Разработка хромогенных питательных сред для выделения и ускоренной идентификации условно патогенных энтеробактерий

На протяжении всей истории становления и развития медицинской микробиологии представители семейства Enterobacteriaceae постоянно привлекают внимание учёных и специалистов практической бактериологии. Во многом интерес к ним связан с тем, что их выделение составляет значительную часть регулярных исследований бактериологов, решающих задачи клинической и санитарной микробиологии (Голубева И.В. с соавт., 1985; Покровский В. И., Поздеев O.K., 1999; Шендеров Б. А., 2005; Поздеев O.K., Фёдоров Р. В., 2007; Батуро А. П., 2010.). В последние годы специалисты также отмечают, что нарушение микробной экологии желудочно-кишечного и вагинального трактов (дисбиоз) с повышением численности условно патогенных энтеробактерий (УПЭ) часто является предрасполагающим фактором возникновения и развития многих неиифекционных соматических заболеваний (Леонова А. Ю., Романенко Э. Е., Батуро А. П., 2007; Шендеров Б. А., 2008, 2010). Вследствие высокой частоты поражений человека и разнообразия* этиологической структуры возбудители семейства Enterobacteriaceae приобрели существенное значение. Так, достоверно расширился видовой спектр энтеробактерий, подлежащих обязательному изучению. И в первую очередь это относится к УПЭ, которых долгое время рассматривали как возбудителей оппортунистических инфекций. В настоящее время многие виды из них считают вполне сложившимися патогенами (Ющук Н.Д. с соавт., 1990; Красноголовец В. Н., Киселёва Б. С., 1996; Покровский В. И., 1996; Учайкин В. Ф., 2001; Меньшиков В. В., 2003.).

При различных состояниях, сопровождающихся ослаблением резистентности организма человека, УПЭ, адаптированные к обитанию в нестерильных полостях организма и входящие в состав нормальной микрофлоры, могут проникать в различные органы и ткани и вызывать заболевания (Иосебашвили Т., Чиквиладзе Д., 2000; Брусина Е. Б., 2001;

Бондаренко A.Jl. с соавт., 2001; Shenderov В.А., 2007). При этом следует отметить, что УПЭ регистрируются большей частью как возбудители внутрибольничных инфекций (Ковалева Е.П., Сёмина М. А., 2002; Коршунова Г. С., 2002; Меркушев Н. В., 2003 Султанов 3.3. с соавт., 2005.). В число основных возбудителей нозокомиальных инфекций вошли следующие представители семейства Enterobacteriaceae: кишечная палочка, клебсиеллы, цитробактер, энтеробактеры, серрации, протеи, которые вызывают различные гнойно-септические инфекции, в т. ч. до 50% госпитальных пневмоний, до 30% раневых инфекций и т. д., при этом нередко с тяжелой клинической^картиной заболеваниями с летальным исходом (клебсиеллезный сепсис). (Поздеев O.K., Фёдоров Р. В., 2007. Сбойчаков В. Б., 2007; Ольховик О. П., 2009.).

В связи с тем, что в ряду возбудителей внутрибольничных инфекций значительное место занимают клебсиеллы, идентификацияих при санитарно-микробиологическом обследовании лечебных учреждений также играет важную роль (Красноголовец В.Н., Киселёва Б. С., 1996; Сиволодский Е. П., 1996.). Однако предложенные схемы для идентификации потенциально-патогенных для человека клебсиелл (К. pneumoniae, К. oxytoca) громоздки и включают в себя постановку целого ряда тестов: на сероводород («-»), орнитиндекарбоксилазу («-»), подвижность («-»), фенилаланиндезаминазу («-»), мочевину («+»), цитрат Симмонса («+»), малонат («+»), инозит («+»), лизиндекарбоксилазу («+») (Красноголовец В.Н., Киселёва Б. С., 1996.). Эти исследования требуют значительного времени и материальных затрат. В то же время не вызывает сомнения, что при проведении микробиологических исследований важным условием является быстрота получения результатов, которая способствует ранней диагностике, своевременному проведению терапевтических и противоэпидемических мероприятий.

Установлено, что для госпитальных штаммов характерна довольно высокая-устойчивость к антибиотикам и дезинфектантам (Favero N.S., Bond W.W., 1991. Меджидов М. М., 2008; Омарова С. М. с соавт., 2008; Горелова В. Г. с соавт., 2008.). Это затрудняет их элиминацию, в связи, с чем внутрибольничные инфекции являются не только клинической-, но и значительной эпидемиологической проблемой (Агапов B.C., с соавт., 2002; Онищенко Г. Г., 2002; 2003.).

Среди внебольничных инфекций условно патогенные энтеробактерии также являются наиболее частой причиной острых кишечных инфекций (ОКИ), проблема которых продолжает оставаться чрезвычайно актуальной в современной медицине (Малеев В.В. с соавт., 2006; Идармачев A.M., 2006; Султанов 3.3., Степанова Э. Д., 2006; Омариева Э. Я., 2006.). Источником заражения ОКИ являются инфицированные объекты внешней средыпитьевая вода, воды открытых водоёмов, предметы обихода. В связи с тем, что ОКИ являются заболеваниями с фекально-оральным путём, передачи инфекции, для предупреждения заболевания важное значение имеет регулярный санитарно-эпидемиологический мониторинг за объектами внешней среды, включающий в себя микробиологические исследования окружающей среды. Санитарно-эпидемиологический мониторинг играет решающую роль также в борьбе с внутрибольничными инфекциями и способствует их предупреждению.

Условно патогенные энтеробактерии, обитая в нестерильных полостях организма человека, могут подолгу жить и вне организма человека или теплокровных животных, поэтому в санитарной микробиологии их используют в качестве санитарно-показательных микроорганизмов. Так, количественное содержание общих колиформных бактерий (ОКБ) позволяет характеризовать общую микробную обсемененность объектов окружающей среды, в т. ч. продуктов питания, и свежее их фекальное загрязнение по наличию E.coli. Общее число проводимых в Российской Федерации микробиологических и санитарно-гигиенических анализов с целью обнаружения представителей данной группы грамотрицательных бактерий в биологическом материале чрезвычайно велико, что приводит к огромным трудовым и экономическим затратам.

Эти затраты, прежде всего, обусловлены тем, что регламентируемые действующими нормативными документами схемы идентификации клинически и санитарно — гигиенически значимых УПЭ, как уже отмечено ранее, являются очень трудоёмкими, требующими значительных затрат времени из-за схожести биологических и биохимических характеристик этих грамотрицательных бактерий (расщепление лактозы). Дифференцировать их друг от друга со среды Эндо (или Левина) весьма затруднительно. В случае присутствия в микробной ассоциации протея выделение чистой культуры становится невозможным из-за роения протея на этих средах. Общие затраты времени на проведение исследований для идентификации общих колиформных бактерий, в том числе и E. coli составляют от 2 до 5 сут.

В настоящее время в мировой бактериологической практике наряду с классическими питательными средами для выделения и дифференциации микроорганизмов различных таксономических групп, широкое распространение получили хромогенные питательные среды (ХПС) различных зарубежных фирм (Oxoid, Merck, bio Merieux, HiMedia, Sigma, Fluka).

Принцип действия хромогенных питательных сред определяется взаимодействием высокоспецифических ферментов бактерий с хромогенным субстратом, введённым в состав среды и играющим в ней роль индикатора. В результате этого взаимодействия хромогенный субстрат расщепляется под действием фермента искомого микроорганизма, выделяя в среду хромофор, окрашивающий колонию. Микроорганизмы, не продуцирующие высокоспецифический фермент, остаются неокрашенными, поскольку хромогенный индикатор не расщепился.

Таким образом, идентификация возбудителя с помощью хромогенных питательных сред происходит одновременно с его выделением и не требует постановки дополнительных тестов, что значительно сокращает время и материальные затраты на исследование.

Хромогенные сухие питательные среды для ускоренной идентификации микроорганизмов за рубежом выпускают ииспользуют со второй половины прошлого века. В России до настоящего времени подобные диагностические препараты не производили и поэтому разработка их является актуальной для практической бактериологии.

Цель исследований: разработка и экспериментально-клиническое изучение отечественных хромогенных питательных сред для выделения и ускоренной идентификации условно патогенных энтеробактерий.

Основные задачи исследований:

1. Разработать хромогенную питательную среду Колиформ хром агар для одноэтапного выделения, подсчёта и прямой идентификации колиформных бактерий;

2. Разработать хромогенную питательную среду Е. coli хром агар для выделения, подсчёта и прямой идентификации Е. coli;

3. Разработать хромогенную селективную питательную среду ДагХром агар для выделения и одновременной идентификации кишечной палочки и других колиформных бактерий в воде и пищевых продуктах;

4. Разработать хромогенную питательную среду Е. со/г-колиформ-Proteus хром агар для выделения и прямой идентификации одновременно Е. coli, колиформных бактерий и протеев при клинических исследованиях;

5. Разработать хромогенную питательную среду для выявления и идентификации клебсиелл — Клебсиелла хром агар;

6. Оценить физико-химические и биологические показатели качества созданных сред;

7. Оценить диагностическую ценность разработанных ХПС;

8. Разработать алгоритм выделения и ускоренной идентификации клинически значимых и санитарно-показательных УПЭ с использованием ХПС.

Научная новизна.

1. Впервые разработаны и научно обоснованы оригинальные качественные и количественные составы отечественных хромогенных сухих питательных сред для выделения и ускоренной идентификации УПЭ: Колиформ хром агар, Е. coli хром агар, ДагХром агар, Е. со//-колиформ-Proteus хром агар, Клебсиелла хром агар.

2. Показаны чёткие дифференцирующие свойства, высокая чувствительность и селективность созданных ХПС, что позволяет ускорить идентификацию УПЭ.

3. Предложен алгоритм выделения и ускоренной идентификации клинически значимых и санитарно-показательных УПЭ с использованием разработанных ХПС.

4. Основные положения научной новизны отражены в патенте на изобретение «Хромогенная селективная питательная среда ДагХром агар для выделения и идентификации кишечной палочки и других колиформных бактерий» (Патент РФ № 2 386 696 от 20.04.2010 г.), а также положительном решении о выдаче патента на «Хромогенную питательную среду для выявления и идентификации клебсиелл» по заявке № 2 008 140 829/10(52 823 от 08.12.2010 г.

Практическая значимость.

Разработаны и апробированы ХПС для выделения и ускоренной идентификации УПЭ. Подготовлена нормативная документация на ХПС. Способ усовершенствования микробиологической диагностики инфекций, вызванных УПЭ, внедрён в практику Республиканского Медицинского Центра г. Махачкала (акт внедрения № 10−326 от 17.09.2010 г.) и в работу лаборатории клинической микробиологии ООО НПП «Питательные среды» (акт внедрения № 10−325 от 17.09.2010 г.). Использование в широкой практике здравоохранения разработанных сред будет способствовать более ранней диагностике заболеваний, вызванных оппортунистическими энтеробактериями, и проведению адекватных терапевтических и профилактических мероприятий.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. На основании экспериментально выбранных качественных и количественных составов впервые разработаны оригинальные отечественные ХПС для выделения и ускоренной идентификации часто выделяемых УПЭ.

2. Сконструированные хромогенные питательные среды не изменяют биологических свойств выросших на них микроорганизмов.

3. С использованием широкого набора музейных и свежевыделенных микроорганизмов при клинических и санитарных исследованиях выявлена высокая диагностическая ценность разработанных ХПС. Предложен алгоритм выделения и идентификации клинически значимых и санитарно-показательных УПЭ с использованием ХПС.

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации доложены на 1-ой Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии» (г. Пущино, 2007 г.) — на 17-ом Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010 г) — на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вакцинология 2010» (Москва, 2010 г.). Диссертация апробирована на межинститутской конференции филиала ФГУП «Микроген» МЗ и СР РФ в г. Махачкале НПО «Питательные среды» и ДГМА, г. Махачкала, 2010 г.

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 12 публикациях, включая 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, а также представлено в 1 патенте на изобретение и в положительном решении о выдаче патента на изобретение по материалам 2-ой заявки.

выводы.

1. Впервые экспериментально обоснован оригинальный качественный и количественный состав отечественных хромогенных питательных сред, подготовленных для производства в сухой и готовой к применению форме:

— Колиформ хром агар для выделения, подсчёта и ускоренной идентификации общих колиформпых бактерий в объектах окружающей среды;

— E. coli хром агар для выделения, подсчёта и прямой идентификации E. coli;

— ДагХром агар для выделения и идентификации кишечной палочки и других колиформных бактерий в воде и пищевых продуктах;

— E. coli-KonnfyopM-Proteus хром агар для выделения и прямой идентификации одновременно E. coli, колиформных бактерий и протеев;

— Клебсиелла хром агар для выявления и прямой идентификации клебсиелл и E.aerogenes.

2. Установлена зависимость интенсивности роста колиформных бактерий от содержания в среде ростстимулирующих добавок — ЭКД и ПАБК. Оптимальные концентрации указанных ингредиентов позволили увеличить чувствительность среды в отношении роста часто выделяемых УПЭ с 10″ 5 до 10″ 7- 10″ 8.

3. Определены оптимальные количества содержания в средах хромогенных субстратов, обеспечивших визуальную регистрацию ß—галактозидазы колиформных бактерий, ß—глюкуронидазы и триптофоназы E. coli, триптофандезаминазы протеев и 5-аминосалицилатдекарбоксилазы клебсиелл и E.aerogenes.

4. Сконструированные дифференциально-диагностические хромогенные среды характеризовались стабильными биологическими свойствами выделенных культур.

5. Предложен алгоритм выделения и ускоренной идентификации клинически значимых и санитарно-показательных УПЭ с помощью созданных хромогенных питательных сред, позволяющих существенно сократить сроки идентификации возбудителя (с 3−5 суток до 18−36 ч), что значительно упрощает процесс проведения бактериологических исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В настоящее время продолжает оставаться актуальной проблема выявления и идентификация условно патогенных энтеробактерий при инфекционных процессах различной локализации, т.к. частота заболеваний, вызванных УПЭ, неуклонно увеличивается, определяя тем самым значительный интерес исследователей к этим возбудителям. Также с повышением численности УПЭ при дисбиозах, возникают и развиваются неинфекционные соматические заболевания (Шендеров Б.А., 2010).

Среди клинических изолятов энтеробактерий, выделенных при гнойно-септических заболеваниях, авторы отмечают в качестве наиболее частых три вида УПЭ — Е. coli, Klebsiella spp., Proteus spp., на долю которых приходится около 80% от общего количества выделенных возбудителей. Около 20% изолятов составляют представители 23 видов из этих родов: Klebsiella. Proteus, Serratia, Enterobacter, Citrobacter, Yersinia и др. (Сбойчаков B.B., 2007., Поздеев O.K., Фёдоров Р. В., 2007 и др.).

Условно патогенные энтеробактерии играют немаловажную роль также и в санитарной микробиологии, где их используют в качестве санитарно-показательных микроорганизмов, характеризующих санитарно-микробиологическое состояние объектов внешней среды.

В связи со значительной ролью УПЭ в клинической и санитарной микробиологии выделение и ускоренная идентификация этих микроорганизмов имеет существенное значение.

Современные методы лабораторной диагностики УПЭ, регламентируемые действующими Методическими указаниями, представляют собой многоэтапный процесс, требующий значительного времени на исследования в связи с многообразием схожих биохимических реакций и яркой выраженностью родственных связей представителей УПЭ. Несмотря на значительную роль Е. coli в клинической и санитарной микробиологии, до сих пор нет отечественной питательной среды для прямой идентификации этого микроорганизма среди других УПЭ. Общие затраты времени для родовой и видовой идентификации УПЭ составляют несколько суток после выделения микроба.

Известно, что ранняя бактериологическая диагностика заболеваний — залог успешной терапии, а также своевременных противоэпидемических мероприятий, снижающих риск возникновения и распространения инфекций. В связи с этим разработка способов ускоренной идентификации УПЭнесомненно актуальная задача отечественного здравоохранения.

За рубежом со второй половины прошлого века эта задача решена с помощью хромогенных питательных сред, позволяющих на основе выявления высокоспецифических ферментов бактерий осуществить идентификацию возбудителя одновременно с его выделением, т. е в один этап. Хотя спрос практического здравоохранения на подобные питательные среды огромен, в России они до настоящего времени не производятся.

Поэтому задача обеспечения отечественного здравоохранения хромогенными питательными средами для выделения и ускоренной идентификации клинически значимымых и санитарно-показательнымых условно патогенных энтеробактерий является актуальной, требует изучения и решения, что явилось основанием выбора темы диссертационных исследований.

Первый этап исследования был посвящен изучению питательных основ и других ингредиентов среды на основании известных питательных потребностей УПЭ. Поэтому при конструировании хромогенных питательных сред для выделения и ускоренной идентификации УПЭ были использованы отечественные рыбные и казеиновые панкреатические гидролизаты, как наиболее часто употребляемые в питательных средах для культивирования широкого спектра микроорганизмов.

В серии экспериментальных исследований было выявлено, что среди бактерий группы кишечной палочки (колиформных бактерий) S. plymuthica 1 является наиболее прихотливым к условиям культивирования микроорганизмом. Так, при одинаковом составе питательных бульонов чувствительность среды в отношении S. plymuthica 1 (Ю" 5) значительно уступала чувствительности среды в отношении других УПЭ (10″ 6).

Исследования стимулирующего эффекта каждого в отдельности ЭКД и ПАБК на рост микроорганизмов, показали повышение чувствительности среды в отношении S. plymuthica 1 с 10″ 5 до 10″ 6, а остальных УПЭ с 10″ 6 до 10″ 7. А совместное внесение в среду указанных ростовых факторов обеспечило повышение чувствительности среды в отношении S. plymuthica 1 до 10″ 7, а чувствительность среды в отношении остальных УПЭ возросла до 10″ 8. Таким образом, внесение в среду одновременно обоих стимуляторов роста позволило достичь более высокую чувствительность разработанной среды Колиформ хром агар в сравнении с традиционной средой Эндо. Это особенно важно при проведении санитарного контроля окружающей среды, когда выявление присутствия в исследуемом материале даже единичных колоний колиформных бактерий является основанием для принятия необходимых санитарных мер.

Показателем свежего фекального загрязнения является присутствие Е. coli в исследуемом материале наряду с другими колиформными бактериями. Использование Колиформ хром агара, принцип действия которого основан на выявлении ß—галактозидазы, продуцируемый всеми колиформными бактериями, не обеспечивает прямую идентификацию Е. coli. Для идентификации Е. coli среди других колиформных бактерий необходима проверка каждой выделенной колонии тестом на индол, что трудоёмко. Кроме того К oxytoca также индол положительна, хотя довольно редко встречается в объектах окружающей среды.

Прямая идентификация Е. coli особенно актуальна, т.к. Е. coli является важным санитарно-показательным микроорганизмом, в частности при определении коли-титра воды, характеризующего качество питьевой воды централизованных систем питьевого водоснабжении в отношении эпидемической безопасности. Как было выше сказано, сред для прямой идентификации Е. coli в нашей стране не выпускается, в силу чего для выявления Е. coli среди других колиформных бактерий, по настоящим действующим нормативным документам, требуется не менее 3-х суток.

Разработанный в процессе настоящих исследований Е. coli хром агар позволяет одноэтапно выделить и идентифицировать Е. coli по способности продуцировать специфический фермент ß—глюкуронидазу. Среда обладает высокими дифференцирующими свойствами и не имеет отечественных аналогов.

Следуя по пути ускорения процесса идентификации колиформных бактерий и на основании результатов, полученных при конструировании предыдущих двух сред, нами разработана среда ДагХром агар. Эта среда позволяет одновременно осуществить прямую идентификацию и Е. coli, и колиформных бактерий по способности продуцировать ß—глюкуронидазу и ß—галактозидазу, что значительно сокращает время на исследования, особенно при проведении санитарно-микробиологического контроля пищевых продуктов: появление на чашке со средой сине-зелёных колоний с жёлтым ореолом свидетельствует о присутствии в исследуемом материале кишечной палочки, а, следовательно, продукт подлежит браковке. Наличие на чашке со средой только жёлтых колоний с жёлтым ореолом (колиформных бактерий) свидетельствует об отсутствии свежего фекального загрязнения. Для объективной оценки биологических свойств сконструированной среды использовали хромогенную среду сравнения ШСготе" ш ЕСС Selective Agar. Эта среда, также как и среда ДагХром агар, обеспечивала в течение (18±2) ч инкубации посевов при (37± 1) °С идентификацию колиформных бактерий, в т. ч. и Е. coli. Среда HiCromeт' ЕСС Selective Agar в сравнении с ДагХром агаром не полностью подавляет роение протея. Кроме того, из-за присутствия в среде HiCrome" ш ЕСС Selective Agar термолабильных компонентов требуется щадящая стерилизация (дробная стерилизация путём 3-кратной обработки среды в открытой струе пара). В то же время на ДагХром агаре протеи вырастали в О-форме, и среда не требовала стерилизации.

Таким образом, предлагаемая среда ДагХром агар может с достаточно высокой вероятностью заменить среду Эндо (регламентируемую действующими в РФ нормативными документами), т.к. позволяет одновременно с выделением идентифицировать Е. coli и колиформные бактерии, что значительно ускоряет время бактериологического анализа и упрощает работу практических микробиологов.

Среди УПЭ наряду с Е. coli и другими колиформными бактериями в качестве возбудителей внеи внутрибольничных инфекций довольно часто регистрируются Proteus spp. На предыдущей среде ДагХром агар осуществить прямую идентификацию протеев невозможно, т.к. они вырастают в виде бесцветных колоний, также как Р. aeruginosa и патогенные энтеробактерии. Известные среды для прямой идентификации протеев на основе выявления их родоспецифического фермента триптофандезаминазы (ТДА) требуют внесение в среду ex temporae 10%-й раствора хлорного железа трёхвалентного. С целью обеспечения возможности одновременной прямой идентификации протеев наряду с Е. coli и другими колиформами и исключения необходимости внесения в среду ex temporae 10%-го раствора хлорного железа трёхвалентного нами сконструирована среда Е. coli-колиформ-Рго/ег" хром агар, содержащая в отличие от ДагХром агара увеличенное количество триптофана в количестве 7,0 г/л. На среде Е. coli-колиформ-Р/-о/ег/5 хром агар идентификация Е. coli, колиформных бактерий и протеев осуществляется по способности продуцировать этими микробами соответственно ß—глюкуронидазу, ß—галактозидазу и триптофандезаминазу: Е. coli вырастают в виде колоний сине-зелёного цвета с жёлтым ореолом, колиформные бактерии — жёлтые с жёлтым ореолом, а протеи — коричневые с коричневым преципитатом. Патогенные энтеробактерии и Р. aeruginosa вырастают в виде бесцветных колоний в виду отсутствия у них способности продуцировать вышеназванные ферменты.

Таким образом, среда Е. coli-Koim^o^M-Proteus хром агар имеет значительные преимущества перед традиционно употребляемой средой Эндо:

1. Прямая идентификация Е. coli через (18 ±2) ч инкубации посевов при (37 ± 1) °С, в то время как при использовании среды Эндо требуется от 3 до 5 суток (для постановки ТИМАЦ-тестов);

2. Прямая идентификация колиформных бактерий через (18 + 2) ч инкубации посевов при (37+ 1) °С, в то время как при использовании среды Эндо для этого требуется 48 ч (с посевом в среду Гисса с лактозой).

3. Прямая идентификация протеев через (18 ±2) ч инкубации посевов при (37+ 1) °С, в то время как при использовании среды Эндо протей роится, что затрудняет выделение чистой культуры УПЭ в случае присутствия в микробной ассоциации Р. vulgaris или P. mirabilis.

4. Предлагаемая среда не светочувствительная, что позволяет хранить её в чашках длительное время (8−10суток), в отличии от среды Эндо, которую готовить впрок нельзя.

Однако на предлагаемой среде Е. со//-колиформ-Рго/еш' хром агар прямую идентификацию клебсиелл осуществить невозможно, т.к. клебсиеллы, как и другие колиформные бактерии, продуцируют ß—галактозидазу, и поэтому на среде вырастают также в виде жёлтых колоний с жёлтым преципитатом. В то же время актуальность разработки среды для прямой идентификации клебсиелл не вызывает сомнений в виду вышесказанной их этиологической значимости в возникновении различных заболеваний.

Известная способность клебсиелл продуцировать родоспецифический фермент 5-аминосалицилатдекарбоксилазу, которая расщепляет 5-аминосалициловую кислоту (5-АСК) с образованием продукта коричневого цвета, нацелила нас на введение в среду Е. со/г-колиформ-Рго^еш хром агар дополнительно 5-АСК для обеспечения возможности осуществления на этой среде прямой идентификации также и клебсиелл. Однако такой вариант среды оказался непригодным, т.к. дифференцировать протеи от клебсиелл оказалось невозможным из-за одинаковой коричневой окраски этих колоний и коричневого преципитата в среде в зоне их роста. Поэтому нами была сконструирована сухая питательная среда для выявления и идентификации клебсиелл, на которой через (18±2) ч инкубации посевов при (37+1) °С коричневые колонии клебсиелл с коричневым преципитатом в среде в зоне их роста чётко дифференцируется от всех остальных микроорганизмов, вырастающих в виде колоний жёлтого цвета. Полученная среда обладает, очевидным преимуществом перед известными по дифференцирующим свойствам и срокам идентификации клебсиелл. Проводя исследования, мы обнаружили, что Е. aerogenes продуцирует, также* как и К. pneumoniae, 5-аминосалицилатдекарбоксилазу, образуя колонии коричневого цвета с коричневым преципитатом. В связи с этим дифференциацию Е. aerogenes от клебсиелл осуществляли с помощью теста на подвижность.

При проведении исследований разработанных хромогенных питательных сред на клиническом материале продукцию ß—галактозидазы наблюдали в 100% случаев выявления колиформных бактерий. Аналогично в 100% случаев наблюдали продукцию ТДА при выявлении протеев, также как и продукцию клебсиеллами и Е. aerogenes 5-аминосалицилатдекарбоксилазы. Однако продукцию специфического фермента Е. coli ß—глюкуронидазу наблюдали в (98±1)% исследований. С целью обеспечения возможности идентификации E. coli, непродуцирующих ß—глюкуронидазу, а также всех остальных энтеробактерий, непродуцирующих специфических ферментов, нами предложен алгоритм выделения и ускоренной идентификации клинически значимых и санитарно-показательных УПЭ, предусматривающий минимальный дифференцирующий ряд биохимических тестов, наряду с использованием двух разработанных нами хромогенных питательных средЕ. coli’Komifyopu-Proteus хром агара и Клебсиелла хром агара, а также полужидкого агара, агара Клиглера и цитратного агара Симмонса, в сочетании с двумя короткими тестами — оксидазным и индольным. Идентификация выделенных микроорганизмов производится по совокупности биохимических свойств: способности продуцировать высокоспецифические ферменты и пигменты, образовывать индол, сероводород, оксидазу, ферментировать лактозу, глюкозу с газом или без него, а также по тесту подвижности, что показано в таблице 29.

Учитывая, что для идентификации УПЭ по действующим методическим указаниям затраты времени составляют от 3 до 5 суток и требуется использование не менее 10 различных дифференциально-диагностических питательных сред по 15 биохимическим тестам, предлагаемая схема, предусматривающая использование 5 питательных сред и постановки дополнительно 2-х тестов, имеет бесспорное преимущество перед действующей: менее трудоёмка и сокращает затраты времени на исследования.

Предложенный алгоритм выделения и ускоренной идентификации клинически значимых и санитарно-показательных УПЭ с помощью созданных хромогенных питательных сред, позволяет существенно сократить сроки идентификации возбудителя (с 3−5 суток до 18−36 ч), что значительно упрощает процесс проведения бактериологических исследований.

Таким образом, разработанные оригинальные качественные и количественные составы отечественных хромогенных питательных сред, в отличие от зарубежных аналогов, содержат отечественные ингредиентыпитательные основы, стимуляторы роста, селективные агенты и др., которые в сочетании с подобранными оптимальными количествами хромогенных субстратов позволяют провести чёткую идентификацию УПЭ через (18± 2) ч инкубации посевов при (37+ 1) °С, не уступая зарубежным аналогам.