Прогностическое значение лимфоцитарной инфильтрации у больных раком вульвы

Рак вульвы выявляется в основном у пожилых женщин, у женщин менопаузального возраста, чаще всего в интервале 60−80 лет. Эта локализация доступна для визуального осмотра, и несмотря на это, малосимптомное течение заболевания в ранних стадиях, отсутствие профилактических осмотров и онконастороженности приводит к поздней обращаемости к специалисту. И как следствие этого, более 50% больных поступают с III-IV стадиями злокачественного процесса. Эффективность лечения на этих стадиях снижена [6, 9] в силу особенностей анатомо-топографического строения наружных половых органов с чрезвычайно богатой сетью лимфатических сосудов, рак данной локализации является агрессивным, так как обладает склонностью к быстрому росту, метастазированию и рецидивированию. По данным литературы, общая 5-летняя выживаемость у больных раком вульвы не превышает 50%. Сложность представляет и лечение рецидивов рака вульвы, которые возникают у больных от 30 до 60% в течение первых 5 лет после окончания лечения [11]. Основными причинами летальных исходов являются несвоевременная диагностика и нерадикальность проведенного лечения и больные, как правило, погибают от рецидивов и метастазов [7, 8]. Таким образом, поиск любых прогностических факторов эффективности лечения рака вульвы является актуальным на сегодняшний день.

Опухолевое микроокружение является одним из факторов, определяющих прогноз заболевания. Роль инфильтрации опухоли иммунокомпетентными клетками неоднозначна, в литературе есть данные о том, что они могут способствовать не только ее регрессии, но и росту [1]. Гетерогенность состава лимфоцитарно-макрофагального инфильтрата, находящегося вблизи опухоли, можно рассматривать как отражение различия биологических свойств опухолевых клеток, способствующих его формированию [10]. Как указано в литературе, состав лимфоидного инфильтрата и его функциональная активность являются факторами независимого прогноза: при наличии высокого содержания в ткани опухоли и перифокальной зоне колоректального рака CD8+ лимфоцитов 5-ти летняя выживаемость больных составила 86,2%, а рецидивы возникали у 4,8% больных, тогда как на фоне низкого содержания этих клеток данные показатели составили 27,5% и 75% сооответственно [3]. Большое число CD8+ цитотоксических лимфоцитов, коррелирует с ухудшением показателей выживаемости при лимфоме Ходжкина [13], плоскоклеточном раке анального канала [18], но являются фактором благоприятного прогноза при раке эндометрия [16], яичников [20]. Установлено, что снижение уровня Т-клеточной инфильтрации опухоли имеет определенную связь с регионарным метастазированием или наличием микрометастазов [4]. В некоторых работах прослеживается положительная корреляция между Т-клеточной инфильтрацией опухоли (включая СD4+ и СD8+ Т-лимфоциты) и положительным клиническим прогнозом, однако, судя по данным авторов, это относится к HLA-DR II позитивным опухолям [5]. В других исследованиях подчеркивается однозначно позитивная прогностическая роль инфильтрации СD8+ Т-клетками как предшественниками цитотоксических Т-лимфоцитов — эффекторов адаптивного иммунитета [12].

Макрофаги являются важным компонентом хронического воспаления. М1 макрофаги участвуют в формировании противоопухолевого ответа, активируются бактериальными продуктами и ИФН-гамма и подавляют микроорганизмы и рост опухолевых клеток. Макрофаги М2 участвуют в регуляции воспаления, стимулируют пролиферацию, ангиогенез, процесс заживления и поглощают обломки погибших клеток. По существующим данным макрофаги, инфильтрирующие опухоль являются предшественниками М2 типа, которые способствуют развитию опухоли [22].

Целью настоящего исследования явилась оценка экспрессии и прогностической значимости лимфоцитарно-макрофагальных маркеров в ткани плоскоклеточной карциномы вульвы.

Материал и методы исследования

Материалом для исследования послужили парафиновые блоки тканей опухолей вульвы 84 больных раком вульвы, в которых проводилось изучение лимфоцитарно-макрофагальной инфильтрации иммуногистохимическим методом. С парафиновых блоков готовили срезы толщиной 3−4 мкм на ротационном микротоме Accu-Cut SRM 200 фирмы Sakura (Япония). Срезы наносили на высокоадгезивные стекла и высушивали вертикально в термостате при температуре 37 °C в течение ночи. Использованные в работе первичные антитела и их разведения представлены в таблице 1.

Таблица 1. Панель использованных в исследовании антител.

Парафиновые срезы депарафинировали и регидратировали по стандартной методике. «Демаскировку» антигенов проводили в PT-Link Thermo. Протокол включал в себя предварительный нагрев до 650С, восстановление антигена в течение 20 минут при температуре 970С и дальнейшее охлаждение до 650С. Затем стекла промывались в течение 1−3 минут TBS-буфером (Dako) и помещались в автостейнер Thermo Scientific для окрашивания в автоматическом режиме. Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали систему детекции Reveal Polyvalent HRP-DAB Detection System. Срезы докрашивали гематоксилином Майера, для заключения использовали бальзам Bio-Mount. Полуколичественно оценивали экспрессию Т-клеточных лимфоцитарных маркеров CD3, CD4 и CD8, В-клеточного лимфоцитарного маркера CD20 и макрофагального маркера CD68 на 10 случайно выбранных полях зрения с применением светового микроскопа Zeiss Axio Imager M2 под увеличением х10, х20, х40.

Результаты исследования

Под наблюдением находилось 84 больных раком вульвы в возрасте от 57 до 84 лет, 38 из которых после лечения были с кратковременной ремиссией, а 46 — с длительной. Больные раком вульвы с кратковременной ремиссией находились в возрасте от 46 до 85 лет, средний возраст 67 лет. Среди них в I стадии было 15,8% больных, во II — 21%, в III — 47,4% и в IV — 15,8%, т. е., в ранних стадиях было 36,8% - менее половины больных, а в поздних стадиях 63,2%, т. е. с распространённым злокачественным процессом было почти 2/3 больных. По гистологической структуре у всех больных был выявлен плоскоклеточный рак: у 30% имел место высокодифференцированный, у 70% умереннои низкодифференцированный (40 и 30%). Длительность ремиссии у больных этой группы была от 5 до 20 мес., в среднем 11 мес. Ни у одной из пациенток этой группы ДНК ВПЧ обнаружен не был.

Возраст больных в группе с длительной ремиссией колебался от 27 до 71 года, средний возраст был 48 лет. В I стадии было 38,5% больных, во II — 53,8%, в III — 7,7%, т. е. в ранних стадиях было 92,3% больных, а среди больных с короткой ремиссией было всего 36,8% (более чем в 2 раза меньше); больных с запущенными формами заболевания с длительной ремиссией было лишь 7,7%, по сравнению с 63,2% больных в группе с короткой ремиссией. По гистологической структуре у всех пациенток данной группы был выявлен плоскоклеточный рак, преимущественно высокои умеренно-дифференцированный с преобладанием первого (60%). Низкая степень дифференцировки опухоли у больных данной группы отсутствовала. Длительность ремиссии составила от 3-х до 18 лет, в среднем 8 лет. Среди больных в группе с длительной ремиссией у 54% отмечено наличие ДНК ВПЧ (в основном 16 и 18 типа). Все больные подверглись комплексному лечению в соответствии со стадией заболевания.

Для определения возможной роли иммунологического микроокружения опухоли в эффективности лечения и поддержании длительной ремиссии проведено ретроспективное морфологическое исследование лимфоцитарной инфильтрации и иммуногистохимическое исследование субпопуляций лимфоцитов и макрофагов, инфильтрирующих опухоль, у больных обеих подгрупп.

При морфологическом исследовании в строме и паренхиме опухолевой ткани выявлено наличие лимфоцитарно-макрофагальной инфильтрации различной степени выраженности, от незначительной, где отмечаются одиночно рассеянные лимфоциты и мелкие лимфоцитарные инфильтраты, до более выраженной, в виде очаговых скоплений по типу формирования лимфоидных фолликулов, преимущественно расположенных на границе опухоль — перифокальная зона.

С помощью иммуногистохимического исследования установлено, что в лимфоцитарных инфильтратах присутствуют как В-, так и Тлимфоциты, причем последних большинство. Сравнительная характеристика факторов локального клеточного иммунитета при раке вульвы у больных, у которых впоследствии развилась ремиссия различной длительности, представлена в таблице 2.

Таблица 2. Состав иммунокомпетентных клеток, инфильтрирующих опухоль вульвы, у больных с различной длительностью ремиссии.

Примечание. * - статистически достоверные различия между группами (р<0,05)

Как видно из таблицы 2, у больных с длительной ремиссией уровень зрелых (CD3+) Т-лимфоцитов в опухоли был выше, хотя разница значений и не имела достоверных различий, а содержание CD20+В-лимфоцитов достоверно ниже, чем у больных с кратковременной ремиссией. CD20+лимфоциты в обоих случаях встречались в виде единичных клеток, разрозненно расположенных среди паренхимы опухоли.

Обращает на себя внимание разнонаправленность содержания основных субпопуляций Т-клеток, инфильтрирующих опухоль: так, количество CD8+ лимфоцитов было статистически значимо выше, а уровень CD4+ клеток — ниже в опухолях больных, впоследствии продемонстрировавших длительную ремиссию (рис.1). Показатели этой подгруппы составляли для CD4+ 41,9±4,9%, для CD8+ 52,4±6,1%, тогда как в подгруппе больных с кратковременной ремиссией — 67,5±9,7% и 17,3±3,2% соответственно (в обоих случаях р<0,05).

Рис. 1. Уровни основных субпопуляций Т-лимфоцитов в опухолях больных раком вульвы при различной продолжительности ремиссии (%).

В ткани первичной опухоли с коротким периодом ремиссии соотношение CD4/CD8 лимфоцитов составило 3,9, тогда как в опухоли с длительным периодом ремиссии 0,8.

Преобладание в опухоли CD8+ клеток, являющихся предшественниками цитотоксических Т-лимфоцитов, по-видимому, более благоприятным образом отражается на эффекте лечения и длительности ремиссии (рис.2).

Рис. 2. Экспрессия CD8 в опухолевой ткани карциномы вульвы с различным безрецидивным периодом. Ув. х200.

Присутствие в опухолях больных, вышедших после проведенного лечения в непродолжительную ремиссию, высокого количества CD4+ Т-клеток, можно объяснить возможным превалированием среди них Tregs-клеток (CD4+CD25+FoxP3+), являющихся иммуносупрессивными и проонкогенными. Полученные результаты, касающиеся накопления в опухолевом микроокружении Tregs, нашли подтверждение при исследовании других опухолей. Так, сопоставление лимфоцитарного состава образцов ткани первичных и рецидивных СМТ установило, что процентное содержание CD3+CD8+ лимфоцитов в ткани первичных опухолей статистически достоверно выше, чем в ткани рецидивных, а количество Тregs, напротив, в них ниже [2]. По данным литературы рак пищевода характеризуется усилением инфильтрации опухоли Т-регуляторными лимфоцитами (T regs) при более распространенных стадиях заболевания [19] в частности при раке поджелудочной и молочной желез [21, 14, 17] раке яичников [15, 23]. Для опухолей исследуемых нами групп выявлены общие черты, в виде выраженной инфильтрации CD68+макрофагами, в незначительно большем количестве в ткани больных с коротким периодом ремиссии, составившим 80,4±12,1 и 76±5,1 для больных с длительным периодом ремиссии. Инфильтрация CD68+ макрофагами в исследуемых группах представлена как в строме, так и в зонах сплошного опухолевого роста. Так, в строме и паренхиме опухоли определяется выраженная диффузная инфильтрация макрофагами в виде густого очагового скопления и диффузно-рассеянного при различной длительности безрецидивного периода (рис.3). иммуногистохимический лимфоцитарный инфильтрация опухоль.

Рис. 3. Экспрессия CD68 в опухолевой ткани карциномы вульвы с различным безрецидивным периодом. Ув. х 200.

Выводы

Результаты ретроспективного иммуногистохимического исследования рака вульвы показали, что иммунологическое микроокружение опухоли прооперированных больных оказалось различным у больных с развившейся впоследствии длительной и кратковременной ремиссией. Преобладание CD8+ Т-клеток в ткани злокачественной опухоли наблюдалось у больных, с длительной ремиссией (свыше 2-х лет), а более высокий уровень внутриопухолевых CD4+ Тклеток ассоциировался с короткой ремиссией (менее 2-х лет) и, следовательно, неблагоприятным прогнозом. Мы связываем такие различия с возможным присутствием среди популяции CD4+ клеток Tregs лимфоцитов, что и было подтверждено при изучении других видов опухолей. Таким образом, выявленные различия в лимфоцитарно-макрофагальной инфильтрации первичной плоскоклеточной карциномы вульвы с использованием иммуногистохимического исследования позволяют прогнозировать течение опухолевого процесса и развитие рецидива в ранние или отдаленные сроки.

• 1. Бережная Н. М. Иммунология злокачественного роста / Н. М. Бережная, В. Ф. Чехун // Киев: Наукова Думка, 2005. — 790 с.
• 2. Кит О. И. Местный клеточный иммунитет при аденокарциноме и полипах толстой кишки / О. И. Кит, А. В. Шапошников, Е. Ю. Златник и др. // Сибирское медицинское обозрение. — 2012. — № 4 (76). — С. 11−16.
• 3. Крохина О. В. Иммуноморфологическая диагностика микрометастазов рака молочной железы в костный мозг / О. В. Крохина, В. П. Летягин, Н. Н. Тупицын и др. // Опухоли женской репродуктивной системы. — 2005. — № 1. — С.70−73.
• 4. Летягин В. П. Варианты иммунофенотипа рака молочной железы и их клиническое значение для прогноза / В. П. Летягин, Н. Н. Тупицын, Е. В. Артамонова // Материалы VII Российского онкологического конгресса. 25−27 ноября 2003 г. Москва. С. 50−53.
• 5. Неродо Г. А. Клиническое течение рака вульвы у больных репродуктивного возраста / Г. А. Неродо, Е. М. Непомнящая, Е. А. Неродо // Креативная хирургия и онкология. — 2012. — № 3. — С. 61−66.
• 6. Неродо Г. А. Сроки возникновения рецидивов рака вульвы и их прогностические факторы / Г. А. Неродо, В. А. Иванова, Е. А. Неродо // Современные проблемы науки и образования. — 2013. — № 1. http://www.science-education.ru/107−8442.
• 7. Неродо Е. А. Анализ сроков появления рецидивов и безрецидивной выживаемости у больных раком вульвы / Е. А. Неродо, Г. А. Неродо, В. А. Иванова // Российский медицинский журнал. — 2014. — № 2. — С. 18−21.
• 8. Неродо Е. А. Клиническая характеристика больных с рецидивами рака вульвы / Е. А. Неродо, В. А. Иванова, Г. А. Неродо, Т. В. Мироненко // Сибирский онкологический журнал. — 2011. — Приложение № 1. — С. 85.
• 9. Перельмутер В. М. Особенности воспалительной инфильтрации в строме инвазивного протокового рака молочной железы при развитии рецидивов / В. М. Перельмутер, С. В. Вторушин, Ю. Н. Одинцов и др. // Сибирский онкологический журнал. — 2010. — № 5 (41) — С.11−16.
• 10. Турчак А. В. Рецидивы рака вульвы и результаты их терапии (20-летний опыт) / А. В. Турчак // Онкология. — 2009. — Т.11, № 4. — С. 312−313.
• 11. Шамилов Ф. А. Субпопуляции интратуморальных лимфоцитов при раке молочной железы / Ф. А. Шамилов // Онкология. — № 2. — С.50−53.
• 12. Asano N. Prognostic significance of T-cell or cytotoxic molecules phenotype in classical Hodgkin’s lymphoma: a clinicopathologic study / N. Asano, A. Oshiro, K. Matsuo et al. // J. Clin. Oncol. — 2006. — Vol. 24. — P. 4626−4633.
• 13. Bates G.J. Quantification of regulatory T cells enables the identification of high-risk breast cancer patients and those at risk of late relapse / G.J. Bates, S.B. Fox, C. Han et al. // J Clin Oncol. — 2006. — Vol. 24. — P. 5373−5380.
• 14. Curiel T.J. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival / T.J. Curiel, G. Coukos, L. Zou et al. // Nat Med. — 2004. — Vol. 10. — P. 942−949.
• 15. De Jong R.A. Presence of tumor-infiltrating lymphocytes is an independent prognostic factor in type I and II endometrial cancer / R.A. de Jong, N. Leffers, H.M. Boezen et al. // Gynecol Oncol. — 2009. — Vol. 114. — P. 105−110.
• 16. De Kruijf E.M. The predictive value of HLA class I tumor cell expression and presence of intratumoral Tregs for chemotherapy in patients with early breast cancer / E.M. de Kruijf, J.G. Van Nes, A. Sajet et al. // Clin Cancer Res. — 2010. — Vol. 16 (4). — P. 1272−1280.
• 17. Grabenbauer G.G. Tumor-infiltrating cytotoxic T cells but not regulatory T cells predict outcome in anal squamous cell carcinoma / G.G. Grabenbauer, G. Lahmer, L. Distel et al. // Clin Cancer Res. — 2006. — Vol. 12. — P. 3355−3560.
• 18. Kono K. CD4+CD25 high regulatory T cells increase with tumour stage in patients with gastric and oesophageal cancers / K. Kono, H. Kawaida, A. Takahashi et al. // Cancer Immunol Immunother. — 2006 — Vol. 5. — P. 1064−1071.
• 19. Lefferrs N. Prognostic significance of tumor-infiltrating T-lymphocytes in primary and metastatic lesions of advanced stage ovarian cancer / N. Lefferrs, M.J. Gooden, R.A. de Jong et al. // Cancer Immunol Immunother. — 2009. — Vol. 58. — P. 449−459.
• 20. Liyanage U.K. Prevalence of regulatory T cells is increased in peripheral blood and tumor microenvironment of patients with pancreas or breast adenocarcinoma / U.K. Liyanage, T.T. Moore, H.G. Joo et al. // J Immunol — 2002. — Vol.169. — P. 2756−2761.
• 21. Mantovani A. Tumor-associated macrophages in cancer-related inflammation / A. Mantovani // Immunotherapy. — 2011. — Vol. 3(4), Suppl. 1. — P. 21−22.
• 22. Zhang L. Intratumoral T cells, recurrence, and survival in epithelial ovarian cancer / Zhang L., Conejo-Gracia J.R., Katsaros D., et al. // N Engl J Med. — 2003. — Vol. 348. — P. 203−213.

Аннотация

ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ЛИМФОЦИТАРНОЙ ИНФИЛЬТРАЦИИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ВУЛЬВЫ

Неродо Галина Андреевна д. м.н., профессор, член-корреспондент РАН, РИНЦ SPIN-код: 9162−4949.

Новикова Инна Арнольдовна к.м.н., РИНЦ SPIN-код: 4810−2424.

Златник Елена Юрьевна д. м. н., профессор, РИНЦ SPIN-код: 4137−7410.

Иванова Виктория Александровна д. м. н., профессор, РИНЦ SPIN-код: 8785−9790.

Ульянова Елена Петровна РИНЦ SPIN-код: 1243−9475.

ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Министерства здравоохранения РФ, Россия, 344 037, Ростов-на-Дону, ул. 14-я линия, 63

Для определения возможной роли иммунологического микроокружения опухоли в поддержании длительности ремиссии проведено ретроспективное иммуногистохимическое исследование лимфоцитарно-макрофагальной инфильтрации в опухолевой ткани 84 больных раком вульвы с длительным (свыше 2-х лет) и коротким периодом (менее 2-х лет) ремиссии. Больные раком вульвы с кратковременной ремиссией находились в возрасте от 46 до 85 лет, средний возраст 67 лет. Среди них в I стадии было 15,8% больных, во II — 21%, в III — 47,4% и в IV — 15,8%. Длительность ремиссии у больных этой группы была в среднем 11 месяцев. Возраст больных в группе с длительной ремиссией колебался от 27 до 71 года, средний возраст был 48 лет. В I стадии было 38,5% больных, во II — 53,8%, в III — 7,7%. Длительность ремиссии в этой группе составила в среднем 8 лет. По гистологической структуре у всех больных был выявлен плоскоклеточный рак. В строме и паренхиме опухолевой ткани выявлено наличие лимфоцитарно-макрофагальной инфильтрации различной степени выраженности, с преобладанием в ней Т-лимфоцитов. У больных с длительной ремиссией (свыше 2-х лет) отмечено преобладание CD8+ клеток в ткани злокачественной опухоли, тогда как более высокий уровень опухолевой инфильтрации CD4+ Т-лимфоцитов ассоциировался с более короткой ремиссией (менее 2-х лет) и неблагоприятным прогнозом. Выявленные различия позволяют прогнозировать течение опухолевого процесса и развитие рецидива в ранние или отдаленные сроки Ключевые слова: РАК ВУЛЬВЫ, ПЛОСКОКЛЕТОЧНЫЙ РАК, ЛИМФОЦИТАРНО-МАКРОФАГАЛЬНАЯ ИНФИЛЬТРАЦИЯ, ПРОГНОЗ.

PROGNOSTIC SIGNIFICANCE OF LYMPHOCYTIC INFILTRATION IN VULVAR CANCER PATIENTS

Nerodo Galina Andreevna Dr. Sci. Med., professor, corresponding member of RAS, RSCI SPIN-code: 9162−4949.

Novikova Inna Arnoldovna Cand. Sci. Med., RSCI SPIN-code: 4810−2424.

Zlatnik Elena Yurievna Dr. Sci. Med., professor, RSCI SPIN-code: 4137−7410.

Ivanova Viktoria Aleksandrovna Dr. Sci. Med., professor, RSCI SPIN-code: 8785−9790.

Ulianova Elena Petrovna RSCI SPIN-code: 1243−9475.

Rostov Research Institute of Oncology, Russia, 344 037, Rostov-on-Don, 14-line, 63

A retrospective immunohistochemical study of lymphocyte and macrophage infiltration in tumor tissue of 84 vulvar cancer patients with a long (over 2 years) and short (less than 2 years) remission was performed to determine a possible role of immunologic microenvironment of tumors in maintaining remission. Vulvar cancer patients with a short remission period were aged 46−85 years, mean age 67 years. 15.8% of them had stage I of the disease, 21% - stage II, 47.4% - stage III and 15.8% - stage IV. The average duration of remission in this group was 11 months. Patients with a long remission period were aged 27−71 years, mean age 48 years. 38.5% of them had stage I of the disease, 53.8% - stage II and 7.7% - stage III. The average duration of remission in this group was 8 years. Histological study showed squamous cell carcinoma in all patients. Stroma and parenchyma of tumor tissues demonstrated lymphocyte and macrophage infiltration of various degrees with the predominance of T-lymphocytes. CD8+ cells prevailed in tumor tissue of patients with a long remission period (over 2 years), while a higher level of CD4+ Т-lymphocytic infiltration was associated with a short remission (less than 2 years) and a poor prognosis. These differences allow prediction of the vulvar cancer course and its early or late recurrence.

Keywords: VULVAR CANCER, SQUAMOUS CELL CARCINOMA, LYMPHOCYTE AND MACROPHAGE INFILTRATION, PROGNOSIS.