техногенного ландшафта» (Днепропетровск, 1993) — International symposium «Chemoreception in aquatic vertebrates» (Noresund, Norway, 1994) — II Всероссийском совещании по поведению рыб (Борок, 1996) — International symposium on Olfaction and Taste, XII and AChemS, XIX (San Diego, California, 1997) — III междунар. конференции «Биологические ресурсы Белого моря и внутренних вод европейского Севера» (Сыктывкар, 2003) — Междунар. научной конференции «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2004).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликованы 42 научные работы.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Материал диссертации изложен на 221 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц, 3 7 схем и рисунков. Работа состоит из введения, б глав, выводов и списка цитируемой литературы (// 9 отечественных, 7SS иностранных источников).

Выводы.

1. Впервые показано, что обонятельная луковица костистых и костнохрящевых рыб, независимо от их обонятельных способностей имеет внутреннюю холинергическую систему, которая участвует как в первичной обработке обонятельной информации, так и в запоминании запахов.

2. Показано, что ортодромный потенциал, регистрируемый с поверхности обонятельной луковицы щуки и осетра, а также вызванная одорантом импульсная активность в обонятельном тракте карпа, модулируются холинергическими веществами.

3. Установлено, что в обонятельной выстилке и луковице удельная активность АХЭ зависит от обонятельной способности как вида, так и особи. Показано, что распределение АХЭ в обонятельной луковице рыб асимметрично: в медиальной части этого фермента больше, чем в латеральной. В этих же частях луковицы АХЭ потенциируется одорантами различных классов. Увеличение активности АХЭ в обонятельной луковице щуки в фазе развития посттетанической потенциации обусловлено синтезом фермента de novo.

4. В обонятельной луковице карпа имеются АХЭ-позитивные митральные клетки и веретеновидные клетки. В некоторых асимметричных синапсах АХЭ локализуется на преи постсинаптических мембранах. Эти синапсы относятся к аксо-дендритным синапсам между рецепторными аксонами и дендритом митральной клетки, а также к денро-дендритными между интернейроном и релейным нейроном. Внутриклеточная ультраструктурная локализация АХЭ свидетельствует, что эти клетки могут синтезировать ацетилхолин.

5. Обнаружено присутствие холинацетилтрансферазы, фермента синтезирующего ацетилхолин, в основных звеньях прямого афферентного пути — рецепторных аксонах, аксонных терминалях, аксодендритных синапсах и дендритах митральных клеток. Показано также наличие этого фермента в элементах дендритной сети, осуществляющей латеральную регуляцию внутри луковицы.

6. Установлено, что концентрация ионов хлора в слизи обонятельного эпителия соответствует концентрации их в плазме, натрия — значительно меньше, а калия — больше, чем в плазме. Ионный гомеостаз в слизи обонятельного эпителия пресноводных рыб поддерживается хлоридными клетками, транспортирующими ионы из организма в слизь.

7. В апикальной части обонятельной рецепторной клетки имеется система активного транспорта ионов хлора, создающая против электрохимического градиента повышенную концентрацию С1- в ней. Частью этой системы является С1-активируемая М^ АТРаза. Деполяризация большей части обонятельных рецепторных нейронов при рецепции аминои желчных кислот происходит в результате выхода ионов хлора из клетки в результате активации Са-зависимых хлорных каналов инозитол-1,4,5- трифосфатом.

8. На основе анализа экспериментальных данных, полученных в результате исследования холинергических составляющих обонятельной системы рыб, предложен количественный критерий (по активности АХЭ) оценки обонятельных способностей рыб.

9. Ацетилхолин и оксид азота принимают участие в перирецепторных процессах, обеспечивая выход ионов кальция из внутриклеточных депо. Особенно это проявляется при рецепции аминокислот у рыб, адаптированных к низкокальциевой среде.

10. Установлено, что в обонятельном эпителии рыб имеются две стратегии защиты от химических неблагоприятных факторов среды: в обонятельной выстилке обнаружены микровиллярные опорные клетки, выполняющие защитную функцию и обеспечивающие сохранность рецепторных элементов от воздействия ксенобиотиков.

— адаптация обонятельной системы к кислотному стрессу осуществляется за счет секреции слизи повышенной буферной емкостисекреторная активность клеток, секретирующих слизь, регулируется вегетативной нервной системой.

• Заключение.

В данной работе представлены экспериментально полученные функциональные и структурные характеристики периферического и первого центрального отделов обонятельной системы рыб и сопоставлены с литературными данными по другим филогенетически близким и далеким животным.

Установлено, что у рыб осуществление защиты обонятельного эпителия от неблагоприятных химических факторов окружающей среды сравнимо с таковым у млекопитающих. Показано, что у рыб в ОЭ, так же, как и у млекопитающих, присутствуют специализированные микровиллярные клетки, активизирующиеся при воздействии токсических веществ. Активное участие в защите ОЭ принимают секреторные клетки эпителия, которые не только усиливают секрецию, но и изменяют химический состав секретируемой ими слизи. Регуляция выделения слизи и ее химический состав находятся под контролем вегетативной нервной системы. Результаты наших экспериментов показывают, что у рыб защита ОЭ сравнима с таковой у млекопитающих. Однако на тетраподах эта проблема исследована шире. Показано, что выделение слизи контролируется как адренергической, так и холинергической системами, причем последняя управляет выделением слизи несколькими субтипами холинорецепторов, на которые ложится разная функциональная нагрузка (Okayama et al., 1993). Показано также, что животные, ведущие различный образ жизни, имеют различное оснащение ОЭ специализированными микровиллярными клетками (Ferrari et al., 1998,2000; Byrum et al., 2001).

При исследовании ионного состава обонятельной слизи пресноводных рыб установлено, что концентрация ионов хлора в ней соответствует концентрации их в плазме, а натрия — значительно меньше, чем в плазме. Установлено, что поток электролитов направлен из организма в слизь, транспорт их осуществляют специализированные клетки, так ф называемые хлоридные клетки, или, как сейчас принято — «mitochondria-rich cell» .

У млекопитающих и наземных амфибий обонятельная слизь и плазма не различаются по концентрациям этих ионов (Минор и др., 1990; Chiu et al., 1988; Grubb et al., 2002). В обонятельном эпителии наземных позвоночных электролиты поступают в слизь пассивно, вместе с секретирующейся слизью (Бронштейн, 1977), а гомеостаз ионов поддерживается активными электрогенными процессами — перемещением ионов из слизи внутрь организма (Persaund et al., 1987, 1988).

Показанное нами соотношение натрия и хлора в обонятельной слизи — скорее всего характерная особенность для всех обитателей пресных вод, у которых ОЭ контактирует с водой. В связи со столь необычным ионным окружением электрогенного участка рецепторного нейрона ведущим ионом в возникновении рецепторного потенциала становится хлор. У наземных же животных ионы хлора, хоть и играют важную роль в электрогенезе рецепторного потенциала, но выполняют только модулирующую роль, облегчая процессы возбуждения и восстановления (Kleene, Gesteland, 1991; Kleene, 1993; Kurahashi, Yau, 1993, 1994; Lowe, Gold, 1993; Firestein et al., 1994). На сегодняшний день, с получением новых результатов, ионам хлора в обонятельной трансдукции отводится еще большая роль (Reuter et al., 1998; Kaneko et al., 2001; Reisert et al, 2005). Обонятельная рецепторная клетка крыс выделяется среди других нейронов очень высокой концентрацией внутриклеточного [Cl" ]i — 70 — 80 мМ (Reuter et al., 1998; Kaneko et al., 2001) и внешним окружением этого иона (32 мМ) (Reuter et al., 1998). Против электрохимического градиента ионы хлора переносятся Na/K/2C1 котранспортером (NKCC1), который чувствителен к аналогам фуросемида (Reisert et al, 2005). По всей видимости, обнаруженная нами система АТФ зависимого транспорта СГ и фуросемд чувствительная С1-АТФаза в обонятельной выстилке рыб является гомологичной котранспортеру NKCC1 млекопитающих.

Исследование роли вторичных мессенджеров в восприятии одорантов показало, что общий принцип трансдукции у рыб схож со всеми другими изученными животными. Однако при оценке восприятия L-серина в широком диапазоне концентрации установлено, что внутриклеточный путь трансдукции этой АК зависит от ее концентрации (Гдовский, Ружинская, 2001). Этот механизм регуляции трансдукции может объяснить различные формы поведения рыб при восприятии одной и той же аминокислоты.

Особое место занимают результаты по исследованию холинергической (ХЕ) системы обонятельной луковицы рыб. Во-первых, в обонятельной луковице активность АХЭ распределена асимметрично. В медиальной части луковицы активность АХЭ достоверно больше на треть, чем в латеральной области (Ружинская, Гдовский, 1992). У рыб, в отличие от тетрапод, одна обонятельная система. Вомероназальная система, ответственная за восприятие половых феромонов отсутствует. Однако обонятельная луковица рыб разделяется функционально на латеральную и медиальную области при восприятии общих запахов (в том числе пищевых) и феромонов, соответственно (Ружинская, Гдовский, 1984, 1988; Dulka, 1993). Активация АХЭ в этих частях луковицы соответствует природе стимула (Ружинская, Гдовский, 1992). Во-вторых, получены убедительные доказательства, что у костистых рыб имеются прямой афферентный ХЕ вход в обонятельную луковицу и внутрилуковичная холинергическая система (Gdovskii, Ruzhinskaya, 1994;.Ружинская и др., 1997). Известно также, что у акул и голостей наблюдается схожая картина. У хрящевых рыб релейные нейроны являются и АХЭ-позитивными (Kusunoki et al., 1973), и ХАТФ-позитивными, а в латеральном обонятельном тракте проходят ХАТФ-позитивные волокна, которые могут быть аксонами этих клеток. Кроме того, в слое зернистых клеток имеется рассеянная популяция ХАТФ-позитивных клеток (Anadon et al., 2000). На другом представителе костных рыб, длинноносой щуке (Lepisteus osseus), показано, что слой зернистых клеток является АХЭ-положительным (Northcutt, Braford, 1977). Обонятельная луковица амфибий и млекопитающих не получает рецепторный афферентный ХЕ вход. Вследствие этого в первом слое OJI, слое волокон обонятельного нерва, отсутствуют АХЭ, ХАТФ и ХР (Le Jeune et al., 1993). Все ХЕ элементы внутренних слоев обонятельной луковицы млекопитающих и амфибий обусловлены ХЕ проекциями от базального переднего мозга (Рагимова, Крацкин, 1984; Крацкин, 1989; Senut et al., 1989; Marin et al., 1997). Установлено, что в OJI амфибий, насекомоядных и грызунов ХАТФ-позитивные клетки отсутствуют, а наблюдаются только волокна, приходящие в обонятельную луковицу по медиальному тракту (Le Jeune, Jordan, 1993; Crespo, 1999; Senut et al., 1989). В обонятельной луковице крыс АХЭ-позитивность проявляют кисточковые клетки, относящиеся к релейным нейронам, перигломерулярные и поверхностные короткоаксонные клетки — интернейроны (Nickell, Shipley, 1988; Le Jeune, Jordan', 1993; Kasa et al., 1995). Эти три типа холиноцептивных, нехолинергических нейронов являются основными мишенями холинергического входа из магноцелюлярного ядра переднего мозга. В связи с такой нейрохимической структурированностью ХЕ ферментов, АХ оказывает лишь модулирующее влияние на электрическую активность OJI у крыс. В конечном итоге ХЕ афференты, уменьшая тормозное действие интернейронов, могут облегчать передачу сигнала от релейных нейронов к центральным структурам (Ravel et al., 1990; Kasa et al., 1995; Castillo et al., 1999; Crespo et al., 2000).

Такое разительное различие ХЕ систем первого обонятельного центра у Actinopterygii и Sarcopterygii могло произойти по причине того, что у Actinopterygii переднее обонятельное ядро осталось в OJI, не мигрировало в передний мозг, как у тетрапод. Но это предположение может объяснить только внутрилуковичную ХЕ систему, связанную с внутренним клеточным слоем ОЛ. Но оно не затрагивает причин различия в афферентном входе. Можно предположить, что эласмобранхии и лучеперые рыбы — близкородственны, a Sarcopterygii имели независимого предка. Это может быть также обосновано альтернативной гипотезой основного древа позвоночных, подкрепленной большим генетическим материалом (Martin, 2001).

Однако может быть и другая причина. Рыбы по организации холинергического пути прохождения обонятельной информации в ассоциативные центры мозга в животном мире не исключение. Наблюдается поразительное сходство гистохимической, цитохимической организации ХЕ входа в обонятельную систему и функций ХЕ системы в осуществлении обработки обонятельной информации у этих несхожих по образу жизни и происхождению животных. У насекомых уровни АХ, АХЭ и ХАТФ повышаются быстро в лепестках с ростом аксонов обонятельных нейронов от антенн к обонятельным лепесткам, а в деафферентированных лепестках (удаление развивающихся антенн) уровни этих ферментов значительно уменьшаются (Sanes et al., 1977; Waldrop, Hildebrand, 1989). Установлено также, что холинергическая система проявляет селективность в восприятии запаха. Она, скорее всего, связана с обычными обонятельными рецепторными терминалями, а не с феромон чувствительными афферентами (Homberg et al., 1995). Таким образом, особенности организации ХЕ системы обонятельной луковицы рыб могут быть обусловлены не генетически-родственными причинами, а конвергентной адаптацией.