Метод определения хемилюминесценции

Лейкоцитарный супернатант дважды отмывают в растворе Хенкса без фенолового красного по 10 мин при 500g. Супернатан сливают, оставшиеся нейтрофильные гранулоциты разводят в 1 мл Хенкса и получают взвесь. Для подсчета клеток в планшет добавляют 40 мкл уксусной кислоты и 10 мкл лейковзвеси и подсчитывают количество нейтрофильных гранулоцитов в камер Горяева в 5 больших квадратах по диагонали. Количество клеток определяют по формуле (Х1*11*1000)/0,02=(Х2/2 000 000)-1 количство Хенкса необходимое добавить к 1 мл лейкоцитарной суспензии, где Х1 — суммарное количество клеток в 5 квадратах, Х2- количество нейтрофилов в1 мл суспензии (необходимое количество клеток 2*10 в 6 степени). Для проведения хемилюминесцентного анализа используют следующие реактивы: донорскую сыворотку (группа крови АВ резус-фактор отрицательный), раствор Хенкса (без фенолового красного), люминол или люцигенин в концентрации 100 мкг/мл. Готовят пробу: 200 мкл взвеси нейтрофильных гранулоцитов, 20 мкл донорской сыворотки, 240 мкл раствора Хенкса, 50 мкл люминола или люцигенина и 40 мкл зимозана или бактериальной суспензии Staphylococcus epidermidis или Staphylococcus aureus в концентрации (0,4 ОП). Бактериальную взвесь делают из суточной бактериальной культуры, которую разводят в 3 мл физиологического раствора. Концентрацию клеток измеряют на приборе КФК-2 при л=590 им относительно физ. раствора, затем доводят физиологическим раствором концентрацию бактериальной суспензии до 0,4 ОП. Хемилюминесцентный анализ проводят в 8 кюветах (в первых 4 используем любинол; во вторые 4 добавляем лоцигенин). Спонтанная хемилюминесценция осуществляется без добавления индуктора, во вторую кювету добавляют зимозан, в третью бактериальную суспензию Staphylococcus epidermidis, в четвертую Staphylococcus aureus при помощи хемилюминесцентного анализатора, например «CL.3604» в течение 90 мин. Генистрация результатов и управление хемилюминесцентным анализатором осуществляется через компьютер. Получают кривую хемилюминесценция. Определяют величину Tmax Imax Smax для каждого показателя (спонтанная хемилюминесценция, зимозан-зависимая хемилюминесценция и стафилококк-зависимая хемилюминесценция).