Характеристика системы иммунитета и овариальной функции у женщин с бесплодием при проведении экстракорпорального оплодотворения

Актуальность исследования:

В настоящее время установлено, что функционирование репродуктивной системы осуществляется при тесном взаимодействии с иммунной и эндокринной системами. Происходящие во время менструального цикла и беременности изменения контролируются со стороны гипоталамо-гипофизарной системы и являются прямым результатом индуцированного гормонами тканевого ремоделирования тканей яичника и слизистой матки. Действие гормонов на клеточном уровне реализуется через вовлечение множества пептидных ростовых факторов, среди которых особая роль отводится лимфогемопоэтическим цитокинам, продуцируемым иммунокомпетентными клетками (ИКК) [19, 142, 36].

На сегодняшний день наиболее исследованными являются иммунологические аспекты, связанные с поддержанием и нормальным протеканием беременности. Эта сфера включает изучение механизмов иммунологической перестройки, направленной на подавление реактивности иммунной системы матери по отношению к аллоантигенам плода. Вместе с тем роль иммунной системы в регуляции самых ранних этапов репродуктивного процесса — фолликулогенеза, овуляции, доимплантационных этапов развития эмбриона и его имплантации, остаются существенно менее изученными [210, 42].

Одним из наиболее значимых достижений репродуктивной медицины явилась разработка и внедрение в практику лечения бесплодия методов вспомогательных репродуктивных технологий и, в частности, экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Данная процедура основана на гормональной стимуляции роста нескольких фолликулов в яичниках (стимуляция суперовуляции), пункции фолликулов и забора из них яйцеклеток, оплодотворении яйцеклеток in vitro и переносе эмбрионов в полость матки. Внедрение ЭКО повлекло за собой целую серию экспериментальных исследований на животных, посвященных иммунной регуляции овариальной функции, оплодотворения и имплантации эмбриона, а с другой стороны явилось инструментом для изучения иммунной регуляции указанных процессов у человека.

В результате стало очевидным, что прямо или опосредованно через растворимые продукты ИКК принимают активное участие в регуляции ранних стадий репродуктивного процесса. Выяснилось, что яичники не являются в строгом смысле иммунопривилегированным органом [47]. Клетки иммунной системы присутствуют в яичнике, и их количество может существенно возрастать за счет миграции рециркулирующих лейкоцитов [40, 41]. Причем многие цитокины присутствуют в фолликулярной жидкости в концентрации, существенно превышающей таковую в периферической крови, что указывает на их важность в регуляции функций яичников [189, 142]. Продуцируемые ИКК цитокины контролируют в фолликулиновую фазу созревание фолликула, стимулируя рост клеток гранулозы, но ингибируя их дифференцировку. Во время пика выброса лютеинизирующего гормона (ЛГ) происходит мощный приток нейтрофилов и макрофагов и секреция провоспалительных цитокинов. Именно эти механизмы лежат в основе процесса овуляции и позволяют рассматривать разрыв фолликула как воспалительный процесс, ведущую роль в котором играют IL-1, TNF-a [71, 42, 142]. Миграция лейкоцитов в яичник обеспечивается хемокинами (IL-8, МСР-1, RANTES), уровень которых контролируется гонадотропинами и цитокинами и резко возрастает к моменту овуляции [83, 190, 141]. Присутствие в фолликулярной жидкости ИКК и цитокинов указывает на их возможное участие в созревании ооцитов [150, 151, 194]. Во время лютеиновой фазы необходимым условием формирования желтого тела является неоваскуляризация. Важную роль в этом процессе играют цитокины, прямо (сосудистый эндотелиальный ростовой фактор, VEGF) или опосредованно (IL-6, TNF-a, TGF-|3) стимулирующие неоангиогенез [142].

Причем наряду с активацией ангиогенеза, цитокины индуцируют дифференцировку клеток гранулозы и запуск синтеза стероидных гормонов [136]. Если беременность не наступает, Т-клетки и эозинофилы участвуют в регрессии желтого тела, оказывая прямой токсический эффект, а также привлекая макрофаги и активируя фагоцитоз поврежденных клеток [185, 142].

Наряду с регуляцией овариальной функции клетки иммунной системы и продуцируемые ими цитокины выполняют исключительно важную роль в подготовке эндометрия к имплантации эмбриона, а впоследствии — в сохранении беременности [196, 109, 170]. Значительное количество находящихся в эндометрии лимфоцитов и макрофагов являются ключевыми медиаторами ремоделирования ткани эндометрия [93]. Взаимодействие децидуальных NK клеток с аллоантигенами трофобласта (HLA-G, HLA-E) играет важную роль в успешной имплантации и плацентации. Кроме того, важной функцией плацентарных NK-клеток, макрофагов и Т-клеток является формирование и поддержание толерантности к аллоантигенам плода. Это достигается за счет преимущественной продукции иммунокомпетентными клетками ТЪ2/противовоспалительных цитокинов [181, 98, 218].

Учитывая тесную взаимосвязь иммунной и репродуктивной системы в регуляции овариальной функции, развитии эмбриона, его имплантации и сохранении беременности очевидно, что наличие исходных иммунных дисфункций, а также развитие их в процессе стимуляции овуляции может быть серьезной причиной низкого качества ооцитовдефекта оплодотворения яйцеклетки, нарушения развития и имплантации эмбриона, и, в конечном итоге, отсутствия/потери беременности. Поэтому большой интерес представляет исследование показателей системного и локального иммунитета, а также овариальной функции в группах женщин, оппозитных по уровню фертильности, качеству эмбрионов, имплантации и клинической беременности. Исследования такого рода имеют большое практическое и теоретическое значение, поскольку, во-первых, позволяют осмыслить новые аспекты иммуно-эндокринной регуляции ранних этапов репродуктивного процесса и патогенеза бесплодия, а, во-вторых, разработать прогностические критерии эффективности вспомогательных репродуктивных технологий. Кроме того, возможно уже в скором времени полученные в этой области знания позволят разработать и внедрить в практику методы адьювантной цитокинотерапии, направленной на повышение эффективности ЭКО, результативность которой на сегодняшний день составляет по данным разных авторов от 30 до 40% [6, 175, 205].

Анализ данных литературы в указанной области свидетельствует о достаточной противоречивости полученных результатов. Целый ряд авторов отвергают возможность определения концентрации цитокинов или других иммунологических маркеров в качестве прогностического критерия эффективности ЭКО. Так, Geva Е. с соавт. показали отсутствие корреляции между концентрацией IL-10 в фолликулярной жидкости (ФЖ) и количеством ооцитов, уровнем оплодотворения, качеством эмбрионов и наступлением беременности при проведении ЭКО [88]. Отсутствие достоверных различий в группах женщин, оппозитных по наступлению беременности, продемонстрировано также в отношении содержания в ФЖ иммуноглобулинов, IL-6, IL-8, GM-CSF, фактора роста фибробластов (FGF) и молекулы адгезии sICAM-1 [91, 90, 86]. Ozornec М.Н. с соавт. исследовали содержание в ФЖ LIF и показали сходный уровень данного цитокина у женщин с наличием и отсутствием беременности [174]. К аналогичному заключению пришли авторы, изучающие в ФЖ IL-2 и его растворимые рецепторы (sIL-2R). Им не удалось выявить какой-либо связи между концентрацией IL-2 и sIL-2R с уровнем фертилизации, качеством эмбрионов и наступлением беременности [30].

С другой стороны имеются данные о достоверных различиях в уровне отдельных цитокинов в ФЖ в группах женщин, оппозитных по исходу ЭКО.

Так, продемонстрировано, что отсутствие беременности на циклах ЭКО сопряжено с наличием в ФЖ определяемого уровня IL-12 [86] и более высокого содержания VEGF [77]. В свою очередь наступление беременности ассоциируется с нарастанием в ФЖ M-CSF на фоне стимуляции гонадотропинами [166], а также более высоким содержанием фактора роста стволовых клеток [201] и TGF-j31 [78]. Наиболее противоречивые данные получены в отношении IL-1. В литературе имеются данные как о положительной ассоциации между высоким уровнем IL-1{3 в момент забора яйцеклетки и успешной имплантацией эмбрионов [111], так и отрицательной ассоциации IL-lp с наступлением беременности [151], или же отсутствием корреляционной связи между концентрацией IL-lp и уровнем оплодотворения яйцеклетки [32].

Следует отметить, что некоторые системные параметры иммунитета, включая концентрацию сывороточных цитокинов и количество отдельных субпопуляций ИКК, также могут различаться в группах женщин с наступившей и не наступившей/прервавшейся беременностью. Например, при проведении ЭКО численность активированных NK-клеток (CD56dimCD16+CD69+) в периферической крови женщин с наступившей беременностью оказалась достоверно ниже, чем в группе с отсутствием беременности [220], а повышенный уровень в сыворотке IFN-y и растворимых рецепторов к IL-2 на 11 день после переноса эмбрионов был сопряжен с ранним прерыванием беременности [73].

Что касается качества эмбрионов, то оцениваемый морфологически данный критерий является одним из основных и наиболее прогностически ценных параметров при проведении ЭКО. Тем не менее, морфологическая оценка эмбрионов перед переносом, хотя и позволяет проводить их раннюю селекцию, не является фактором прогноза успешной беременности [7, 13].

Из представленных выше данных следует, что только небольшое количество иммунологических параметров достоверно различается в и зависимости от исхода ЭКО. Однако даже эти маркеры не охарактеризованы с точки зрения информативности. Многие цитокины, в частности, хемокины (МСР-1, М1Р-1Ъ) и лимфокины (1Ь-4, 1Ь-7, 1Ь-13, 1Ь-17), которые были недавно выявлены в ФЖ [42, 228], не исследованы соотносительно их прогностической ценности при различных исходах ЭКО. В литературе также полностью отсутствуют сведения о количественных изменениях естественных супрессорных клеток при различных исходах ЭКО. Между тем не исключено, что данный тип клеток наряду с цитокин-опосредованной супрессией играет важную роль в развитии периферической толерантности, в том числе к аллоантигенам плода. Количество супрессорных Т-клеток с фенотипом СВ4+СБ25+ увеличено при физиологической беременности [16]. В то же время сведения об участии этих клеток в регуляции самых ранних этапах репродуктивного процесса отсутствуют.

Таким образом, несмотря на достаточно интенсивные исследования в области иммунной регуляции начальных этапов репродуктивного процесса, пригодные для прогноза ЭКО иммунологические маркеры (включающие показатели иммунитета на системном и локальном уровне) до сих пор не определены. Исходя из этого, была сформулирована цель настоящего исследования:

Цель исследования:

На основе комплексного анализа иммунологических параметров, а также показателей овариальной функции изучить возможность раннего прогноза развития беременности у женщин с бесплодием при проведении экстракорпорального оплодотворения.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить особенности иммунитета женщин на различных этапах овариального цикла при его физиологическом течении и в условиях проведения контролируемой стимуляции по программе ЭКО.

2. Провести комплексный анализ уровня 17 цитокинов в фолликулярной жидкости на пике стимулированной суперовуляции и оценить роль цитокинов в процессе созревания ооцитов.

3. Провести сравнительный анализ иммунологических параметров и показателей овариальной функции женщин в зависимости от эффективности ЭКО.

4. Проанализировать информативность и прогностическую значимость показателей иммунитета и овариальной функции в оценке эффективности лечения бесплодия с помощью ЭКО.

Научная новизна Впервые установлено, что в овуляторный период физиологического менструального цикла, и, особенно, на пике стимулированной суперовуляции в сыворотке женщин доминируют медиаторы с иммуносупрессорной и противовоспалительной активностью. Сдвиг баланса регистрируется как на системном, так и на местном (в фолликулярной жидкости) уровне, что в сочетании с увеличением количества регуляторных СВ4+СБ25+Т-лимфоцитов, снижением уровня спонтанной пролиферации МНК и увеличением в крови доли апоптотических нейтрофилов свидетельствует о супрессорной реорганизации иммунной системы на пике суперовуляции.

В результате комплексной оценки уровня 17 цитокинов впервые охарактеризован цитокиновый профиль микроокружения фолликула в период стимулированной суперовуляции, что позволило получить новые данные о роли цитокинов в процессе созревания ооцитов. При этом впервые показано, что на фоне пониженного уровня 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-7 и в-СЗБ происходит 2-кратное снижение общего количества образующихся ооцитов, тогда как в условиях многокомпонентного дефицита ТЫ/провоспалительных (ШЫ-у, 1Ь-2, ЮТ-а, 1Ь-1|3,1Ь-12,1Ь-17) и ^/противовоспалительных (1Ь-4, 1Ь-10, 1Ь-6, 1Ь-13) цитокинов, а также ростовых факторов (в-СЗБ, 1Ъ-7) и хемокинов (М1Р-1а) нарушаются их качественные характеристики, и как следствие — эффективность оплодотворения in vitro. При ретроспективном анализе результатов лечения бесплодия методом ЭКО впервые показано, что уровень цитокинов в микроокружении фолликула не только во многом определяет количество и качество созревающих ооцитов, но также имеет большое значение для имплантации оплодотворенных яйцеклеток. Так, у женщин с низким содержанием IL-2, IL-4, IL-7 или G-CSF, а также в подгруппах женщин с повышенным содержанием IL-8 или IL-13 частота наступления беременности в цикле ЭКО составляла в среднем 20% (от 17,4 до 25%), т. е. в 3−4 раза ниже, чем в оппозитных подгруппах, где эффективность ЭКО достигала 75−80%.

Практическая значимость Использование методов математического анализа позволило выделить диагностически значимые диапазоны параметров иммунного статуса, цитокинового профиля ФЖ, а также показателей овариальной функции, которые характеризовались высокой информативностью в раннем прогнозе эффективности лечения бесплодия с помощью ЭКО. В диагностический комплекс, который позволяет прогнозировать успешное развитие беременности в цикле ЭКО, были включены 10 клинико-иммунологических показателей, диагностические коэффициенты (ДК) которых варьировали от +2,4 до +6,0. Диагностический комплекс, прогнозирующий вероятность неэффективного цикла ЭКО, включал 13 показателей с ДК от -3,6 до -12,0. Высокая прогностическая ценность выделенных комплексов признаков указывает на целесообразность использования методов иммунодиагностики при проведении вспомогательных репродуктивных технологий.

Внедрение результатов работы в практику Результаты исследования внедрены в практику работы отделения ЭКО медицинского центра «Авиценна» г. Новосибирска.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. В овуляторный период менструального цикла, особенно на пике контролируемой суперовуляции по программе ЭКО, в сыворотке и в фолликулярной жидкости женщин выявляется преобладающая активность регуляторных факторов с иммуносупрессорным/противовоспалительным действием.

2. Иммунная система через цитокин-опосредованные механизмы принимает участие в регуляции процесса созревания ооцитов, при этом спектр и уровень цитокинов, продуцируемых в микроокружении фолликула, определяет не только общее количество и качественные характеристики созревающих ооцитов, но также эффективность последующей имплантации оплодотворенных яйцеклеток в цикле ЭКО.

3. Комплексная оценка параметров иммунного статуса, уровня цитокинов в фолликулярной жидкости, а также показателей овариальной функции женщин, обследованных на этапе стимулированной суперовуляции, позволяет прогнозировать вероятную эффективность лечения бесплодия с помощью ЭКО.

Объем и структура диссертации Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 119 страницах машинописного текста, включающего 29 таблиц и 7 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 242 литературных источника, в том числе, 225 иностранных.

ВЫВОДЫ.

1. В овуляторный период физиологического менструального цикла и, особенно, на пике стимулированной суперовуляции в сыворотке и фолликулярной жидкости женщин доминируют регуляторные факторы с иммуносупрессорной и противовоспалительной активностью, что в сочетании с увеличением количества регуляторных CD4+CD25+T-лимфоцитов, снижением уровня спонтанной пролиферации МНК и увеличением в крови доли апоптотических нейтрофилов свидетельствует о супрессорной реорганизации иммунной системы.

2. В микроокружении фолликула обнаруживается широкий спектр иммуногемопоэтических цитокинов: Thl/провоспалительные (IL-2, IFN-y, TNF-a, IL-ip, IL-12), ТЪ2/противовоспалительные (IL-4, IL-5, IL-10, IL-6, IL-13) цитокины, хемокины (IL-8, MCP-1J3, MlP-la), ростовые факторы (GM-CSF, G-CSF), в том числе впервые выявленные IL-7 и IL-17, что указывает на их участие в регуляции фолликулогенеза.

3. Наличие обратной корреляционной зависимости циркулирующих CD4+CD25+естественных супрессорных Т-клеток с концентрацией IL-lp, TNF-a, IL-8 и прямой взаимосвязи с уровнем IL-4 в ФЖ на пике стимулированной суперовуляции указывает на сопряженность цитокини клеточно-опосредованных механизмов регуляции фолликулогенеза.

4. Снижение количества созревающих ооцитов сопряжено с низким содержанием в ФЖ IL-2, IL-4, IL-7 и G-CSF, тогда как нарушение качественных характеристик ооцитов и эффективности их оплодотворения in vitro ассоциируется с дефицитом большинства исследуемых цитокинов (IFN-y, IL-2, IL-lp, TNF-a, IL-12, IL-17, IL-6, IL-4,.

1Ь-10, 1Ь-7, О-СЗБ, М1Р-1 (3), что подтверждает значимость цитокинов в регуляции овариальной функции.

5. Уровень и спектр цитокинов в фолликулярной жидкости сопряжен не только с количеством и качеством ооцитов, но также с эффективностью имплантации эмбрионов и развитием беременности. Так, в подгруппах женщин с дефицитом 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-7, С-СЗБ и с повышенным содержанием 1Ь-8 или 1Ь-13 эффективность ЭКО в 3−4 раза ниже, чем в оппозитных группах (20−25 и? 75−80%).

6. Для раннего прогноза исходов ЭКО выделены комплексы иммунологических параметров, характеризующиеся в определенных диапазонах значений высокой информативностью и диагностической значимостью, что указывает на целесообразность использования методов иммунодиагностики при проведении вспомогательных репродуктивных технологий.