Получение инсулина. 
Производство инсулина, соматотропина и интерферонов

Всем широко и печально известна такая болезнь, как сахарный диабет, когда организм человека утрачивает способность вырабатывать физиологически важный гормон инсулин. В результате в крови накапливается сахар и больной может погибнуть. Инсулин вырабатывается бета — клетками островков Лангерганса поджелудочной железы. 9] Попытки извлечь его из поджелудочной железы долгое время оставались тщетными, так как этот гормон является полипептидом и разрушается трипсином, содержащимся в ткани вырезанной из организма поджелудочной железы.

Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной железы животных, поэтому стоимость его была очень высока. В 1922 году инсулин, выделенный из поджелудочной железы животного, был впервые введен десятилетнему мальчику, больному диабетом. Результат превзошел все ожидания, и уже через год американская фирма «Eli Lilly» выпустила первый препарат животного инсулина. 12].

Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800−1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200 — 250 грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков. Так, в 1979 году из 6 млн. больных во всем мире только 4 млн. получали инсулин. Без лечения инсулином больные умирали. А если учесть, что среди больных диабетом немало детей, становится понятным, что для многих стран это заболевание превращается в национальную трагедию. Более того, многолетнее применение животного инсулина приводило к необратимому поражению многих органов пациента из-за иммунологических реакций, вызываемых инъекцией чужеродного человеческому организму животного инсулина.

В 1978 году исследователи из компании «Генентек» впервые получили инсулин в специально сконструированном штамме кишечной палочки (E. coli).

Генные инженеры в качестве первой практической задачи решили клонировать ген инсулина. Клонированные гены человеческого инсулина были введены с плазмидой в бактериальную клетку, в результате E. coli приобретает способность синтезировать белковую цепь, состоящую из галактозидазы и инсулина. Синтезированные полипептиды отщепляют от фермента химическим путем, затем проводят и очистку который природные микробные штаммы никогда не синтезировали. Начиная с 1982 года фирмы США, Японии, Великобритании и других стран производят генно-инженерный инсулин. Было показано, что он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается.

Инсулин состоит из двух полипептидных цепей, А и В длиной 20 и 30 аминокислот. При соединении их дисульфидными связями образуется нативный (природный) двухцепочечный инсулин. Одним из методов получения генно-инженерного инсулина является раздельное (разные штаммы-продуценты) получение обеих цепей с последующим фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением изоформ.

Другой метод получения инсулина — синтез проинсулина в клетках E. Coli, для чего на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезировали ее ДНК-копию. После очистки полученного проинсулина его расщепили трипсином и карбоксипептидазой и получили нативный инсулин, при этом этапы экстракции и выделения гормона были сведены к минимуму. Из 1000 литров культуральной жидкости можно получать до 200 граммов гормона, что эквивалентно количеству инсулина, выделяемого из 1600 кг поджелудочной железы свиньи или коровы.

В Великобритании с помощью E. coli синтезированы обе цепи человеческого инсулина, которые затем были соединены в молекулу биологически активного гормона. Чтобы одноклеточный организм мог синтезировать на своих рибосомах молекулы инсулина, необходимо снабдить его нужной программой, то есть ввести ему ген гормона.

В Институте РАН получен рекомбинантный (полученный с помощью генной инженерии) инсулин с использованием генно-инженерных штаммов E.coli. Из выращенной биомассы выделяется предшественник, гибридный белок, экспрессируемый в количестве 40% от всего клеточного белка, содержащий препроинсулин. Превращение его в инсулин in vitro осуществляется в той же последовательности, что и in vivо — отщепляется лидирующий полипептид, препроинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфитолиза с последующим восстановительным замыканием трех дисульфидных связей и ферментативным вычленением связывающего С-пептида. После ряда хромотографических очисток, включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ (Высокоэффективная жидкостная хроматография), получают человеческий инсулин высокой чистоты и природной активности.

Можно использовать штамм со встроенной в плазмиду (небольш. молекулы ДНК) нуклеотидной последовательностью, экспрессирующей гибридный белок, который состоит из линейного проинсулина и присоединенного к его N-концу через остаток метионина фрагмента белка, А Staphylococcus aureus.

Культивирование насыщенной биомассы клеток рекомбинантного штамма обеспечивает начало производства гибридного белка, выделение и последовательная трансформация которого in tube приводят к инсулину.

В последнее время пристальное внимание уделяется упрощению процедуры получения рекомбинантного инсулина методами генной инженерии. Так, например, можно получить слитой белок, состоящий из лидерного пептида интерлейкина 2 присоединенного к N-концу проинсулина, через остаток лизина. Белок эффективно экспрессируется и локализуется в тельцах включения. После выделения белок расщепляется трипсином с получением инсулина и С-пептида.

Полученные инсулин и С-пептид очищались ОФ ВЭЖХ. При создании слитых конструкций весьма существенным является соотношение масс белка носителя и целевого полипептида. С-пептиды соединяются по принципу «голова-хвост» с помощью аминокислотных спейсеров, несущих сайт рестрикции Sfi I и два остатка аргинина в начале и в конце спейсера для последующего расщепления белка трипсином. ВЭЖХ продуктов расщепления показывает, что отщепление С-пептида проходит количественно, а это позволяет использовать способ мультимерных синтетических генов для получения целевых полипептидов в промышленном масштабе.

инсулин соматотропин интерферон синтез.