Моноклональные антитела. 
Лекарственные препараты, получаемые методом генной инженерии

В основе технологии получения моноклональных антител лежат два метода: получение линий миеломных клеток и метод гибридизации соматических клеток, в том числе метод слияния миеломных и нормальных антителообразующих клеток. Это позволило получать гибридомы, которые наследуют от миеломных клеток способность к неограниченному росту, а от антителообразующих клеток — секрецию специфических антител. Для слияния клеток используют раствор полиэтиленгликоля, гибридомы сначала выращивают в селективной среде, затем проводят клонирование гибридом, тестируя их на способность вырабатывать моноклональные антитела. Отобранный клон клеток выращивают в больших объемах, моноклональные антитела получают из надосадочной жидкости культуры гибридом in vitro или из экссудата сингенных мышей, которым предварительно была введена гибридома.

В силу гетерологичности мышиных моноклональных антител они редко используются для иммунотерапии заболеваний человека. К сожалению, пока не удается разработать технологию получения гибридом на основе клеток человека. Проблема решается с помощью метода «гуманизации» мышиных антител. Суть метода заключается в создании генетических структур, которые объединяют V-гены мышиных моноклональных антител с С-генами иммуноглобулина человека необходимого изотипа. В результате специфичность образующихся гибридных антител определяется генами мыши, а их антигенные свойства — преимущественно генами человека. Более сложный, но радикальный способ заключается в объединении гипервариабельных частей У-генов мыши с человеческими С-генами и генами, кодирующими каркасную последовательность У-гена.

Моноклональные антитела широко используются в качестве инструмента для молекулярного анализа антигенного состава различных биологических субстанций и решения фундаментальных проблем иммунологии. Они применяются для диагностических целей, создания сложных диагностических систем. Методы «гуманизации» моноклональных антител открывают перспективу получения больших объемов моноклональных антител, которые могут использоваться для иммунотерапии самых разнообразных патологических состояний человека. В современном производстве имеются примеры, когда для синтеза моноклональных антител используют многотонные культиваторы, что позволяет получать килограммы моноклональных антител.

Можно получить моноклональные антитела всех основных классов с разнообразной специфичностью. Для усиления действия моноклональных антител используют смесь антител с разной специфичностью к одной и той же белковой молекуле. Это многократно усиливает действие антител. В области антиинфекционной иммунотерапии моноклональные антитела испытаны на людях при бактериемии и сепсисе, вызванном грамотрицательными бактериями. У нас в стране пока нет производства лечебных моноклональных антител. В России зарегистрированы препараты, применяемые для иммунотерапии онкологических заболеваний (США) и профилактики кризов отторжения пересаженных органов (Великобритания, Куба).

Одним из основных достижений биотехнологии в области медицины является создание новых высокоэффективных лекарственных препаратов с использованием методов генной инженерии. Это в полной мере касается лекарственных средств, разработанных на основе генно-инженерных моноклональных антител (МкАТ). Создание лекарственных препаратов на основе антител (АТ), специфичных к определенным антигенам (АГ), является перспективным, поскольку иммунная защита организма во многом обусловлена его способностью синтезировать АТ в ответ на чужеродные АГ и удалять их из организма. Обычно Th2-зависимый иммунный ответ, при котором основным действующим началом, определяющим специфичность механизмов защиты, являются гуморальные АТ, развивается на микроорганизмы или их токсины при их внеклеточной локализации. При лечении патологии, вызываемой подобными инфекционными агентами, успешно используют препараты иммуноглобулинов, обогащенных специфическими АТ.

Препараты АТ, полученные при иммунизации животных, даже при использовании современных способов выделения и очистки имеют ограниченные возможности применения, поскольку содержат АТ различной специфичности, а также из-за большого числа побочных эффектов за счет гетерологичных белков.

Таблица 2. Препараты МкАТ, используемые при лечении онкологических заболеваний.

Препараты иммуноглобулинов человека не являются чужеродными для человеческого организма. Их получают из смеси сывороток крови здоровых доноров (не менее чем от 5000 доноров), используя в производстве усовершенствованные технологии — частичное расщепление протеолитическими ферментами, восстановление и алкилирование, обработку сольвентдетергентами, хроматографическую очистку, фильтрацию, ультрафильтрацию и т. д. Использование современных высокоэффективных методов выделения и очистки позволяет снизить возможность развития побочных реакций на препараты иммуноглобулинов. Однако получение широкого спектра специфических АТ в препаратах иммуноглобулинов человека, а также получение достаточного количества АТ необходимой специфичности значительно ограничены, кроме того, не исключена возможность контаминации препаратов инфекционными агентами.

Разработка технологии получения МкАТ с использованием методов генной инженерии дает возможность реализации терапевтического потенциала лекарственных препаратов на основе АТ.

Препараты МкАТ, характеризующиеся высокой специфичностью, стандартностью и технологичностью получения, при определенных клинических показаниях часто способны успешно заменить иммунные сыворотки и препараты иммуноглобулинов.

Таблица 3. Препараты МкАТ, используемые при лечении аутоиммунных заболеваний.

Источником получения МкАТ являются клонированные клетки или организм животного. АТ могут быть получены путем использования иммортализованных («бессмертных») В-лимфоцитов в перевиваемой культуре клеток, либо путем использования клеточных линий, полученных на основе технологии рекомбинантной ДНК.

МкАТ характеризуются постоянством физико-химических свойств, высокой специфичностью, направленностью к строго определенной детерминанте АГ, секретируются одним клоном антителообразующих клеток или клетками гибридом. Получение рекомбинантных препаратов значительно дешевле, чем получение препаратов из другого биологического сырья, они оказывают меньше побочных эффектов, их специфическая фармацевтическая активность выше, однако возможно формирование АТ против рекомбинантных иммуноглобулинов, имеющих антигенные характеристики мышиных АТ (HAMA-ответ, Human Anti-Mouse Antibody).

Для снижения чужеродности МкАТ используют молекулярно-генетическую технологию, которая позволяет приблизить структуру МкАТ к структуре иммуноглобулина человека. С помощью данной технологии создают генетические комплексы, в которых ген, кодирующий вариабельный домен иммуноглобулина мышиных МкАТ (V-ген), объединен с геном, кодирующим константный домен иммуноглобулина человека нужного изотипа (С-ген). При этом специфичность АТ определяется генами мыши, а их антигенная характеристика, в значительной степени, — генами человека. На основе данной технологии разработаны химерные и гуманизированные МкАТ [5].

Таблица 4. Препараты МкАТ, используемые в трансплантологии.

В химерных МкАТ вариабельные домены тяжелых и легких цепей иммуноглобулина человека замещены соответствующими доменами иммуноглобулина мыши или крысы, которые и определяют требуемую антигенную специфичность АТ.

В гуманизированных МкАТ участки, определяющие комплементарное связывание антигена (CDRs), т. е. три короткие гипервариабельные последовательности вариабельных доменов каждой цепи иммуноглобулина имеют мышиное (или другое) происхождение, они встроены в вариабельный домен иммуноглобулина человека. Гуманизированные МкАТ содержат минимум последовательностей грызунов.

Таблица 5. Препараты МкАТ, используемые при лечении инфекционных, аллергических и других заболеваний

Основные требования к производству и контролю, а также общие принципы проведения доклинических испытаний генно-инженерных лекарственных препаратов на основе МкАТ отражены в нашей ранее опубликованной работе.

В настоящее время лекарственные препараты МкАТ по объему производства занимают на мировом фармацевтическом рынке второе место после вакцин. 80% препаратов МкАТ используется в онкологии. Механизмы действия МкАТ на клетки-мишени очень многообразны, среди них — включение каскада иммунных реакций, приводящих к гибели клеток злокачественных опухолей через иммуноопосредованную (антителои комплементзависимую) цитотоксичность, стимуляция фагоцитоза опухолевых клеток, индукция программы апоптоза клеток, блокада каскада сигнальной системы при взаимодействии с рецепторами фактора роста на опухолевых клетках и подавление процессов сигнальной трансдукции, подавление формирования новых сосудов в опухолевых образованиях и за счет этого ингибиция их роста, блокада рецепторов, а также подавление развития патологического процесса за счет связывания МкАТ с определенными детерминантами иммунокомпетентных клеток, провоспалительных цитокинов или их рецепторов.

Для лечения онкологических заболеваний используют два типа МкАТ — простые, неконъюгированные АТ т. е. не связанные с цитотоксическими веществами и конъюгированные — АТ, связанные с радиоактивными частицами, цитостатиками или токсинами (иммунотоксинами). АТ обеспечивают адресную доставку токсичного препарата к опухолевым клеткам, чем и обусловлен терапевтический эффект указанных АТ.

В Российской Федерации зарегистрировано более 15 зарубежных лекарственных препаратов на основе МкАТ, отечественных лекарственных препаратов МкАТ в настоящее время нет. Препараты МкАТ используются для лечения онкологических заболеваний, в трансплантологии для профилактики и подавления реакции отторжения, лечения аутоиммунных, аллергических, инфекционных, сердечно-сосудистых заболеваний.

В табл. 1 приведены сведения о препаратах, используемых в онкологической практике. Препараты «Мабтера (ритуксимаб)», «Кэмпас (алемтузумаб)» специфически взаимодействуют с рецепторами, экспрессированными на опухолевых клетках (CD20, CD52, соответственно), что обусловливает гибель клеток злокачественных опухолей, в основном, за счет иммуноопосредованной цитотоксичности, а также индукции апоптоза. Препараты «Герцептин (трастузумаб)», «Эрбитукс (цетуксимаб)», «Вектибикс (панитумумаб)» взаимодействуют с рецептором эпидермального фактора роста, что приводит к подавлению процессов пролиферации опухолевых клеток, их метастазирования, индукции механизма апоптоза клеток-мишеней. Препарат «Авастин (бевацизумаб)», взаимодействуя с фактором роста эндотелия сосудов, ингибирует рост опухолей за счет подавления формирования новых сосудов в опухолевых образованиях.

В табл. 2 приведены сведения о препаратах МкАТ, используемых для лечения больных с аутоиммунными заболеваниями. При данной патологии наблюдается активация иммунных механизмов при ответе на аутоантиген, обусловливая выработку антител или образование клеток-эффекторов с цитотоксической активностью, а также гиперпродукция провоспалительных цитокинов.

Препараты «Ремикейд (инфликсимаб)», «Хумира (адалимумаб)» и «Энбрел (этанерцепт)» подавляют развитие патологического процесса за счет ограничения проявлений биологического действия провоспалительного цитокина — ФНОб, путем связывания МкАТ с цитокином или его рецептором.

Препарат «Оренсия (абатасепт)» блокирует процесс костимуляции, препятствуя активации Т-лимфоцитов при их взаимодействии с антигенпрезентирующими клетками, что приводит к частичному ослаблению иммунного ответа на аутоантиген. В табл. 3 приведены сведения о препаратах МкАТ, используемых в трансплантологии для профилактики реакции отторжения.

Препараты «Симулект (базиликсимаб)» и «Зенапакс (дакликсимаб)» взаимодействуют с рецептором активированных клеток иммунной системы, в частности Т-лимфоцитов, что приводит к их элиминации и подавлению трансплантационной реакции.

В табл. 4 указаны препараты МкАТ, которые используются при лечении инфекционных, аллергических и других заболеваний. Так, препарат «Синагис (паливизумаб)» блокирует лигандопосредованное взаимодействие респираторного синтициального вируса с клеткой мишенью, тем самым подавляет возможность развития вирусной инфекции в организме.

Противопоказанием для применения всех лекарственных препаратов МкАТ является повышенная чувствительность к компонентам препарата, беременность, период грудного вскармливания. Для препаратов МкАТ, используемых для лечения аутоиммунных заболеваний, противопоказанием являются также тяжелые инфекционные процессы (сепсис, абсцесс, туберкулез, оппортунистическая инфекция). Для препарата «Кэмпас», используемого для лечения онкологических больных, — острый или обострение хронического системного инфекционного процесса, ВИЧ-инфекция. Для препарата «Луцентис», используемого при лечении неоваскулярной формы возрастной макулярной дегенерации, — подтвержденная или предполагаемая инфекция глаза или инфекционные процессы периокулярной локализации. Кроме того, в инструкциях по применению есть указание на возрастные ограничения использования отдельных препаратов МкАТ.

Таким образом, использование биотехнологических достижений в области создания лекарственных средств позволило разработать современные терапевтические препараты, воздействующие более направленно и эффективно, чем традиционные лекарственные препараты. Успешное применение в клинической практике в настоящее время находят препараты, созданные на основе генно-инженерных МкАТ. Терапия с помощью лекарственных препаратов на основе МкАТ высокоспецифична и эффективна, поскольку направлена на определенные патогенетически значимые механизмы развития заболеваний. Указанные препараты используются для лечения больных, страдающих заболеваниями с длительным прогрессирующим течением, таких как онкологические, аутоиммунные, инфекционные и аллергические заболевания, а также в трансплантологии для профилактики и лечения реакции отторжения после трансплантации органов и тканей.