Клеточный состав пуповинной крови доношенных новорожденных

Наличие экстрагенитальных игинекологических заболеваний у женщин, их обострение во время беременности и родов оказьшают существенное влияние на состояние и развитие, как плода, так и новорожденного ребенка. Воздействие вредных факторов в ранние сроки беременности часто сопровождается нарушением закладки И: развития органов и систем плода [Гармашева H. JL и др., 1978; Кошелева H-F., 1979]. Патологические состояния, возникшие в более поздние сроки беременности, проявляются замедлением развития органов и систем плода, гипотрофией, задержкой, внутриутробного развития [Дементьева Г. М., 1984; Демин В. Ф., 1988]. Как правило, в основе всех патологических состояний плода при осложненном течении беременности лежат изменения в плаценте и фетоплацентарная недостаточность, приводящие к нарушению газообмена плода и его гипоксии. Таким образом, патологическое течение беременности приводит к дисбалансу и дисфункции практически всех систем организма плода и новорожденного. Кроветворная ткань представляющая собой динамическую, постоянно обновляющуюся систему, обладающую высокой функциональной активностью, является наиболее чувствительной к. воздействию неблагоприятных факторов. Изменения, возникающие в кровш в результате воздействия неблагоприятных факторов, могут быть визуализированы либо в форме изменения количественного состава, либо в форме цитологических изменений морфологии клеток, и/или сдвигами их распределения.

Таким образом, клеточный состав пуповинной крови, полностью отражающий состояние гемопоэза плода к концу гестационного периода, в значительной степени зависит как от особенностей течения беременности и родов, так и от перенесенных заболеваний. '.

Несмотря на многочисленные исследования клеточного состава пуповинной крови (Monroe B.L., 1979; Stokman Р.А., 1992; Alacron Р.А., 1992; Торубарова Н. А. 1993; Cairo M.S., 2005; Aravita S., 2005) многое остается неясным. До сих пор отсутствуют референтные значения клеточного состава пуповинной крови доношенных новорожденных, что обусловлено широким диапазоном факторов, определяющих особенности гемопоэза плода и клеточный состав пуповинной крови и значительно затрудняющих-формирование групп с целью их получения.

Наличие гемопоэтических стволовых клеток в пуповинной крови человека в количестве, сравнимом с содержанием в костном мозге, стало основанием использования пуповинной: крови: в качестве альтернативного источника гемопоэтических стволовых клеток для трансплантациипри многих гематологических, онкологических, иммунологических и наследственных заболеваниях^ (Armitage J, 1994; Bensinger W. et al., 1995; Schmitz N. Et al., 1995; Румянцев А. Г., 1996, Thomas E.D., 2000; Rubinstein P., 1999; Gluckman E., 2004): Разработка методовтрансплантации: гемопоэтических клеток-предшественников > привела к повышению в них потребности. Широкомасштабный: сбор пуповинной крови позволяет быстро формировать банк данных дляподбора неродственного донора. Ряд ведущих зарубежных банков пуповинной^ крови объединенв систему NetCord, одним из результатов деятельности? которой стала разработка и публикация нормативных требований ко всем этапам^ технологического процесса получения и обработки образцов пуповинной крови, предшествующих криоконсервации. Появившиеся в последнее время сообщения о различии клеточного состава: пуповинной кровив зависимости от вида родоразрешения, от пола и массы тела новорожденного, а также от сроков, прошедших, после родов и сбора пуповинной крови до начала процесса обработки- (Cairo M.S., 2005; Araviita S., 2005) демонстрируют, что остаются: неясными множество факторов, влияющих на клеточный состав пуповиннойкрови и, как следствие, на эффективность заготовки трансплантационного материала. Скрининг состава и характеристик клеток пуповинной? крови, проводимый при: помощи автоматических счетчиковклеток крови: при выполнении технологических элементовбанка пуповинной крови не вполне удовлетворителен, поскольку пуповинная кровь имеет некоторые физиологические отличия от периферической крови взрослого человека (Solves Р., 2005; Bradley М.В., 2005). В связи с этим целью настоящего исследования является создание референтных значений клеточного состава пуповинной крови доношенных новорожденных с помощью аппаратных и светооптических методов исследования и изучение влияния на эти показатели течения и сроков беременности^ родов, состояний перинатального риска.

Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать клеточный состав пуповинной крови доношенных новорожденных с помощью автоматического гематологического анализатора АВХ Pentra 60 С+.

2. Провести анализ клеточного состава пуповинной крови в г зависимости от течения и сроков беременности и родов, состояния, физического развития и пола новорожденного. .

3. Изучить факторы, влияющие на" количество, нормобластов в: пуповинной крови доношенных новорожденных.

4. Оценить степень различий в подсчете субпопуляций лейкоцитов пуповинной крови при помощи автоматического гематологического анализатора АВХ Pentra 60 G+ и светооптической микроскопии в окраске по Паппенгейму-Крюкову.

5: Оценить влияние количества нормобластов на — разницу показателей субпопуляций лейкоцитов пуповинной крови, определяемых при подсчете с помощью автоматического гематологического анализатора АВХ Pentra 60 С+ и светооптической микроскопии в окраске по Паппенгейму-Крюкову.

В работе получены данные, содержащие научную новизну. Подробно охарактеризован клеточный состав пуповинной крови доношенных новорожденных. Показано изменение клеточного состава пуповинной крови в зависимости от течения и сроков беременности и родов, состояния, физического развития и пола новорожденного.

Установлено, что наличие инфекционных заболеваний у матери во время беременности приводит к снижению концентрации гемоглобина и гематокрита, а наличие патологии почек у матери приводит к повышению концентрации гемоглобина в пуповинной крови. При ожирении у матери во время беременности выявлено снижение количества тромбоцитов.

Показано увеличение количества лейкоцитов в пуповинной крови при увеличении длительности безводного периода и периода изгнания плода, внутриутробной гипоксии, обвитии пуповины новорожденных, увеличении массы тела ребенка при рождении.

Впервые показана зависимость клеточного состава пуповинной крови от пола ребенка. Установлено, что у девочек уровень лейкоцитов выше, чем у мальчиков. При этом у девочек в процентном соотношении больше нейтрофилов, а лимфоцитов, моноцитов и эозинофилов меньше. В абсолютных количествах у девочек больше нейтрофилов, меньше эозинофилов. Количество эритроцитов, содержание гемоглобина и уровень гематокрита у девочек меньше, чем у мальчиков, при этом различий в эритроцитарных индексах (MGV, МСН, МСНС, RDW) в зависимости от пола не обнаружено. Количество-тромбоцитов у девочек больше, чем у мальчиков, а средний размер тромбоцитов различий не имеет.

Научно-практическое значение имеет тот факт, что количество нормобластов увеличивается при внутриутробной гипоксии, но не увеличивается при острой гипоксии в родах.

Обвитие пуповины при рождении приводит к повышению абсолютного количества лейкоцитов за счет увеличения количества нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов. При этом повышается количество эритроцитов, уровень гематокрита.

Показано, что с увеличением веса ребенка при рождении увеличивается количество лейкоцитов. Также увеличивается абсолютное количество нейтрофилов и эозинофилов, а количество моноцитов уменьшается.

При определении количества нейтрофилов при помощи микроскопии был получен достоверно больший уровень, чем при определении при помощи автоматического счетчика. Уровень лимфоцитов, моноцитовэозинофилови базофилов, наоборот оказался выше при определении с помощью автоматического счетчика. Полученные закономерности не зависели от сроков гестации, количества лейкоцитов, степени разведения образца пуповинной кровиантикоагулянтом, времени, прошедшего после родов до начала сбора и обработки пуповинной крови.

Практическое значение работы заключается в установлении референтных значений при проведении анализа пуповинной крови доношенных новорожденных, как при использовании автоматического анализатора клеток крови, так и при подсчете клеток крови при светооптической микроскопии. Полученные данные имеют важное практическое значение при проведении технологических расчетов в повседневной работе банков стволовых клеток.

Результаты исследования внедрены в работу ГУЗ «Банк стволовых клеток департамента здравоохранения г. Москвы».

Результаты работы были доложены на X Съезде педиатров России (февраль 2006), и Российском Съезде гематологов и трансфузиологов (апрель 2006).

Диссертация апробирована на совместной научно-практической конференции клинических и лабораторных отделов ФГУ НИИ детской гематологии Росздрава и ГУЗ «Банк стволовых клеток департамента здравоохранения г. Москвы».

Работа выполнена в ФГУ Федеральном научно-клиническом центре детской гематоогии, онкологии и иммунологии Росздрава (директор ФГУ ФНКЦ ДГОИ — член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор А.Г.Румянцев) и лаборатории контроля количества и жизнеспособности стволовых клеток (зав. — к.м.н. С.А.Румянцев) ГУЗ Банк стволовых клеток департамента здравоохранения г. Москвы (директор — доктор медицинских наук, профессор О.А.Майорова). г 8 г.

I- ' is.

I- •.

выводы.

1. Установлены референтные значения клеточного состава пуповинной крови доношенных новорожденных. При использовании автоматического гематологического анализатора АВХ Pentra 60 С+ количество лейкоцитов составило 17,24±0,16×109/л, абсолютное количество нейтрофилов — 8,41+0,10×109/л, лимфоцитов — 5,54±0,06×109/л, моноцитов — 2,42±0,03×109/л, эозинофилов — 0,64±0,16×109/л, базофилов — 0,23±0,01×109/л. Количество эритроцитов составило 4,40±0,01×1012/л, концентрация гемоглобина -157,4±0,46 г/л, количество тромбоцитов — 307,54±1,97×109/л.

2. Проведена оценка степени различий в подсчете субпопуляций лейкоцитов пуповинной крови доношенных новорожденных с помощью аппаратных и светооптических методов исследования. При определении количества нейтрофилов при помощи микроскопии был получен достоверно больший уровень (57,48±0,47%), чем при определении при помощи автоматического счетчика (47,48±0,44%- /><0,0001). Уровень лимфоцитов (32,76±0,36%- 28,66±0,43%- /"0,0001), моноцитов (14,64±0,24%- 9,95±0,19%- /><0,0001), эозинофилов (3,86±0,1%- 3,28±0,13%- /КО, 0001) и базофилов (1,25±0,04%- 0,61 ±0,03%- р<0,0001), наоборот оказался выше при определении с помощью автоматического счетчика. Полученные закономерности не зависели от сроков гестации, количества лейкоцитов, степени разведения образца пуповинной крови антикоагулянтом, времени, прошедшего после родов до начала сбора и обработки пуповинной крови.

3. Установлено, что на состав пуповинной крови не оказывают влияние: анемия матери во время беременности, видимо, вследствие адекватной терапии препаратами железаугроза прерывания беременностиколичество околоплодных водвнутриутробная задержка развития плода и энцефалопатия новорожденного.

4. Повышение гемоглобина выявлено при: наличии патологии почек у матери (/>=0,0112) — обвитии пуповины — 162,2 ± 1,7 г/л против 156,1 ± 0,9 г/л (/>=0,001). При обвитии пуповины повышается количество эритроцитов 4,55 ± 0,05×10 /л против 4,35 ± 0,02×1012/л (/><0,0001). Повышение гематокрита отмечается при обвитии пуповины -32,98 ± 0,46% против 31,86 ± 0,24% (р=0,027) — увеличении длительности периода изгнания (р=0,009) — с увеличением массы тела новорожденного (от 28,48±2,47% при массе тела <2,5 кг до 33,86±0,39% при массе тела >4 кг- /КО, 0001). Показано, что с увеличением срока гестации снижается МСН (р=0,028) и MPV (р=0,032). С увеличением массы тела ребенка отмечено уменьшение МСНС (р<0,0001) и увеличение MPV (р=0,025).

5. Наличие инфекционных заболеваний у матери во время беременности приводит к снижению концентрации гемоглобина (/>=0.02) и гематокрита (/><0,0001).

6. Ожирение у матери во время беременности приводит к снижению количества тромбоцитов (р=0,012) в пуповинной крови. Также выявлена зависимость количества тромбоцитов от пола ребенка. Установлено, что количество тромбоцитов у девочек (314,87±2,98 хЮ9/ л) больше, чем у мальчиков (300,72±2,62 хЮ9/ лр<0,0001). Средний размер тромбоцитов не имеет различий.

7. Повышение количества лейкоцитов отмечается при: увеличении длительности безводного периода от 16,75±0,34×109/л при длительности безводного периода менее 6 часов, до 17,23±0,51×109/л — от 6 до 10 часов и 18,45±0,77×109/л при длительности безводного периода более 10 часов (р<0,089) — увеличении длительности периода изгнания плода: 15,23±0,72×109/л — менее 15 мин.- 16,91±0,31×109/л — от 15 до 30 мин.- 18,29±0,6×109/л — более 30 мин. (р=0,014) — внутриутробной гипоксии плода — 18,84 ± 0,92×109/л против 16,72 ± 0,26×109/л (р=0,008) — обвитии пуповины 18,69 ± 0,61×109/л против 16,45 ± 0,27×109/л (р<0,0001) — с увеличением массы тела ребенка при рождении — от 15,52±0,59 хЮ9/ л в группе с массой тела 2,5−3 кг до 17,51±0,44 хЮ9/ л в группе с массой тела >4 кг (р=0,01).

8. Выявлена зависимость показателей пуповинной крови от пола новорожденного. Показано, что у девочек уровень лейкоцитов выше 17,74±0,24 хЮ9/ л, чем у мальчиков 16,8±0,23 хЮ9/ л (р=0,005). При этом, у девочек в процентном соотношении больше нейтрофилов, а лимфоцитов, моноцитов и эозинофилов меньше. В абсолютных количествах у девочек больше нейтрофилов, а меньше эозинофилов.

9. Уровень эритроцитов (4,33±0,02 хЮ12/ л) и гемоглобина (155,1±0,70 г/л) у девочек меньше, чем у мальчиков (4,46±0,02 хЮ12/ л- 159,5±0,60 г/лр<0,0001). Уровень гематокрита у девочек (31,79±0,2%) также меньше, чем у мальчиков (32,76±0,19%- /?<0,0001). Различий в эритроцитарных индексах (MCV, МСН, МСНС, RDW) в зависимости от пола не обнаружено.

10. Внутриутробная гипоксия приводит к увеличению количества нормобластов -11,94 ± 3,11: 100 лейкоцитов против 5,42 ± 0,53: 100 лейкоцитов (р<0,0001). Увеличения количества нормобластов при острой гипоксии в родах не выявлено 6,21 ± 0,66: 100 лейкоцитов против 5,32 ± 1,25: 100 лейкоцитов (р=0,55).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Полученные значения показателей клеточного состава пуповинной крови рекомендуется использовать в качестве референтных значений при проведении анализа крови у новорожденных первых суток жизни, как при использовании автоматического анализатора клеток крови, так и при подсчете клеток крови при светооптической микроскопии.

2. Данные о расхождении результатов подсчета клеток пуповинной крови при помощи автоматического анализатора клеток крови и проведении светооптической микроскопии рекомендуется использовать при технологических расчетах в работе банков пуповинной крови.