Стерилизация. 
Микробиология, понятия и характеристики

Стерилизация является одним из важнейших и необходимых приемов в микробиологической практике. Слово «стерилизация» в переводе с латинского означает обеспложивание. В практической работе под стерилизацией понимают методы, применяемые для уничтожения всех форм жизни, как на поверхности, так и внутри стерилизуемых объектов, микробиологи стерилизуют питательные среды, посуду, различные инструменты и другие необходимые предметы с целью не допустить развития посторонних микроорганизмов в исследуемых культурах. Термин «стерильность» имеет абсолютное значение.

Различают термическую и холодную стерилизацию. В микробиологии находят применение следующие способы термической стерилизации: прокаливание в пламени и обжигание, сухожаровая стерилизация (горячим воздухом), стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование), дробная стерилизация (тиндализация), кипячение, из методов холодной стерилизации микробиологи используют стерилизацию фильтрованием, ультрафиолетовыми лучами и газообразными средствами. Возможность и целесообразность применения того или иного способа определяются в первую очередь физико — химическими свойствами материала, подлежащего стерилизации, а иногда и целью исследования.

СТЕРИЛИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД:

· Стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование) Это наиболее надежный и чаще всего применяемый способ стерилизации питательных сред. Он основан на нагревании материала насыщенным водяным паром при давлении выше атмосферного. Известно, что температура пара возрастает при повышении его давления (табл. 1).

Совместное действие высокой температуры и пара обеспечивает особую эффективность данного способа. При этом погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов. Установлено, что споры большинства микроорганизмов не выдерживают и 5-минутную экспозицию в насыщенном паре при 121°. Лишь споры некоторых почвенных микробов погибают при 1 атм только через 20 мин. Стерилизацию паром под давлением осуществляют в специальных герметически закрывающихся толстостенных аппаратах — автоклавах.

Устройство автоклавов. Автоклавы разнообразны по форме, размерам, рабочему давлению, конструкции и другим показателям; они могут быть с ручным управлением, полуавтоматические, автоматические (рис. 31 и 32). Но поскольку все автоклавы предназначены для выполнения одной и той же задачи — стерилизации, основной принцип их устройства один и тот же. Разберём его на примере вертикального автоклава с ручным управлением (рис. 33).

Автоклав представляет собой металлический двустенный резервуар, способный выдерживать высокое давление. Его внутренняя часть является стерилизационной камерой (1). В нее помещают стерилизуемый материал. Стерилизационная камера снабжена краном (2) для выхода воздуха, манометром (3) для определения давления пара и предохранительным клапаном (4) для выхода пара при повышении давления сверх необходимого и для предотвращения разрыва автоклава. Пространство между стенками (5), называемое водопаровой камерой, заполняется через воронку (6) водой (лучше дистиллированной, чтобы не образовывалась накипь) до определенного уровня, который отмечен на специальной водомерной трубке автоклава (7). Выше этого уровня воду наливать не следует, так как при бурном кипении вода может попасть в трубку, ведущую к манометру, и исказить его показания. В верхней части внутренней стенки водопаровой камеры имеются отверстия (8), через которые пар поступает в стерилизационную камеру. Паровой котёл сверху покрыт защитным кожухом (9). Он предохраняет котёл от механических повреждений, а работающих около автоклава — от ожогов. Для создания герметичности автоклав плотно закрывается массивной крышкой (10) с резиновой прокладкой.

Таблица 1 — Температура насыщенного пара при различном давлении

Автоклавирование. Отдельные операции процесса стерилизации в автоклавах разных типов могут быть несколько различными. Соответственно немного различается и техника работы с ними. Однако общий принцип проведения стерилизации в разных автоклавах один и тот же.

Перед работой осматривают автоклав и контрольно — измерительную аппаратуру. При наличии любой неисправности (смещение стрелки манометра с нуля, трещина на водомерной трубке и др.) работать с автоклавом нельзя. После осмотра автоклава в водопаровую камеру наливают воду до верхней отметки на водомерной трубке. В некоторых автоклавах предельный уровень заполнения водой контролируется воронкой. В стерилизационную камеру на специальную подставку помещают стерилизуемый материал. Предметы следует размещать не слишком плотно, так как пар должен свободно проходить, между ними, иначе они не нагреваются до нужной температуры и могут остаться нестерильными. Загрузив стерилизационную камеру, устанавливают и плотно завинчивают крышку (дверь) автоклава. Затем открывают кран, соединяющий стерилизационную камеру с наружным воздухом, и включают нагрев.

Рисунок 32. Автоклав автоматический.

Рисунок 33. Схема автоклава: 1 -стерилизационная камера; 2 — кран для выхода воздуха; 3 — манометр; 4 — предохранительный клапан; 5 — водопаровая камера; 6 — воронка для заполнения автоклава водой; 7 — водомерная трубка; 8 — отверстия для поступления пара в стерилизационную камеру; 9 — защитный кожух; 10 — крышка aвтоклава; 11 — подставка для размещения стерилизуемых предметов.

После начала парообразования удаляют воздух из стерилизационной камеры. Это необходимое условие стерилизации, так как при одном и том же давлении температура чистого пара выше температуры смеси пара и воздуха. Поэтому если в автоклаве останется воздух, материал может не простерилизоваться. Наиболее простой и очень распространенный способ обезвоздушивания автоклава — вытеснение воздуха паром. Пар и конденсат отводят либо в сосуд с водой, либо в специальное устройство, соединенное с канализацией. В первом случае на кран (2) надевают резиновый шланг, который опускают в воду. Началом продувания считают появление устойчивой непрерывной струи чистого пара. Пока в автоклаве еще имеется воздух, смесь воздуха и пара, проходя через воду, издаст сильный треск. Чистый пар выходит с равномерным шипящим звуком. Его пропускают в течение 10 мин. В целом вся операция с момента появления пара с воздухом должна занимать не более 15 — 20 мин. иначе в автоклаве останется мало воды и он может испортиться. Чтобы уменьшить расход пара (воды), кран открывают не полностью. Степень открывания крана устанавливают на практике при эксплуатации автоклава. В наиболее совершенных автоклавах воздух из стерилизационной камеры удаляют с помощью вакуумного насоса.

Kогда воздух вытеснен, закрывают пароотводный кран, и давление пара доводят до показания, соответствующего pежиму стерилизации. Режим автоклавирования часто выражают в единицах избыточного давления, указывая при этом продолжительность его поддержания. Например: стерилизация при 1 атм в течение 20 мин. На манометре автоклава обозначается именно то дополнительное давление, которое создается в автоклаве сверх нормального. Нередко режим автоклавирования характеризуют температурой и временем. Как только стрелка манометра дойдет до указателя oпределённого дополнительного давления и, следовательно, температура пара достигнет соответствующего значения, поддерживают давление на этом уровне необходимое время путем ручного или автоматического регулирования подачи пара. В автоклавах с огневым обогревом подачу пара регулируют интенсивностью горения, в автоматических автоклавах — электроконтактным манометром.

По окончании времени стерилизации выключают нагрев автоклава. Давление в автоклаве постепенно падает и сравнивается с атмосферным. Лишь после этого открывают кран, выводящий пар. Преждевременное открывание крана недопустимо, так как перегретые среды при резком снижении давления сразу же бурно закипают, смачивают и даже иногда выталкивают ватные пробки, что нарушает впоследствии стерильность материала. Когда пар выйдет, открывают крышку (дверь) автоклава, соблюдая при этом осторожность во избежание ожога паром лица и рук. Удаление пара из стерилизационной камеры автоклавов, оснащенных вакуумным насосом, осуществляют с помощью насосa. Одновременно происходит подсушивание стерильного материала.

Поскольку автоклав является аппаратом, работающим при высоких давлениях и температурах, неправильное обращение с ним может быть причиной несчастных случаев. Установка автоклава и работа с ним производятся при строгом и точном выполнении правил, указанных в прилагаемой к аппарату инструкции. К работе допускаются только подготовленные лица.

Подготовка сред к стерилизации. При автоклавнровании 3 — 5%.

жидкости теряется в результате испарения, поэтому рекомендуется в приготавливаемые среды добавлять сверх объема примерно 5% дистиллированной воды. Тогда после стерилизации среда (раствор) будет иметь требуемую концентрацию.

Среды обычно стерилизуют в пробирках, колбах, бутылях. Емкости заполняют средой не более чем на половину их высоты, чтобы предотвратить смачивание пробок. Сосуды со средами закрывают ватными пробками. Они предохраняют cpeдy от заражения микрофлорой, находящейся в окружающем воздухе. Пробки должны быть дocтаточно плотными, чтобы выполнить эту функцию, но с равномерным распределением волокон ваты, так как через них происходит газообмен культуры с окружающей средой. Слишком плотные пробки затрудняют снабжение культур воздухом.

Для приготовления пробки плоский кусок ваты, взятый вдоль волокна, скатывают валиком. Чтобы придать пробке прочность, ее прокатывают между ладонью и чистым стеклом, лежащим на столе. Длина пробки для обычной пробирки должна быть около 4 см. Пробка должна входить в пробирку на 1,5 — 2,0 см (рис 34). Для сохранения формы пробку вынимают из горлышка, слегка вращая. Удобно обернуть пробку чистой марлевой салфеткой.

Перед стерилизацией пробки можно прикрыть бумажными колпачками. Нельзя обертывать пробки сосудов, которые будут стерилизоваться в автоклаве, целлофаном. Фольгой или другими материалами, не пропускающими пар, так как пар должен обязательно проникать через пробку в сосуд иначе среды не нагреются до нужной температуры и не простерилизуются. При использовании стеклянных, резиновых, корковых и других пробок их завёртывают в двойной слой обёрточной бумаги и стерилизуют привязанными к склянке, закрытой ватной пробкой. Пробки в сосуде меняют стерильно около пламени горелки.

Выбор режима автоклавирования. В микробиологической практнке стерилизация в автоклавах осуществляется при температуре в пределах 111−138°С, т. е. от 0,5 до 2,5 атм. Температура ниже 111°С не может считаться надежной; температура выше 138°С, как правило, не является необходимой, к тому же, чем выше давление пара, тем сложнее условия эксплуатации aвтоклава. При использовании автоклавов без вакуумных насосов наиболее надежными считаются следующие режимы стерилизации: 15 — 45 мин при 121 °C (1 атм) и 10 — 30 мин при 126 (1,5 атм).

Микробиологи чаще всего стерилизуют при 0,5 и 1 атм.

Рисунок 34. Ватные пробки: А — приготовлена правильно, Б и В — приготовлены неправильно.

Таблица 2 — Зависимость продолжительности стерилизации жидкостей от объёма сосудов

Температура и длительность автоклавирования питательных сред.

определяются прежде всего их составом, термоустойчивостыо или термолабильностыо компонентов. Такие легко разрушающиеся субстраты, как молоко или желатиновые среды, а также субстраты, содержащие сахара, витамины (сусло пивное, соки, дрожжевой автолизат и др.) обычно стерилизуют при 0,5 атм в течение 15−30 мин. Мясо-пептонные среды можно стерилизовать при 1,0 атм 20 мин. Среды, содержащие агар, стерилизуются труднее, потому что стерилизация начинается фактически после того, как агар расплавится. Но и расплавленный агар требует для стерилизации вдвое больше времени, чем тот же объем воды. С трудом поддаются стерилизации в автоклаве различные порошки (например, тальк) и вязкие жидкости (глицерин, вазелиновое масло), поскольку они плохо передают тепло и очень медленно прогреваются. Их лучше стерилизовать в сушильных шкафах при 160 в течение 2 ч или 1 ч при 170 °C. В этом случае слой масла или порошка в сосуде не должен превышать 1,5 см.

Имеются субстраты, в которых могут быть споры, отличающиеся особой термостабильностью. К ним относится почва, причём она, кроме того, и нагревается с замедленной скоростью. Ее обычно стерилизуют при 1 атм либо 1 раз 2 ч, либо два дня подряд по 1 ч, а иногда при 2 атм 2 ч.

Выбирая режим стерилизации, необходимо учитывать pH среды. При кислой реакции многие вещества, входящие в её состав, могут подвергнуться гидролизу. Чем ниже значение рН, выше температура и больше продолжительность стерилизации, тем интенсивнее происходит гидролиз. В результате после стерилизации перестают застывать среды с желатином и даже с aгаpoм. Если среда щелочная, то при стерилизации выпадают в осадок соли железа, карамелизуются и становятся непригодными для использования бактериями сахара. В некоторых случаях в процессе стерилизации изменяется рН среды. Так, если рН среды с углеводами выше 7,0, то может произойти ее подкисление до рН 6,0. Особенно часто это наблюдается в присутствии ксилозы. Чтобы избежать таких явлений, рекомендуется углеводы, фосфаты, соли железа автоклавировать отдельно в виде более или менее концентрированных растворов в дистиллированной воде при том значении рН, которое обеспечивает целостность вещества. После стерилизации растворы стерильно объединяют в нужном соотношении. Таким приемом раздельной стерилизации в микробиологии пользуются довольно часто, поскольку многие компоненты сред нельзя стерилизовать одним и тем же способом.

Режим автоклавирования в значительной степени зависит от объема стерилизуемого субстрата. Чем больше объем, тем больше времени при одной и той же температуре (давлении) требуется для обеспечения надежности стерилизации. Имеет значение толщина стенок и форма емкостей. Это нужно учитывать в практической работе. Например, не следует стерилизовать термочувствительный субстрат одновременно в пробирках и больших бутылях. Если среда стерилизуется по режимам, рекомендованным для малых объемов, содержимое бутыли может не простерилизоваться. Если же стерилизация проводится с расчётом на большой объем, среда в пробирке прогревается значительно дольше, чем требуется, и может испортиться.

После автоклавирования среды для проверки стерильности выдерживают 2−3 суток в термостате при 30 °C. Если в средах обнаруживается рост микроорганизмов, их готовят заново.

· Дробная стерилизация (тиндализация)

Дробная стерилизация применяется для обеззараживания сред, разрушающихся под действием температур выше 100 °C. Этот прием был введен английским ученым Тиндалем. Принцип тиндализации заключается в том, что прогревают среду или ее компоненты без избыточного давления несколько раз, и в период между прогреваниями дают прорасти жизнеспособным спорам. Предполагается, что развивающиеся из спор клетки погибают при последующем прогревании, не успев образовать новые споры. Прогревание можно осуществлять в парах кипящей воды, т. е. при 100 °C или, как говорят, текучим паром. Обработку текучим паром проводят 3−4 раза по 20−40 мин в aвтоклаве с незакрытой крышкой, в кипятильнике Коха или на водяной бане с хорошо пригнанной крышкой. Время прогревания отмечается с момента энергичного выделения пара.

Кипятильник Коха представляет собой металлический цилиндр, обычно накрытый теплоизолирующим слоем, чаще всего — асбестом. Внутри цилиндра находится сетчатое ведро или подставка на ножках, куда помещают стерилизуемый материал, прикрыв его клеёнкой для защиты от конденсационной воды. На дно цилиндра наливают воду так, чтобы уровень ее не доходил до дна подставки. Кипятильник закрывают крышкой, в которой имеется отверстие для выхода пара, и нагревают с помощью газовой горелки или электричества. В современных аппаратах Коха имеются терморегуляторы.

В промежутки между прогреваниями среды помещают на сутки в термостат, отрегулированный на 30 °C, для проращивания спор. Субстраты, не выдерживающие нагревания при 100 °C, прогревают более осторожно: при 70−80°С по 1 ч ежедневно в течение 3 дней или при 60−65°С в течение 5 дней. Между нагреваниями их выдерживают при температуре от 25 до 37°С.

Тиндализация обеспечивает стерильность лишь в том случае, если среда, в которой находятся споры и поддерживаемая между прогреваниями температура обеспечивает их прорастание, и с другой стороны, если появившиеся вегетативные клетки вновь не образуют термостойкие споры. Существенным недостатком дробной стерилизации является и то, что она требует большой затраты времени. Вот почему практическое значение тиндализации в настоящее время весьма ограничено. Этим способом пользуются преимущественно для стерилизации некоторых термолабильных лекарственных веществ и иногда — желатины.

· Стерилизация фильтрованием

Стерилизация фильтрованием широко используется в микробиологической практике. Она применяется для субстратов, не выдерживающих нагревания, например, для жидких сред и растворов, содержащих термолабильные белки, витамины, сахара, некоторые антибиотики, а также для сывороток, летучих веществ, например некоторых углеводородов и других. Этим способом освобождают культуральную жидкость от клеток микроорганизмов, когда необходимо сохранить содержащиеся в ней продукты обмена в неизменном виде.

Способ заключается в пропускании жидкостей через специальные мелкопористые фильтры, называемые бактериальными. Микробные клетки задерживаются фильтрами главным образом механически, поскольку они крупнее диаметра пор фильтра, а также потому, что поры идут через фильтр чрезвычайно извилисто и на всём протяжении имеют разную форму и неодинаковый размер. Если же фильтр изготовлен из положительно заряженного материала, то имеет место и притягивание бактерий к стенкам пор, поскольку большинство микроорганизмов в водной суспензии имеет на своей поверхности отрицательный заряд. Такой фильтр может эффективно задерживать даже те микроорганизмы, средние размеры которых несколько меньше среднего диаметра пор. Тем не менее поры фильтров должны быть достаточно мелкими не только затем, чтобы обеспечить механическую задержку клеток, но и для того, чтобы микроорганизмы оказались в сфере действия электрического заряда стенок.

Диаметр пор определяет область применения фильтров. Стерилизующими бактериальными фильтрами теоретически можно считать такие, размер пор которых не превышает 0,75 мкм. В практике пригодность фильтров для стерилизации устанавливают путем пробной фильтрации через них суспензии какого-либо мелкого микроорганизма, например Pseudomonas aeruginosa. Для проверки на стерильность фильтрат в большом количестве высеивают на питательную среду. Если в течение 5 дней тест — организм не вырастет, фильтры могут быть использованы для стерилизации. Как правило, бактериальные фильтры пропускают L — формы бактерий, вирусы и бактериофаги.

Типы бактериальныx фильтров. Бактериальные фильтры изготавливаются из разных материалов. Они различаются по форме и диаметру пор, обычно указанному на упаковке фильтра или в прилагаемом паспорте. Нередко фильтры выпускаются под определёнными номерами и марками.

Мембранные (коллоидные) фильтры готовят на основе нитроцеллюлозы. Отечественная промышленность выпускает мембранные фильтры диаметром 35 мм. Они представляют собой диски — разного диаметра толщиной 0,1−0,5 мм. В зависимости от размеров пор они обозначаются номерами от 1 до 5.

Во Франции и США фирма «Миллипор» выпускает фильтры с размером пор от 0,01 до 14 мкм.

В последнее время получили распространение мембранные фильтры фабрики «Синпор» ЧССР.

Мембранные фильтры задерживают микроорганизмы почти исключительно благодаря малым размерам своих пор. Адсорбция здесь играет незначительную роль. Через эти фильтры пропускают небольшие объемы жидкости, так как при фильтровании больших объемов происходит закупорка пор и оно затрудняется. Кроме того, при длительном фильтровании возможно прорастание микроорганизмов внутри пор и попадание их в фильтрат. Мембранные фильтры, имеющие диаметр пор 0,1 мм или меньше, называют ультрафильтратами. Их используют для фильтрации вирусов и высокомолекулярных белков.

Асбестовые фильтры известны под названием фильтров Зейтца. Их изготавливают из смеси асбеста с целлюлозой в виде больших плотных (4−6 мм толщиной) листов, которые затем разрезают на диски или квадраты разной величины. Верхняя поверхность пластин флокулирована. Плотность фильтров тем выше (т. е. меньше пористость), чем больше в них асбеста. На пористость фильтров указывают обозначения, имеющиеся на пластинах: индекс ЕК соответствует диаметру пор 1,5−1,8 мкм; EKS — 1,2−1,5; EKS-l — 1−1,2; ЕКП 0,8−1 мкм. Кроме того, в СССР выпускаются асбестовые фильтры, обозначаемые марками Ф2 и СФ. Стерилизующими являются пластины СФ-3 и СФ-4.

Асбестовые фильтры имеют ряд недостатков. Один из основных связан с их химическим составом: при фильтровании из них могут вымываться щелочи, соли щелочных металлов, а иногда и соли железа.

Фильтрат загрязняется нежелательными примесями и приобретает щелочную реакцию. Это затруднение можно преодолеть путем предварительного промывания фильтра последовательно разведенной кислотой и дистиллированной водой или удалением первых порций фильтрата.

Другой существенный недостаток фильтров Зейтца состоит в том, что асбест, будучи отрицательно заряженным, может адсорбировать значителъные количества различных веществ из фильтруемой жидкости.

И, наконец, асбестовые фильтры нередко загрязняют фильтрат волокнами. Асбестовые пластины относительно, мягкие, они легко искривляются и разрываются. Помятые фильтры, а также пластики с надломами и трещинами для работы непригодны.

Фарфоровые фильтры были впервые предложены Пастером и Шамберланом в 1884 году. Впоследствии они получили название «свечи Шамберлана». Их изготавливают из смеси кварцевого песка и каолина, прокалённых на огне. Они имеют форму полого цилиндра, закрытого на одном конце. Верхняя часть цилиндра глазурованна. Особенно часто применяются свечи трех размеров: 10 Х 55, 15 Х 105 и 25 Х 205 мм. Пористость их обозначается буквой L с цифрами от 1 до 13, соответственно увеличению плотности фильтра, т. е. уменьшению диаметра его пор — от 9 до 1,2 мкм. Мелкопористые свечи обозначаются также маркой «В», крупнопористые — маркой «F». Последние используются только для фильтрации воды и отделения мелких микроорганизмов от крупных. Свечи Шамберлана имеют положительный заряд.

Фильтры из инфузорной земли готовят из диатомита или кизельгура, нередко с добавлением асбеста или других материалов. В России выпускается несколько типов таких фильтров под различными названиями. Чаще всего их называют «свечи Беркефельда». Это замкнутые с одного конца цилиндры 5−26 Х 1,5−5 мм, имеющие в верхней части фарфоровую или металлическую головку «Свечи Беркефельда» имеют обозначения W, N, и V, что соответствует диаметрам пор 3 — 4, 5 — 7, 8 — 12 мкм.

Фильтры из стекла. Стерилизующие стеклянные фильтры представляют собой двуслойные диски, изготавливаемые из фрагментов стекла «Пирекс» путем их сплавления. Нижний слой, имеющий пористость в пределах 15−40 мкм, служит подставкой. На ней лежит бактерионепроницаемый верхний слой. Это тонкая мелкопористая пластинка. По пористости такие пластинки разделяются на три типа: Pдиаметр пор меньше 1 мкм, М — от 1 до 1,7 мкм, С — больше 1,7 МКМ. Но, поскольку стеклянные фильтры отличаются нестандартностью пор, в паспорте, прилагаемом к каждому фильтру, обычно указывается средний диаметр пор данного фильтра. Диски впаяныв стеклянные воронки-держатели. Форма их может быть разной. Особенно широкое распространение получили фильтры Нутча и воронки Бюхнера (рис. 35) с диаметром пластин от 30 до 120 мм.

Стеклянные фильтры имеют отрицательный заряд. Но они не столь активно адсорбируют вещества при фильтровании, как асбестовые, и не загрязняют фильтрат, поскольку материал фильтра из них не вымывается. Из-за нестандартности пор фильтры из стекла перед употреблением обязательно должны быть проверены на стерилизующий эффект.

В настоящее время из всех типов бактериальных фильтров для стерилизации наиболее широко применяются мембранные и асбестовые фильтры.

Рисунок 35. Свеча Беркефельда.

Рисунок 36. Стеклянный фильтр (воронка Бюхнера), вмонтированная в колбу Бунзена.

Работа с бактериальными фильтрами включает ряд этапов:

1. Подготовка фильтров. Фильтр должен быть закреплен в держателе, который вставляется в приемник фильтрата. Обычно приемником является колба Бунзена.

Для мембранных фильтров имеются многочисленные держатели. Есть, например, прибор, изготовленный целиком из стекла, в котором в качестве опоры фильтра используется крупнопористый стеклянный диск (рис. 37, А). Чаще применяются металлические и пластмассовые держатели. Все они приспособлены для дисков различного диаметра и рассчитаны на фильтрование разных объемов жидкостей.

Асбестовые фильтры монтируют в металлические основы, которые известны под названием «приборы Зейтца» (рис. 37, Б). Асбестовая пластина крепко зажимается винтами между верхней (цилиндр без дна) и нижней (воронкообразный тубус) частями держателя. Опорой для асбестового диска служит сетка или пористая пластинка из нержавеющей стали. Трубка держателя, по которой стекает фильтрат, через резиновую пробку проходит в колбу Бунзена. Нередко весь этот прибор в собранном виде называют фильтром Зейтца.

Узкие свечи монтируют в стеклянные трубки с помощью резиновой пробки, которую вставляют в колбу Бунзена (рис. 38). Жидкость фильтруется из трубки внутрь свечи. Узкие свечи можно вставлять и непосредственно в резиновую пробку, закрывающую колбу Бунзена (рис. 39). В этом случае фильтрование происходит изнутри наружу.

Широкие свечи соединяют с колбой Бунзена резиновой трубкой (рис. 40). Свечу помещают в сосуд, куда наливают фильтруемую жидкость. Фильтрование при этом идет снаружи, а приемником является внутренняя полость свечи.

Рисунок 37. Приборы для стерилизации фильтрованием: Асо стеклянным держателем; Б — с металлическим держателем.

Рисунок 38. Керамический фильтр, соединенный с колбой Бунзена при помощи наружного стеклянного цилиндра.

Стеклянные фильтры, имеющие форму воронки, вставляют в резиновую пробку колбы Бунзена .

Перед использованием фильтры, их держатели и приемник фильтрата должны быть простерилизованы. А мембранные фильтры стерилпзуют, поместив их в дистиллированную воду, кипячением в течение 30 мин или автоклавированием при 1 атм 15 мин. Сосуд с фильтрами должен быть закрыт ватной пробкой. Иногда мембранные фильтры стерилизуют химическими средствами: окисью этилена в смеси с углекислотой в течение 6 ч или парами формальдегида в течение 24 ч. В последнем случае фильтры помещают в эксикатор с разряженным воздухом, на дно которого наливают 2%-ный раствор формальдегида. Стерилизацию окисью этилена проводят в специальных аппаратах. После химической стерилизации фильтры проветривают в стерильных условиях не менее 5 ч.

Металлические и стеклянные держатели мембранных фильтров заворачивают в бумагу вместе с резиновой пробкой и автоклавируют при 1 атм 20−30 мин. Способ и режим стерилизации пластмассовых держателей определяется их термостойкостью. Стерилизация мембранных фильтров вместе с держателем не рекомендуется, так как это может привести к повреждению фильтра. Колбу Бунзена стерилизуют горячим воздухом или в автоклаве при 1 атм 20−30 мин. Предварительно горлышко колбы Бунзена закрывают ватной пробкой, а в отводную трубку, которая в дальнейшем присоединяется к вакуумному насосу, вставляют ватный тампон. Весь прибор собирают непосредственно перед работой. Мембранные фильтры закладывают в держатель в стерильных условиях.

Рис 39. Керамический фильтр, вмонтированный в колбу Бунзена с помощью резиновой пробки.

Рисунок 40. Керамический фильтр, соединенный с колбой Бунзена резиновой трубкой; 1 — фильтруемая жидкость, 2 — фильтр.

Фильтры Зейтца стерилизуют в автоклаве при 1−1,5 атм 20 мин или горячим воздухом при 160 °C в течение 1 ч в собранном виде, то есть вместе с асбестовыми пластинками. Не рекомендуется перед стерилизацией туго завинчивать винты держателя. Их подтягивают сразу после стерилизации.

Свечи чаще всего стерилизуют в автоклаве при 0,5−1 атм в течение 15 мин либо вместе с приемником, либо отдельно. В том случае, если свечи не соединены с резиновыми деталями, их можно стерилизовать горячим воздухом. Для сохранения стерильности свечи защищают от соприкосновения с воздухом тем или иным способом. Последнее зависит от того, как будет монтироваться прибор и в каком направлении пойдет фильтрование.

Стеклянные фильтры, вставленные в резиновые пробки, стерилизуют в автоклаве при 1 атм в течение 30 мин вместе с колбой-приемником или отдельно. В первом случае на воронку фильтра, закрытую ватной пробкой, надевают бумажный колпачок, во втором — фильтр с пробкой заворачивают в пергамент или алюминиевую фольгу. Стеклянные фильтры, не соединенные с резиновой пробкой, можно стерилизовать горячим воздухом.

2. Фильтрование. Через бактериальные фильтры жидкости проходят медленно, а длительное фильтрование нежелательно, поскольку при этом, как уже отмечалось, возможно прорастание микроорганизмов в порах фильтров и загрязнение ими фильтрата. Поэтому обычно фильтрование ускоряют путем создания на фильтре перепада давления, достигаемого либо приложением повышенного давления к находящейся над фильтром жидкости, либо откачиванием воздуха с помощью вакуумного насоса, присоединенного к приемнику фильтрата. Чаще применяют откачивание воздуха. При этом происходит легкое разбухание клеток, чем облегчается их задержка на фильтре. Но в то же время в условиях вакуума возможно вспенивание фильтрата, содержащего белок, поэтому фильтрация под давлением, исключающая это явление, считается более благоприятной, хотя, вероятно, и менее удобной в техническом отношении. Не исключено, что при сильном положительном давлении бактериальная клетка сжимается и может проходить через фильтр. Слишком большое разрежение и высокое давление ускоряют закупорку пор.

Рисунок 40. Прибор для фильтрования под вакуумом в собранном виде: А — держатель с фильтром; Б — приемник фильтрата; В — предохранительная склянка; Г — водоструйный насос; 1 — свеча; 2 — стеклянный сосуд; 3 — трубка из толстой резины; 4- резиновая пробка; 5 — ватный тампон; 6 — вакуумный насос Фильтрование под вакуумом осуществляют следующим образом. Непосредственно перед работой ватную пробку колбы Бунзена, если она стерилизовалась отдельно, быстро заменяют держателем с фильтром, а отводной конец колбы соединяют с предохранительной склянкой, находящейся перед водоструйным насосом (рис. 41). Тампон из отводного конца не вынимают, чтобы сохранить стерильность приемника. По окончании фильтрования насос выключают постепенно, так как при резком изменении давления вода из крана может быстро заполнить предохранительную колбу и попасть в фильтрат. Профильтрованные жидкости разливают в стерильных условиях в заранее простерилизованную посуду. Так же, как и при термической стерилизации, их выдерживают 2−3 суток при 30 °C и, если в них появится рост микроорганизмов, готовят вновь.

Важно помнить, что состав жидкостей, прошедших через бактериальные фильтры, может меняться вследствие вымывания из фильтров или, напротив, адсорбции на них ряда веществ, и фильтрат (среда) станет непригодным для культивирования данных микроорганизмов. Из асбестовых фильтров, как уже отмечалось, могут вымываться щелочи и различные соли. Адсорбируются же на фильтрах некоторые жирные кислоты, белки, полисахариды. Возможность и степень адсорбции веществ на фильтрах определяются химической природой фильтра, размерами его пор, продолжительностью фильтрования. Большую поглотительную ёмкость (до 30 и более процентов) имеют керамические (свечи) и асбестовые фильтры. Это важно учитывать при работе с малыми объёмами жидкостей.

Эффективность фильтрования определяется не только качествами фильтра, но и свойствами фильтруемой жидкости: её вязкостью, pH, температурой и др. Жидкости с низкой вязкостью фильтруются легче, поэтому при возможности вязкие жидкости разводят. Скорость фильтрации возрастает с повышением температуры, так как при этом снижается вязкость. Поэтому многие жидкости фильтруют подогретыми. Летучие жидкости нельзя фильтровать с помощью вакуума. Щелочная реакция среды (рH 7,2 — 8,0) и наличие капиллярно — активных веществ (бульон) облегчают фильтрацию. Некоторые вещества, понижающие поверхностное натяжение, например, сыворотка, желчь, мыла, кислоты, способствуют проникновению бактерий через материалы, содержащие кремний. Трудно фильтруются гетерогенные системы, поэтому предварительно их осветляют пропусканием через свечи Шамберлана L1 или L2 через крупнопористые мембранные или даже бумажные фильтры.

3. Очистка бактериальных фильтров. Мембранные и асбестовые фильтры используются только один раз; после употребления их выбрасывают. Если стерилизации подвергалась жидкость, содержащая патогенные микроорганизмы, то фильтры, прежде чем выбросить, стерилизуют или выдерживают в дезинфицирующем растворе. Свечи Шамберлана и Беркефелъда, а также стеклянные фильтры можно использовать повторно. При употреблении они загрязняются не только бактериями, но и органическими веществами. Для очистки фильтров применяют различные способы.

Фарфоровые свечи (Шамберлана) сначала промывают дистилированной водой, пропуская ее через стенки фильтра в направлении, обратном фильтрованию. Затем фильтры заливают на ночь концентрированной серной кислотой, содержащей небольшие количества нитрата натрия и хлорнокислого калия. На следующий день их многократно промывают дистиллированной водой, а затем кипятят в воде для удаления растворенного воздуха. Свечи Шамберлана можно обрабатывать и другим способом. Их промывают в течение 10 ч в 3%-ном растворе фенола, затем в воде и 2%-ной жавелевой воде (КСlО) в течение 2 ч и, наконец, моют щеткой в 10%-ной соляной кислоте также 2 ч. От кислоты фильтры отмывают в проточной воде в течение суток до исчезновения реакции на хлор, затем оставляют на ночь в дистиллированной воде. Третий вариант очистки заключается в следующем. Свечи сначала промывают теплой водой для удаления осадка и протирают мягкой щеткой, затем моют 2−3%-ным раствором формалина и, наконец, 15% -ным раствором хлорной извести. Потом свечи выдерживают 30 мин в растворе соляной кислоты (1:10), кипятят в водопроводной воде 1 ч и отмывают водой. Свечи Беркефельда мягче фарфоровых, поэтому обработку щеткой они не выдерживают. При их чистке следует также избегать кислот. Они хорошо отмываются растворами гипохлорита. Промытые тем или иным способом свечи должны быть выcyшены. Хранить их во влажном состоянии нельзя, так как при этом в их порах могут размножиться микроорганизмы, то есть появляется опасность загрязнения фильтра биомассой. Очищать свечи от частиц органического происхождения можно также прокаливанием их в муфельной печи.

Стеклянные фильтры обычно промывают раствором соляной кислоты или горячей концентрированной серной кислотой (80−100°С) при добавлении небольшого количества нитрата калия или смеси нитрата натрия и перхлората натрия и азотной кислоты. Фильтры рекомендуется держать в этой смеси в течение ночи. Затем их промывают дистиллированной водой до исчезновения ионов .

Бактериальные фильтры нельзя мыть смесью двухромовокислого калия с серной кислотой, так как хромат адсорбируется на фильтре, что может повредить фильтр и испортить фильтрат. Свечи не следует также обрабатывать, концентрированными растворами щелочей, поскольку это моет увеличить размеры их пор.