Эффективность и качество использования полимеразной цепной реакции в лабораторной диагностике гриппа

• Введение
• 1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
• 1.1 Суть метода ПЦР. ДНК-полимераза
• 1.2 Проведение ПЦР
• 2. Cтадии постановки ПЦР
• 2.1 Подготовка пробы биологического материала
• 2.2 Амплификация
• 3. Применение ПЦР в диагностике гриппа
• 3.1 Материалы и методы
• 3.2 Результаты
• Заключение
• Литература
• Приложение
• полимеразный реакция амплификация праймер

Человечество вошло в третье тысячелетие с большим запасом знаний в области наук о жизни и колоссальным потенциалом их практического использования. Современный человек может произвольно и направленно изменять наследственность окружающего его живого мира — бактерий, растений, животных и человека. Появились беспрецедентные возможности технологического прогресса (биотехнология и биоинженерия), открывшего также новые пути в медицине (генная терапия) и сельском хозяйстве (трансгенные, или генетически модифицированные, растения и животные). Все это возникло на базе революционных прорывов в фундаментальной науке (молекулярная биология), которые затем и породили биотехнологическую революцию.

Эпохальным открытием молекулярной биологии нашего века стал предложенный в 1983 г. американским исследователем Кэрри Б. Маллисом, удостоенным за это изобретение Нобелевской премии в 1993 г., альтернативный метод анализа геномной ДНК — метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР дает возможность в течение дня из одной молекулы ДНК получить 100 млрд. сходных по структуре молекул и однозначно «увидеть» нужные участки, а затем проверить генетический материал, экстрагированный из исследуемого клинического образца, на наличие в его составе участка чужеродной или измененной генетической информации. «Эта реакция проста в исполнении: нужны лишь пробирка, несколько простых реагентов и источник тепла. Препарат ДНК, который необходимо копировать может быть чистым, а может представлять собой сложную смесь различных биологических веществ. В качестве источника ДНК подходит и человеческий волос, и биоптат ткани, и капля засохшей крови, обнаруженная на месте преступления, и мозг мумии, и даже тело мамонта, пролежавшего 40 000 лет в вечной мерзлоте. За годы, прошедшие со времени открытия полимеразной цепной реакции, она нашла применение во всех отраслях биологии: опубликовано более 1000 работ, в которых была использована эта реакция. Идея ее так проста, что, учитывая значение ПЦР для развития биологических исследований, многим теперь кажется невероятным, что никто не додумался до нее раньше, хотя уже много назад все необходимые для проведения этой реакции компоненты были доступны.»

Актуальность данной работы состоит в том, что полимеразная цепная реакция (ПЦР) является уникальным методом диагностики, и преимущество ее в определении гриппа. Цель исследования: раскрыть понятие и механизм полимеразной цепной реакции. Объектом исследования является данные о ПЦР, предметом являются данные диагностики гриппа методом ПЦР. Задачи исслдеования: систематизировать существующую литературу по полимеразной цепной реакции, дать краткий обзор проблемы лабораторной диагностики гриппа, установить роль метода ПЦР, проанализировать существующие данные по этой проблеме.

1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

1.1 Суть метода ПЦР. ДНК-полимераза

Полимеразная цепная реакция — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты в биологическом материале. Такой процесс увеличения числа копий ДНК называется амплификацией. Копирование ДНК при ПЦР осуществляется специальным ферментом — полимеразой. ДНК-полимераза (Рис. 3) — фермент, участвующий в репликации (амплификации ДНК в живых организмах) ДНК. Ферменты этого класса катализируют полимеризацию дезоксирибонуклеотидов вдоль цепочки нуклеотидов ДНК, которую фермент «читает» и использует в качестве шаблона. Тип нового нуклеотида определяется по принципу комплементарности с шаблоном, с которого ведется считывание.

ДНК-полимераза добавляет свободные нуклеотиды к 3'-концу собираемой цепочки. Это приводит к удлинению цепочки в направлении 5'-3'. Ни одна из известных ДНК-полимераз не способна создать цепочку «с нуля»: они в состоянии лишь добавлять нуклеотиды к уже существующей 3'-гидроксильной группе. По этой причине ДНК-полимераза нуждается в праймере — короткой последовательности нуклеотидов (чаще 20−25), комплементарной концевым участкам изучаемого гена — к которому она могла бы добавить первый нуклеотид. Праймеры состоят всегда из оснований ДНК и РНК, при этом первые два основания всегда РНК-основания. Праймеры синтезируются другим ферментом — праймазой. Еще один фермент — геликаза — необходим для раскручивания двойной спирали ДНК с формированием одноцепочечной структуры, которая обеспечивает репликацию обеих цепочек в соответствии с полуконсервативной моделью репликации ДНК.

Некоторые ДНК-полимеразы обладают также способностью исправлять ошибки во вновь собираемой цепочке ДНК. Если происходит обнаружение неправильной пары нуклеотидов, ДНК-полимераза откатывается на один шаг назад, исключает из неправильный нуклеотид из цепочки, затем вставляет на его место правильный, после чего репликация продолжается в обычном режиме.

1.2 Проведение ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — метод амплификации ДНК, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определённую последовательность ДНК в миллиарды раз. Возможность получения огромного количества копий одного строго определённого участка генома значительно упрощает исследование имеющегося образца ДНК.

Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо соблюдение ряда условий. Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

— ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.

— Два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента. (Пара искусственно синтезированных олигонуклеотидов, имеющих, как правило, размер от 15 до 30 п. н., идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.)

— Термостабильная ДНК-полимераза. Полимераза, используемая в ПЦР, должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза) и другие.

— Дезоксинуклеотидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

— Ионы Mg^2+, необходимые для работы полимеразы.

— Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — pH, ионную силу раствора. Содержит соли, сывороточный альбумин.

Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Если же используется прибор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.

Добавление пирофосфатазы может увеличить выход ПЦР-реакции. Этот фермент катализирует гидролиз пирофосфата, побочного продукта присоединения нуклеотидтрифосфатов к растущей цепи ДНК, до ортофосфата. Пирофосфат может ингибировать ПЦР-реакцию.

Для многократного увеличения количества копий исходной ДНК нужна цикличность реакции. Как правило, каждый из последовательно повторяющихся циклов ПЦР состоит из трех этапов :

1 . Денатурация, или " плавление" ДНК. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94 — 96? С (или до 98? С, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5 — 2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 — 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой прием называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

2. Отжиг — связывание праймеров с матричной ДНК. Когда цепи разошлись, температуру медленно понижают, чтобы парймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается 50−65?С. Время стадии — 20 — 60 секунд. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифичных продуктов (при заниженной температуре).

3. Синтез (элонгация цепи). ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве «затравки». Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей и движется вдоль матрицы. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72? С. Время синтеза зависит от типа ДНК-полимеразы и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7 — 10 минут.

В дальнейшем этапы денатурации, отжига и элонгации многократно повторяются (30 и более раз). На каждом цикле количество синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается.

Все реакции проводят в пробирках, погруженных в термостат. Смена температурного режима и его поддержание осуществляется автоматически.

Чтобы понять, как именно происходит амплификация определенного сегмента ДНК в ходе ПЦР, нужно четко представить положение всех праймеров и комплементарных им последовательностей в амплифицируемых цепях в каждом раунде. В первом раунде каждая из новосинтезированных цепей имеет гораздо большую длину, чем расстояние от 3' -гидроксильной группы ее праймера до концевого нуклеотида последовательности, комплементарной второму праймеру. Такие цепи называют «длинными матрицами», именно на них будет идти дальнейший синтез.

Во втором раунде двухцепочечную ДНК, состоящую из сходной и новосинтезированной (длинная матрица) цепей, опять подвергают денатурации, а затем отжигают с праймерами. Во время синтеза в этом раунде вновь синтезируются «длинные матрицы», а также некоторое количество цепей с праймером на одном конце и с последовательностью, комплементарной второму праймеру, на другом («короткие матрицы»). Во время третьего раунда все гетеродуплексы, образовавшиеся ранее, одновременно подвергаются денатурации и отжигу с праймерами, а затем реплицируются. В последующих раундах «коротких матриц» становится все больше, и к 30-му раунду их число уже в 10⁶ раз превышает число исходных цепей или «длинных матриц» .

Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) теоретически возрастает пропорционально 2ⁿ, где n — число циклов реакции. На самом деле эффективность каждого цикла может быть меньше 100%, поэтому в действительности:

P ~ (1+E)ⁿ ,

где Р — количество продукта, Е — средняя эффективность цикла.

Число «длинных» копий ДНК тоже растет, но линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент. Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством реагентов, присутствием ингибиторов, образованием побочных продуктов.

ПЦР — высокочувствительный метод, поэтому при наличии в исследуемом образце даже ничтожного количества ДНК, случайно попавшей из одной реакционной смеси в другую, могут быть получены ложноположительные результаты. Это заставляет тщательно контролировать все используемые для ПЦР растворы и посуду.

Основные принципы подбора праймеров.

При создании ПЦР-тест-системы одной из основных задач является правильный подбор праймеров, которые должны отвечать ряду критериев:

1. Праймеры должны быть специфичны. Особое внимание уделяют 3'-концам праймеров, т. к именно с них начинает достраивать комплементарную цепь ДНК Taq-полимераза. Если их специфичность недостаточна, то, вероятно, что в пробирке с реакционной смесью будут происходить нежелательные процессы, а именно, синтез неспецифической ДНК (коротких или длинных фрагментов). Она видна на электрофорезе в виде тяжелых или легких дополнительных полос. Это мешает оценке результатов реакции, т. к легко перепутать специфический продукт амплификации с синтезированной посторонней ДНК. Часть праймеров и дНТФ расходуется на синтез неспецифической ДНК, что приводит к значительной потере чувствительности.

2. Праймеры не должны образовывать димеры и петли, т. е. не должно образовываться устойчивых двойных цепей в результате отжига праймеров самих на себя или друг с другом.

2. Cтадии постановки ПЦР

2.1 Подготовка пробы биологического материала

Для выделения ДНК используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Их суть заключается в экстракции (извлечении) ДНК из биопрепарата и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения препарата ДНК с чистотой, пригодной для постановки ПЦР.

Стандартной и ставшей уже классической считается методика получения чистого препарата ДНК, описанная Мармуром. Она включает в себя ферментативный протеолиз с последующей депротеинизацией и переосаждением ДНК спиртом. Этот метод позволяет получить чистый препарат ДНК. Однако он довольно трудоемок и предполагает работу с такими агрессивными и имеющими резкий запах веществами, как фенол и хлороформ.

Одним из популярных в настоящее время является метод выделения ДНК. Этот метод основан на использовании для лизиса клеток сильного хаотропного агента — гуанидина тиоционата (GuSCN), и последующей сорбции ДНК на носителе (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное «молоко» и. т.д.). После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Кроме того, даже следовые количества GuSCN могут ингибировать ПЦР. Поэтому при использовании этого метода очень важен правильный выбор сорбента и тщательное соблюдение технологических нюансов.

Другая группа методов пробоподготовки основана на использовании ионообменников типа Chilex, которые, в отличие от стекла, сорбируют не ДНК, а наоборот, примеси, мешающие реакции. Как правило, эта технология включает две стадии: кипячение образца и сорбция примесей на ионообменнике. Метод чрезвычайно привлекателен простотой исполнения. В большинстве случаев он пригоден для работы с клиническим материалом. К сожалению, иногда встречаются образцы с такими примесями, которые невозможно удалить с помощью ионообменников. Кроме того, некоторые микроорганизмы не поддаются разрушению простым кипячением. В этих случаях необходимо введение дополнительных стадий обработки образца.

Таким образом, к выбору метода пробоподготовки следует относиться с пониманием целей проведения предполагаемых анализов.

2.2 Амплификация

Для проведения реакции амплификации необходимо приготовить реакционную смесь и внести в нее анализируемый образец ДНК. При этом важно учитывать некоторые особенности отжига праймеров. Дело в том, что, как правило, в анализируемом биологическом образце присутствуют разнообразные молекулы ДНК, к которым используемые в реакции праймеры имеют частичную, а в некоторых случаях значительную, гомологию. Кроме того, праймеры могут отжигаться друг с другом, образуя праймер-димеры. И то, и другое приводит к значительному расходу праймеров на синтез побочных (неспецифических) продуктов реакции и, как следствие, значительно уменьшает чувствительность системы. Это затрудняет или делает невозможным чтение результатов реакции при проведении электрофореза.

3. Применение ПЦР в диагностике гриппа

Грипп занимает одно из ведущих мест в структуре инфекционной патологии человека. Во всех странах мира основной экономический ущерб от инфекционных заболеваний наносят именно грипп и острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ). В России на их долю приходится примерно 90% всей регистрируемой инфекционной заболеваемости. По данным официальной статистики в РФ ежегодно регистрируется от 900 тысяч до 3,5 млн случаев гриппа, при этом умирает от 20 до 53 тысяч человек в год .

Заболеваемость гриппом существенно колеблется в разное время года, увеличиваясь, как правило, в осенне-зимнее время. Тем не менее, случаи гриппа могут регистрироваться даже в межэпидемический период. История изучения гриппа уходит своими корнями еще в средние века. Первая эпидемия, о которой мы знаем, имела место в 1889—1890 гг. и была вызвана подтипом вируса гриппа, А (H2N8). Благодаря уникальным свойствам вируса гриппа, А и прежде всего его способности к изменению антигенной структуры, специфический иммунитет, приобретенный после перенесенного заболевания, практически не защищает от инфицирования новым штаммом вируса гриппа. Во время ежегодных вспышек и эпидемий гриппа и других ОРВИ заболевает каждый 10-й взрослый и каждый 3-й ребенок. По данным ВОЗ, во время сезонных эпидемий, вызванных различными вирусами гриппа, в мире ежегодно умирают от 250 до 500 тысяч (большинство из них в возрасте старше 65 лет), причем в некоторые годы число смертей может достигать миллиона. Пандемии гриппа возникают каждые 30−40 лет и характеризуются высокими показателями заболеваемости и смертности .

В настоящее время существуют различные противовирусные препараты для лечения гриппа. Их можно разделить на три группы: этиотропные — ингибиторы нейраминидазы (осельтамивир, занамивир, перамивир), блокатор ионного канала, образованного белком М2 (Ремантадин, Альгирем), ингибиторы NP-белка (Ингавирин), ингибитор гемагглютинина (Арбидол); препараты интерферона (рекомбинантные альфа/гамма-интерфероны); индукторы интерферонов (Кагоцел, Амиксин, Циклоферон). Наиболее эффективна противовирусная терапия, начатая в первые 24−48 часов от начала заболевания, которая позволяет существенно сократить продолжительность лихорадки и других клинических симптомов заболевания.

Именно поэтому необходимость точной и своевременной диагностики гриппа не вызывает сомнений. На сегодняшний день в клинической практике чаще всего используется метод прямой иммунофлуоресценции (ИФ) и, намного реже, метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Как известно, метод ИФ предложил А. Кунс еще в 1941 г. Реакция ИФ основана на связывании антигена с антителом, конъюгированным с флуоресцентной меткой (флуорохромом, например, флюоресцеина изотиоционатом (FITС), тетраметилродамин изотиоционатом (TRITC) и др.). Сегодня для проведения этой реакции используют как поликлональные сыворотки, так и моноклональные антитела. Учет результатов реакции осуществляется с помощью люминесцентного микроскопа, в оптическую систему которого устанавливается набор светофильтров, обеспечивающих освещение препарата ультрафиолетовым или сине-фиолетовым светом с заданной длиной волны .

Метод ПЦР был разработан сотрудником фирмы Cetus K. Mullis в 1983 г. Существуют различные модификации этой реакции. В настоящее время используют ПЦР с обратной транскрипцией в режиме реального времени (ОТ-ПЦР), суть которой заключается в амплификации определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов [8, 9].

Настоящее исследование посвящено сравнительному анализу диагностического значения методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР с целью оптимизации диагностических подходов в тактике ведения больных острыми респираторными заболеваниями и гриппом.

3.1 Материалы и методы

Всего в исследование включен 81 мужчина и 59 женщин (140 пациентов), поступавших в отделения острых респираторных вирусных инфекций ГКУЗ ИКБ № 1 Департамента здравоохранения г. Москвы в состоянии средней тяжести с направительным диагнозом: «ОРВИ» либо «Грипп». Средний возраст больных — 35,5 ± 1,6 года (от 15 до 87 лет). Критериями включения пациентов в исследование были: наличие симптомов гриппа и ОРВИ (повышение температуры тела, симптомы интоксикации и катарального воспаления дыхательных путей); обследование двумя методами для подтверждения гриппа (прямая ИФ и ПЦР) в первые двое суток от момента поступления больного в стационар. При этом материал, взятый от больного для проведения этих исследований, должен был содержать достаточное количество клеток эпителия носоглотки для анализа. Критериями исключения из исследования были: наличие хронической обструктивной болезни легких, беременность.

Всем пациентам, включенным в исследование, проводилось стандартное общеклиническое обследование: сбор анамнеза заболевания, объективный осмотр, анализ клинической картины в сопоставлении с данными лабораторно-инструментальных методов исследования (общие анализы крови и мочи, рентгенологическое исследование органов грудной клетки). Для оценки степени дыхательной недостаточности больным проводилась пульсоксиметрия. При наличии у пациента пневмонии по данным рентгенологического исследования органов грудной клетки дополнительно назначался биохимический анализ крови (определение уровней аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ), мочевины, креатинина, креатининфосфокиназы), а также анализ крови для оценки кислотно-основного состояния и электролитов.

Молекулярно-генетическое исследование осуществлялось при помощи ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации для выявления генетического материала вирусов гриппа, А (сезонного), гриппа, А (H1N1) pdm09, гриппа В в эпителии носоглотки/ротоглотки при помощи тест-систем «АмплиСенс®» с аналитической чувствительностью — 1000 микроорганизмов в 1 мл биологического материала.

Иммунологическое исследование выполнялось при помощи метода прямой ИФ. Диагностикум представляет собой специфические моноклональные антитела (иммуноглобулины), меченые флуоресцеинизотиоцианатом. В работе использовались серии диагностикумов производства ФГБУ НИИ гриппа (г. Санкт-Петербург), рабочее разведение диагностикумов было не ниже 1:16. Анализ мазков-отпечатков из носоглотки проводился с помощью люминесцентного микроскопа «Биомед-6» (Россия).

3.2 Результаты

Для проведения сравнительного анализа методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР группа больных (n = 140), в которой были применены одновременно эти две методики с целью уточнения этиологии основного заболевания, была разделена на три подгруппы: 1-я подгруппа — пациенты, у которых диагностика гриппа двумя методиками проводились в один день; 2-я подгруппа — пациенты, которым ПЦР было выполнено раньше метода ИФ на 1−2 суток; 3-я подгруппа — пациенты, которым метод прямой ИФ был проведен раньше ПЦР на 1−2 суток. Результаты исследования эпителия носоглотки методами прямой ИФ и ОТ-ПЦР у 140 больных, включенных в исследование, представлены в табл. 1−3.

Выполнено сравнение частоты регистрации четырех комбинаций (профилей) результатов тестов прямой ИФ и ОТ-ПЦР: ИФ" +" /ПЦР" +", ИФ" -" /ПЦР" +", ИФ" +" /ПЦР" -", ИФ" -" /ПЦР" -" .

При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе пациентов (n = 20), которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в один день и в первые 3 дня от начала заболевания, частота выявления профиля ИФ" -" /ПЦР" +" была самой высокой и достоверно отличалась от частоты выявления профилей ИФ" +" /ПЦР" +" и ИФ" +" /ПЦР" -" (p = 0,0005 и p = 0,0019 соответственно).

При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе пациентов (n = 37), которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в один день и на 4−5 сутки от начала заболевания, частота выявления профиля ИФ" -" /ПЦР" +" была также самой высокой и достоверно отличалась от частоты выявления профилей ИФ" +" /ПЦР" +" и ИФ" +" /ПЦР" -" (p = 0,0001 и p = 0,0001 соответственно).

При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе пациентов (n = 11), которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в один день и позже 5 суток от начала заболевания, частота выявления профиля ИФ" -" /ПЦР" +" была также самой высокой, но достоверно отличалась только от частоты выявления профиля ИФ" +" /ПЦР" -" (p = 0,0078), в то время как достоверной разницы с частотой выявления профиля ИФ" +" /ПЦР" +" не выявлено (p = 0,0868).

Как видно из табл. 1, в группе больных (n = 20), которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в один день и в первые 3 дня от начала заболевания, грипп был лабораторно подтвержден тем или иным методом у 17 (85%) пациентов, при этом большая часть (82%, 14/17) положительных результатов получена при использовании метода ОТ-ПЦР. Совпадение результатов исследований методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР регистрировалось только в 11,8% (2/17) случаев, в то время как в 70,6% (12/17) случаев методом прямой ИФ антигены вируса гриппа выявить не удалось.

В группе больных, которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в один день и на 4−5 сутки от начала заболевания, грипп был лабораторно подтвержден тем или иным методом у 28 (75,7%) пациентов, при этом большая часть положительных результатов (92,9%, 26/28) также была получена при использовании метода ОТ-ПЦР. Совпадение результатов исследований методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР регистрировалось в 10,7% (3/28) случаев, а в 82,1% (23/28) выявить антигены вируса гриппа методом прямой ИФ не удалось.

В группе больных (n = 11), которым ОТ-ПЦР и исследование методом прямой ИФ проводили в один день и позже 5 суток от начала заболевания, грипп был лабораторно подтвержден тем или иным методом у всех пациентов. При использовании метода ОТ-ПЦР этиология была установлена у 90,9% (10/11) больных, совпадение результатов двух методик регистрировалось в 3 (27,3%) случаях.

При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе пациентов (n = 11), которым исследование ОТ-ПЦР было выполнено на 1−2 дня раньше прямой ИФ и в 1−3 дня от начала болезни, грипп был подтвержден у 9 пациентов, и только методом ОТ-ПЦР в 100% случаев (профиль ИФ" -" /ПЦР" +").

При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе пациентов (n = 40), которым ОТ-ПЦР было проведено раньше исследования методом прямой ИФ на 1−2 дня и на 4−5 сутки от начала заболевания, частота выявления профиля ИФ" -" /ПЦР" +" была самой высокой и достоверно отличалась от частоты выявления профилей ИФ" +" /ПЦР" +" и ИФ" +" /ПЦР" -" (p = 0,0001 и p = 0,0001 соответственно).

При сравнительном анализе результатов лабораторного исследования в группе пациентов (n = 18), которым ОТ-ПЦР было проведено раньше исследования методом прямой ИФ на 1−2 дня и позже 5 суток от начала заболевания, частота выявления профиля ИФ" -" /ПЦР" +" была также самой высокой и достоверно отличалась от частоты выявления профилей ИФ" +" /ПЦР" +" и ИФ" +" /ПЦР" -" (p = 0,0006 и p = 0,0002 соответственно).

Как видно из табл. 2, в группе пациентов (n = 11), которым ОТ-ПЦР было проведено раньше исследования методом прямой ИФ на 1−2 дня и на 1−3 сутки от начала заболевания, при помощи последнего выявить антигены вируса гриппа не удалось ни у одного пациента, в то время как при использовании метода ОТ-ПЦР генетический материал вируса гриппа был выявлен у 9 (81,8%) больных.

В группе больных (n = 39), которым ОТ-ПЦР было проведено раньше исследования методом прямой ИФ на 1−2 дня и на 4−5 сутки от момента заболевания, грипп был лабораторно подтвержден тем или иным методом в 76,9% случаев, при этом большинство положительных результатов (90%, 27/30) получено при использовании метода ОТ-ПЦР. Совпадение результатов исследований методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР регистрировалось лишь в 4 (13,3%) случаях.

В группе пациентов (n = 18), которым ОТ-ПЦР было проведено раньше исследования методом прямой ИФ на 1−2 дня и позже 5 суток от начала заболевания, грипп лабораторно подтвержден тем или иным методом у 77,8% (14/17) больных, при этом большинство положительных результатов также было получено при использовании метода ОТ-ПЦР. Совпадение результатов исследований методов прямой ИФ и ОТ-ПЦР регистрировалось в 14,3% (2/14) случаев.

В табл. 3 представлены результаты пациентов, у которых исследование методом прямой ИФ было сделано раньше ОТ-ПЦР и обследованных позже 3-го дня болезни. Из трех пациентов, обследованных на 4-й день и позже, грипп был подтвержден в 100% случаев только методом ОТ-ПЦР (профиль ИФ" -" /ПЦР" +").

В целом, среди всех обследованных, независимо от дня болезни, на который выполнялось исследование, были пациенты (n = 10), у которых при помощи метода прямой ИФ выявлялись антигены вируса гриппа, в то время как методом ОТ-ПЦР выделить генетический материал вируса не удавалось (профиль ИФ" +" /ПЦР" -"). Такое расхождение результатов обследования наблюдалось в 7,1−17,6% случаев, не прослеживалось связи указанного профиля с днем болезни, на который проводилось обследование, однако в группе больных, у которых обследование методом прямой ИФ применялось раньше ОТ-ПЦР, таких пациентов не было.

Заключение

Среди всех больных с диагностированным гриппом доля положительных результатов ОТ-ПЦР-исследования составляет от 77,8% до 100%. При этом основную группу (78,9%, 90/114) составили пациенты, у которых методом ОТ-ПЦР был выявлен генетический материал вируса гриппа, в то время как антигены вируса гриппа при проведении прямой ИФ идентифицировать не удавалось. Доля лабораторно-подтвержденных случаев гриппа методом прямой ИФ (среди всех подтвержденных случаев как методом прямой ИФ, так и ОТ-ПЦР) составила 21,1%. Полученные результаты свидетельствуют о больших диагностических возможностях метода ОТ-ПЦР у больных гриппом, и что немаловажно, независимо от дня болезни при наличии клинической картины острого заболевания.

Меньшие диагностические возможности метода прямой ИФ объясняются самим механизмом реакции. Антитела взаимодействуют с антигеном в местах их локализации. Эти места выявляют при помощи метки, связанной с антителами. Это наиболее простой метод визуализации, однако чувствительность его крайне низкая, так как на одну молекулу искомого антигена будет приходиться одно меченое антитело. Достоинством метода ОТ-ПЦР является необязательность условия наличия большого количества возбудителя в клетках эпителия, так как сам метод предусматривает увеличение количества копий ДНК/РНК возбудителя (амплификация) с последующей его детекцией. Так как оба метода используются преимущественно для ранней диагностики гриппа, что принципиально для своевременного назначения противовирусной терапии, то, безусловно, клиницист отдаст свое предпочтение тому методу, который позволяет это сделать с наибольшей вероятностью.

Также необходимо учитывать, что большая разница в частоте лабораторного подтверждения гриппа, свидетельствующая о низкой диагностической возможности метода прямой ИФ, может быть объяснена вероятностью перекрестных реакций, быстрым разрушением флуоресцентной метки, субъективностью оценки результатов реакции. Последний фактор зависит непосредственно от квалификации врача-лаборанта, проводящего исследование. Помимо этого проведение прямой ИФ — весьма трудоемкий неавтоматизированный процесс, требующий больших временных затрат от специалиста. По сравнению с методом прямой ИФ ОТ-ПЦР является автоматизированным высокочувствительным методом, дающим возможность выявлять даже единичные копии ДНК/РНК возбудителя на поздних сроках от начала заболевания. ОТ-ПЦР обладает высокой специфичностью, что обусловлено определением участка гена, характерного только для данного возбудителя.

Оптимальные сроки обследования — первые 5 дней болезни, однако при наличии клинической симптоматики гриппа метод ОТ-ПЦР информативен и на более поздних сроках заболевания. Работа выполнена в рамках гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ Российской Федерации (протокол № 1 от 19 марта 2010 г.) по соглашению № 16.120.11.5354-НШ от 01.02.2012 г.

1. Салтыкова Т. С. Заболеваемость гриппом и отсроченная смертность у лиц старше 60 лет. Автореф. дис. … канд. мед. наук. М., 2010.

2. Климова Е. А., Ющук Н. Д., Кареткина Г. Н. и др. Исходы тяжелого течения пандемического гриппа А/H1N1/2009 // Терапевтический архив. 2010. № 11, с. 15−18.

3. Петров В. И., Ленева И. А., Недогода С. В. Применение отечественного противовирусного препарата с позиций доказательной медицины // Лечащий Врач. 2011. № 1, с. 71−79.

4. Теоретические основы полимеразной цепной реакции. Методическое пособие. «НПФ ДНК-технология». М., 2010. Режим доступа: http://www.twirpx.com/file/454 057/. Дата обращения: 01.11.14г

5. Heid C. A. Real-time quantitative PCR // Genome Res. 2012. № 6, p. 986−994.

6. Екимов А. Н., Шипулин Г. А., Бочкарев Е. Г., Рюмин Д. В. Новейшие технологии в генодиагностике: полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR) Режим доступа: http://www.pcr.ru/bibliogr/articles/article₁₈.htm. Дата обращения: 21.10.14г

7. Статьи. ПЦР-анализ. Режим доступа: http://mirzdorovja.by/articles/77-prc-analis. Дата обращения: 04.11.14г

8. Глик Б., Пастренак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение — Москва: Мир, 2009.

9. Анализ ПЦР. Полимеразно-цепная реакция. Метод ДНК-Диагностики. Режим доступа: http://www.pcr.su. Дата обращения: 21.10.14г

10. Щербо С. Н., Макаров В. Б. Клиническая лабораторная диагностика. — 2010.

11. Гинцбург А. Л. Микробиология, иммунология и вирусология. — 2009.

12. Падутов В. Е., Баранов О. Ю., Воропаев Е. В. Методы молекулярно — генетического анализа. — Мн.: Юнипол, 2010. — 176 с.

13. ПЦР «в реальном времени» / Ребриков Д. В., Саматов Г. А., Трофимов Д. Ю. и др.; под ред. д. б. н. Д. В. Ребрикова; предисл. Л. А. Остермана и акад. РАН и РАСХН Е. Д. Свердлова; 2-е изд., испр. и доп. — М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. — 223 с.

14. .Патрушев Л. И. Искусственные генетические системы. — М.: Наука, 2009. — В 2 т

15. Б. Глик, Дж. Пастернак Молекулярная биотехнология. Принципы и применение 589 стр., 2009 г.

16. Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции от 22.06 2011г.

17. Щербо С. Н. ПЦР в клинической лабораторной диагностике: реальности и перспективы //Справочник заведующего КДЛ 2010. № 10 с. 45−48

18. Тарасенко И. М. Правила организации работы КДЛ с патогенными биологическими агентами // Справочник заведующего КДЛ 2010. № 6 с.37−40.

19. Херсонская А. М. Современные методы клинической диагностики: ПЦР в режиме реального времени // Справочник заведующего КДЛ 2010. № 11 с.31−36

20. 5. Чухловин.А. Б. Метод ПЦР в клинической лабораторной диагностике // Справочник заведующего КДЛ. 2011. № 4 с.46−50

21. 6. Херсонская А. М., Амон Е. П. Типовые ошибки при диагностике методом ПЦР // Справочник заведующего КДЛ 2010. № 5 с.30−36

Приложение

Рисунок 3. ДНК-полимераза.

Рисунок 4. Схематическое изображение первого цикла ПЦР. (1) Денатурация при 94—96 °C. (2) Отжиг при 68 °C (например). (3) Элонгация при 72 °C (P=полимераза). (4) Закончен первый цикл. Две получившиеся ДНК-цепи служат матрицей для следующего цикла, поэтому количество матричной ДНК в ходе каждого цикла удваивается.