Получение новых полиметиновых красителей на основе бензоксазола и бензотиазола

Актуальность работы. Флуоресцентные зонды (ФЗ) являются важными химическими инструментами при исследованиях в различных областях молекулярной биологии и биохимии, а также широко используются в практической медицине при проведении диагностических тестов. Круг задач, решаемых с их помощью, непрерывно расширяется. В частности, они могут служить молекулярным инструментом для конструирования новых лекарственных препаратов. Поэтому получение и изучение свойств новых ФЗ остается предметом постоянного внимания исследователей.

Важное место среди ФЗ нуклеиновых кислот занимают симметричные монои триметиновые красители бензотиазольного и бензоксазольного рядов (так называемые ФЗ типа BOBO и POPO), широко используемые в генетических исследованиях и в современных диагностических методах, таких, как например, полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР применяется для диагностики рака на ранних стадиях заболевания, инфекционных заболеваний, в том числе СПИДа, при идентификации образцов ДНК в криминалистике и др.

ФЗ указанных типов в РФ не производятся, поэтому медицинские учреждения страны обеспечиваются ими по импорту. Поскольку биомедицинские технологии, в которых используются ФЗ типа BOBO и POPO, направлены на сохранение здоровья нации, то остро стоит проблема импортозамещения путем организации их отечественного производства.

Синтетическими прекурсорами (полупродуктами) этих ФЗ являются дифункциональные молекулы, «надстраивание» которых приводит как к целевым симметричным продуктам (бис-замещения), так и к побочным несимметричным (моно-замещения). В ключевых реакциях получения ФЗ указанного типа для генерирования промежуточных карбанионов используют основные агенты, что приводит к протеканию ряда нежелательных (побочных) реакций. Вопросы, связанные с увеличением выходов и повышением чистоты целевых ФЗ, в специальной литературе не отражены или отражены крайне скупо. Помимо синтетических, существуют и аналитические проблемы установления квалификации (чистоты и индивидуальности) синтезированных ФЗ и полупродуктов их синтеза, связанные с особенностями спектральных характеристик этих соединений, практически не освещенными в специальной литературе. Без решения обозначенных проблем невозможно наладить рентабельный синтез ФЗ должной квалификации как в лабораторных, так и в опытно-промышленных условиях.

Представлялось весьма актуальным: (а) изучить существующие методы получения ФЗ типа BOBO и POPO в расчете овладеть технологиями их синтеза- (б) разработать новые, более рациональные методы получения ФЗ указанного типа- (в) а также попутно синтезировать оригинальные красители в качестве потенциальных зондов.

Основной целью данной работы является разработка научных основ лабораторного синтеза монои триметиновых красителей — ФЗ типа BOBO и POPO.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие основные задачи:

1. Апробировать традиционные методы синтеза ФЗ типа BOBO и POPO и оценить их возможности и ограничения;

2. Путем ретросинтетического анализа выявить и разработать новый метод синтеза ФЗ указанного типа;

3. Предложить способ интенсификации лабораторных методов синтеза указанных ФЗ;

4. Изучить особенности спектрального поведения указанных ФЗ и полупродуктов их синтеза;

5. Синтезировать новые красители — производные бензоксазола и бензотиазола — и оценить их потенциал в медико-биологических исследованиях.

Методы исследования. Методы синтетической органической химии, ЯМР спектрометрия, ИК спектроскопия, УФ спектроскопия, спектрофлуориметрия, масс-спектрометрия.

Научная новизна работы:

1. Предложен новый способ получения интеркаляторов семейства BOBO и POPO, заключающийся в синтезе промежуточных соединений (полупродуктов) тетракатионного типа путем взаимодействия четвертичных солей пиколина, содержащих бромалкильную группировку, с третичными диаминами (4,4-бипиридин и Ы, Н№,]Ч'-тетраметилэтилендиамин), и последующем взаимодействии этих полупродуктов с четвертичными солями 2-замещенных бензазолов в присутствии основного агента — триэтиламина.

2. Синтезированы новые бензотиазольные монометиновые и бензоксазольные триметиновые красители тетракатионного типа на основе 4,4'-бипиридила и К, К, К',]Ч'-тетраметилэтилендиамина, их тетракатионные предшественники, а также новые четвертичные соли 1,10-фенантролина.

3. Установлено, что при записи спектров ЯМР *Н в ДМСО-<�Зб аналитически кондиционных образцов четвертичных солей бензазолов под действием остаточной влаги растворителя происходит гидролитическое раскрытие азольного цикла либо гидролитическое замещение заместителя во 2-м положении азольного кольца, что затрудняет интерпретацию спектров и приводит к неверным выводам о квалификации образцов. Практическая значимость работы:

1. У вновь синтезированных полиметиновых красителей выявлены флуоресцентные свойства, что открывает принципиальную возможность разработки на их основе флуоресцентных зондов для использования в различных областях биологии и медицины.

2. Освоена лабораторная технология синтеза интеркаляторов семейства BOBO традиционным способом, заключающимся в получении промежуточного несимметричного полиметинового красителя с бромалкильной группировкой и его последующем взаимодействии с 4,4'-бипиридином или N, N, N', N'-тетраметилэтилендиамином. Наряду с разработкой нового способа получения указанных соединений это создает предпосылки для организации укрупненного лабораторного (полупромышленного) производства таких интеркаляторов в России.

3. Предложен способ интенсификации реакций получения интеркаляторов семейств BOBO и POPO путем микроволнового облучения. Показано, что применение метода микроволновой активации позволяет не только ускорить процесс и увеличить выход интеркалятора, но и получить интеркалятор лучшего качества.

4. Выявлены возможности и ограничения ЯМР 'il спектрометрии в качестве метода установления индивидуальности четвертичных солей бензазолов. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Новый метод получения интеркаляторов семейств BOBO и POPO.

2. Способ интенсификации синтеза интеркаляторов семейств BOBO и POPO путем микроволнового облучения.

3. Нестабильность четвертичных солей бензазолов к действию остаточной влаги растворителя в условиях записи ЯМР спектров в ДМСО-с1б.

4. Лабораторная технология получения интеркаляторов семейства BOBO традиционным способом.

5. Возможность использования вновь синтезированных полиметиновых красителей в качестве флуоресцентных зондов ДНК.

Личный вклад автора. Участие в сборе, анализе и систематизации литературных данных, обсуждении целей и задач исследования, интерпретации полученных результатов и их обобщении, формулировке выводов, написании статей и представлении докладов по теме диссертацииподготовка и проведение синтезов, обработка и интерпретация спектральных данных (ЯМР 'Н спектры, ИКС, УФС, MC), структурные отнесения. ЯМР спектры получены к. х. н. Захаровым В. И. (НИИ ГПЭЧ ФМБА России), ИК спектры — Артамоновой Т. В. (СПбГТИ (ТУ)), масс-спектры высокого разрешения — Мишаревым А. Д. (СПбГУ) и Новиковым A.B. (ИАП РАН) — элементный анализ выполнен Артамоновой Т. В. (СПбГТИ (ТУ)). Изучение синтезированных соединений в качестве потенциальных ФЗ проведено в лаборатории клеточной патологии Института цитологии РАН (зав. лаб. д. б. н. Кудрявцев Б.Н.).

Работа выполнена в рамках задания Министерства образования и науки РФ на проведение научных исследований по тематическому плану НИР вуза, темы 1.2.06 «Исследование реакционной способности полифункциональных гетероциклических соединений», № гос. регистрации 1 200 700 666, и 1.4.04 «Разработка научных основ получения новых веществ фармакологического и сельскохозяйственного назначения в рядах элементоорганических соединений методами тонкого органического синтеза и биотехнологии», № гос. регистрации 1 200 412 872.

Апробация работы: Материалы диссертации были представлены на 6-ти международных и российских конференциях. По материалам конференций опубликованы сборники тезисов докладов или выпущены электронные диски.

Публикации: По теме диссертации опубликована одна статья.

Объем и структура работы: Диссертация состоит из введения, литературного обзора (4 раздела), обсуждения результатов (3 раздела), экспериментальной части (7 разделов), выводов и списка литературы (93 ссылок). Материал диссертации изложен на 123 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц и 5 рисунков.

ВЫВОДЫ.

1. Разработан новый способ получения полиметиновых красителейинтеркаляторов семейств BOBO и POPO, заключающийся в синтезе промежуточных соединений тетракатионного типа путем взаимодействия четвертичных солей пиколина, содержащего N-бромалкильную группу, с 4,4'-бипиридином или 1Ч,]Ч, М',>Г-тетраметилэтилендиамином, и последующем взаимодействии этих промежуточных соединений с четвертичными солями бензазолов, содержащих нуклеофугную группу во 2-м положении, в присутствии триэтиламина.

2. Освоена лабораторная технология получения интеркаляторов семейства BOBO традиционным способом, заключающимся в синтезе промежуточного полиметинового красителя с N-бромалкильной группировкой и его последующей реакции с 4,4'-бипиридином или N, N, N', N'-тетраметилэтилен диамином.

3. Установлено, что реакции получения интеркаляторов семейства BOBO как известным, так и вновь предложенным способом могут быть интенсифицированы с помощью микроволнового излучения. Микроволновая активациия не только увеличивает скорость реакций и выход интеркаляторов, но и позволяет получать интеркаляторы большей степени чистоты.

4. Установлено, что в результате алкилирования 4,4'-бипиридина и N, N, N', N'-тетраметилэтилендиамина 1,3-дибромпропаном наряду с линейными всегда образуются циклические продукты.

5. Выявлено, что при записи спектров ЯМР 'Н в ДМСО-с16 кондиционных образцов четвертичных солей 2-замещенных бензазолов происходит раскрытие азольного цикла по связи O (S)! — С2 либо замещение нуклеофугной группы в положении С2 под действием остаточной влаги растворителя, что затрудняет интерпретацию спектров и приводит к неверным выводам о присутствии в образцах примесей.

6. Синтезирован ряд новых полиметиновых красителей, некоторые из которых образуют специфические комплексы с молекулами ДНК, что проявляется в интенсивной флуоресценции окрашенных ими клеточных ядер.