Прямая биоконверсия целлюлозосодержащих материалов термофильными анаэробами

Возрастающий интерес в настоящее время к методам утилизации целлюлозосодержащих отходов агропромышленного комплекса объясняется с одной стороны отсутствием каких либо экологически чистых технологий, обеспечивающих и экономический эффект. С другой стороны внимание мировой науки привлекает поиск направлений рационального использования для промышленных целей возобновляемых природных ресурсов (растительной биомассы), к которым можноА отнести и промышленные целлюлозосодержащие отходы.

Наиболее широко применяемым методом утилизации целлюлозных материалов является двухстадийный процесс: гидролиз — кислотный или ферментативный — с последующим сбраживанием полученного гидролизата дрожжами в этиловый спирт и углекислоту. Двустадийный процесс имеет ряд недостатков. Кислотный гидролиз относится к одному из наиболее экологически неблагоприятных производств. Ферментативный гидролиз более дорогой, поскольку требует создания дополнительной стадии производства целлюлолитических ферментов. В результате гидролиза образуется целый ряд сахаридов как гексозных так и пентозных. Использование дрожжевых культур обуславливает неполное усваивание субстрата, поскольку дрожжи ассимилируют только гексозные фракции — около 50% сырья.

Альтернативной, обладающей рядом преимуществ является технология прямой биоконверсии с использованием смешанной культуры термофильных анаэробных бактерий. Во-первых, процесс биоконверсии — одностадийный: ферментативный гидролиз сырья и сбраживание гидролизата до конечных продуктов осуществляются одними и теми же микроорганизмами. Во-вторых, использование термофильных анаэробов предполагает более низкие затраты на культивирование, поскольку не требуются высокая стерильность и аэрация среды. В-третьих, применение смешанных культур позволяет достигать более полной утилизации субстрата, так как в них присутствуют бактерии, ассимилирующие гексозы и пентозы (до 80−90%).

Путем биоконверсии можно утилизировать в одностадийном процессе отходы таких отраслей промышленности как целлюлозно-бумажная, пищевая, деревоперерабатывающая, текстильная, а также отходы сельского и коммунального хозяйства. Предлагаемые бактериальные ассоциации могут сбраживать закисленные стоки, поскольку являются толерантными к понижению рН. Технология биоконверсии может найти применение в различных отраслях промышленности в качестве дополнительной стадии утилизации целлюлозосодержащих отходов, использующей техническую базу основного производства, так как не нуждается в сложном оборудовании и специфических условиях. Рациональное использование производственных отходов позволит повышать как экономические, так и экологические показатели производства.

Поэтому исследования в области бактериальной конверсии возобновляемых природных ресурсов с использованием термофильных анаэробов являются на сегодняшний день весьма актуальными.

Настоящая работа посвящена разработке технологии утилизации целлюлозосодержащих материалов путем термофильной анаэробной биоконверсии, а также накоплению музея бактериальных культур для ее осуществления. Для достижения поставленной цели в ходе работы решались следующие задачи:

1.Выделение и первичная идентификация стабильных ассоциаций термофильных анаэробных бактерий, обладающих целлюлолитической активностью из различных природных источников, накопление музея термофильных анаэробных культур.

2. Селекция бактериальных ассоциаций различными методами для осуществления биоконверсии целлюлозосодержащего сырья.

3. Подбор методов хранения, гарантирующих стабильность видового состава бактериальных ассоциаций и технологических показателей культур.

4. Изучение влияния параметров культивирования на рост бактерий и выход продуктов брожения.

5. Анализ возможности утилизации различных видов целлюлозосодержащих отходов.

Практическое значение работы. 1. Полученные ассоциации термофильных анаэробных бактерий обладают физиологическими свойствами, которые позволяют применять технологию биоконверсии для решения проблем:

• утилизации промышленных целлюлозосодержащих отходов;

• повышения усвояемости и пищевой ценности грубых кормов для сельскохозяйственных животных;

• использования малоценной сырьевой базы для получения ценных продуктов;

• обезвреживания отходов целлюлозно-бумажного производства;

• получения экологически чистого (незакисленного) лигнина — фармацевтического адсорбента, структуратора почв, а также субстрата для культивирования базидиомицетов.

2. Разработан технологческий процесс биоконверсии целлюлозосодержащих отходов с использованием селекционированных бактериальных культур.

Исследовано влияние параметров культивирования на метаболизм полученных культур: рН среды, температуры роста, перемешивания культуральной среды и потребность в факторах роста.

Предложен способ организации стадии ферментации с накоплением конденсата паров, позволяющий использовать тепло процесса ферментации и облегчающий выделение летучих продуктов биоконверсии.

Проведенные исследования позволяют дать рекомендации по организации промышленного процесса биоконверсии как дополнительной стадии к основному производству и подготовить материалы для проектирования.

Работа выполнялась в МГУ инженерной экологии и ФГУП ГосНИИсинтезбелок. Часть работы, касающаяся выделение бактериальных культур и определения оптимальных параметров культивирования, выполнялась в 1999 году в соответствии с Межвузовской научно-технической программой «Биотехнология в Российских ВУЗах», возглавляемой РХТУ им. Д. И. Менделеева (Отчет по НИР «Разработка технологий биодеструкции нефтяных загрязнений, ультразвуковой обработки осадков сточных вод, биокаталитической обработки серосодержащих отходов и биоконверсии целлюлозосодержащих отходов», № государственной регистрации 01.99.11 012, инвентарный № 02.200 002 335).

В работе участвовали сотрудники аналитической лаборатории ФГУП ГосНИИсинтезбелок, проводившие анализы образцов культуральной жидкости на содержание этанола, органических кислотсотрудник института экологии и эволюции им. А. Н. Северцова РАН и биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова Ушакова Нина Александровна, любезно оказавшая содействие в изучении метода компьютерной морфометрии и оценке выделенных биоценозов на базе учебно-научного центра по компьютерному анализу изображений и автоматической морфометрии.

Основные публикации выполнены с соавторами Бирюковым В. В., Исаковой Е. П. и Поляковым А. Н. Исакова Е.П. осуществляла научное руководство биологической частью работы, в том числе экспериментами по выделению биоценозов, разделению их на монокультуры, а также экспериментами по селекции бактериальных ассоциаций. Поляков А. Н. участвовал в постановке задачи и оснащении экспериментальной установки, а также при разработке технологических приемов осуществления процесса биоконверсии. Бирюков В. В., как зав. кафедрой «Экологическая и промышленная биотехнология» МГУИЭ и зав. лабораторией ФГУП ГосНИИсинтезбелок принимал участие в обсуждении результатов и в формулировании задач исследования.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ.

1. Выделены из различных природных источников и охарактеризованы смешанные и монокультуры термофильных бактерий, способные конвертировать целлюлозосодержащие материалы. Проведена первичная идентификация бактериальных штаммов.

2. На основе выделенных природных бактериальных культур селекционированы ассоциаций с улучшенными технологическими свойствами для конвертирования целлюлозосодержащих отходов, а также получения различных продуктов (этанола и органических кислот). Это позволило увеличить концентрацию этанола в культуральной жидкости до 11−20 г/л, а уксусной кислоты — до 6−7 г/л.

Для искусственного формирования ассоциации термофильных анаэробов из монокультур предложено соединять культуры родов Clostridium, Thermoanaerobium и Thermoanaerobacter для обеспечения стабильности новой ассоциации.

3. Предложены методы хранения как смешанных культур, так и монокультур, гарантирующие стабильность ассоциаций и сохранение физиологических свойств бактерий при хранении.

4. Изучено влияние условий культивирования — температуры, рН среды, факторов роста, перемешивания — на рост культур и их метаболическую активность. Показана возможность регулирования синтеза этанола и уксусной кислоты путем изменения величины рН питательной среды и температуры культивирования. Даны рекомендации по выбору питательной среды в зависимости от целевого назначения процесса культивирования.

Установлено, что этанол ингибирует выделенные бактериальные ассоциации. Уже при содержании более 5% этилового спирта рост клеток снижается на 8−9%. В то же время.

188 уксусная кислота в изученном диапазоне концентраций не оказывает ингибирующего действия на бактерии.

Показано, что для процесса ферментации перемешивание не обязательно должно быть непрерывным, достаточно периодического включения мешалки, обеспечиваюш, его суспендирование твердой фазы.

5. Показано, что дробная подача нерастворимого субстрата в ферментационный объем повышает степень конверсии сырья на 50%.

Предложен способ осуш, ествления ферментации с промежуточным накоплением конденсата паров этанола путем кратковременного вакуумирования среды, обеспечивающий повышение концентрации этанола в выходном продукте в 10−15 раз.

6. Изучены направления применения процесса биоконверсии для получения ряда продуктов: этанола, органических кислот, кормов повышенной усвояемости, препарата целлюлолитических ферментов. Предложены возможные схемы процессов утилизации различных промышленных, сельскохозяйственных и муниципальных целлюлозосодержащих отходов. Даны рекомендации по выбору рабочей смешанной культуры бактерий в зависимости от вида целлюлозосодержащего сырья, а также от типа целевого продукта.