Микротомография биологических объектов с использованием лабораторных рентгеновских источников

Прогресс в таких областях научного знания как нанотехнологии, полимерные технологии, микробиология, а также медицинская диагностика, связан с методами неразрушающего исследования внутренней структуры объектов со все более высоким разрешением. Наиболее удобным, а в некоторых случаях и единственным подходом для таких исследований остается использование рентгеновского излучения.

В связи с этим значительное количество научных групп во всем мире занимается развитием методов рентгеновской интроскопии [1]-[14]. Большинство из них работает на синхротронных источниках [1]-[Ю], что обусловлено высокой яркостью таких источников, малой угловой расходимостью излучения, перестраиваемостыо по энергиям. Однако синхротронные источники имеют свои недостатки — высокая стоимость и малая доступность, ограниченность времени проведения конкретного исследования.

Кроме синхротронных используются также различные плазменные источники (лазерные, пинчевые) [10],[11],[14],[15]. Проводятся и эксперименты с традиционными рентгеновскими трубками [12,13].

Одной из главных задач и по сей день остается создание рентгеновских микроскопов, имеющих разрешение выше, нежели в оптическом диапазоне, но в отличие от электронных, не требующих предварительной обработки образцов. Кроме того, рентгено-микроскопические методы исследования, в отличие от электронно-микроскопических, позволяют исследовать влажные образцы и в ряде случаев не вызывает значительного повреждения их структуры.

Второй большой задачей, для которой используются методы рентгеновской интроскопии, является исследование массивных и непрозрачных в видимом диапазоне объектов.

Однако получение только лишь двумерных отображений внутренней структуры объектов уже не удовлетворяет исследователей. Во многих случаях требуется получить трехмерную модель объекта, описывающую распределение плотности (или рентгенооптической плотности) внутри исследуемого образца. Это возможно, если воспользоваться техникой компьютерной томографии [16]. Этот метод в различных вариациях широко используется в настоящее время в большом числе рентгеновских исследований [17]-[27] в том числе и в данной работе. При этом энергия используемого рентгеновского излучения определяет круг решаемых задач.

Большинство рентгеномикроскопических исследований выполняется в так называемом «водяном окне» — диапазоне длин волн 2,2−4,4 нм между А^-краями поглощения углерода и кислорода. При этом поглощение в воде на порядок меньше поглощения в биологических (углеродосодержащих) тканях, что и обеспечивает высокий контраст. В диапазоне «водяного окна» достигнуты наибольшие успехи по получению высокого разрешения [26] (в настоящее время лучшие зонные пластинки позволяют получать изображение с разрешением лучше 30 нм). Однако, в этом диапазоне глубина проникновения излучения в вещество (например, биологические ткани) не превышает двух десятков микрон, что позволяет исследовать только очень тонкие — специально приготовленные объекты [26]. Кроме того, малая глубина проникновения существенно затрудняет проведение томографических исследований. (Поскольку поперечные размеры объекта часто много больше его толщины, возможно получение теневых проекций только в ограниченном интервале углов). Это усложняет процедуру реконструкции и снижает ее точность [26].

В медицинских, геологических исследованиях, а также в промышленной дефектоскопии [19] используется весьма жесткий (короче 0,05 нм) диапазон излучения. Отметим, что для таких длин волн рентгенооптические элементы не находят широкого. применения, а также значительно уменьшается эффективность детекторов. В рентгеновской микроскопии использование такого излучения, по нашему мнению, нецелесообразно вследствие весьма малого, и близкого для различных мягких биологических тканей поглощения излучения и, следовательно, слабого контраста.

Таким образом, по нашему мнению, для проведения исследования структуры углеродосодержащих объектов с линейными размерами от 0,01−100 мм, методами рентгеновской микроскопии и микротомографии разумно применять более жесткое, чем соответствующее области водяного окна, рентгеновское излучение. Его длина волны, однако, должна быть больше, чем, например, при дефектоскопии металлов. Этим условиям соответствует излучение в диапазоне 0,25−0,05 нм, обычно применяемое в рентгеноструктурных исследованиях. Микроскопические исследования в таком диапазоне также ведутся в ряде мировых лабораторий [28]-[32]. Рентгеновское излучение в этом диапазоне возможно получать при помощи простого и достаточно дешевого источника — рентгеновской трубки.

Интервал 0,25−0,05 нм удобен также тем, что выбор различных длин волн (путем смены анода трубки) позволяет получать различную глубину проникновения излучения в вещество (от десятков микрон до десятков миллиметров), и, соответственно, варьировать контраст изображения. Поэтому именно в этом диапазоне и были проведены все исследования, представленные в данной работе.

Большинство существующих лабораторных рентгеновских томографов обеспечивают разрешение на уровне 5−10 мкм. Это недостаточно для некоторых практических применений. По нашему мнению, наиболее перспективным и весьма актуальным является создание прибора, имеющего разрешение порядка 1−2 мкм и поле зрения 1−2 мм. В представляемой работе проводится теоретическое и экспериментальное обоснование возможности создания такого прибора.

Выполнены исследования изображающих свойств рентгенооптических элементов наиболее перспективных для достижения этой цели. Как нам представляется такими элементами являются преломляющая многоэлементная рентгеновская линза и асимметричный кристалл-монохроматор. С применением этих элементов на лабораторных рентгеновских источниках выполнены эксперименты и получены увеличенные изображения тест-объектов. Методом численного моделирования проведены теоретические расчеты достижимого разрешения и поля зрения.

Автором предложена и осуществлена модификация дифрактометра ДРШ, разработанного в СКБ Института кристаллографии РАН [33] для проведения томографических измерений. Разработана методика таких измерений. Выполнены эксперименты по определению разрешения, а также чувствительности и точности микротомографа созданного на базе дифрактометра ДРШ. Выполнена реконструкция пространственной структуры ряда биологических объектов.

Сконструирован микротомограф на базе дифрактометра Амур-1. Дифрактометр дооснащен двумерным координатным детектором с размером чувствительного элемента ~10×10 мкм и числом элементов 1152×1024. Это позволило получить трехмерные реконструкции трубчатых костей рептилий с разрешением порядка 10 мкм.

На основе проведенных теоретических и экспериментальных исследований спроектирован и изготовлен макетный образец лабораторного микротомографа, используя который возможно получить разрешение порядка 1−2 мкм при поле зрения около 1 мм.

ВЫВОДЫ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Теоретически и экспериментально обоснована возможность создания лабораторного рентгеновского микротомографа с разрешением не менее 1 мкм и полем зрения ~1 мм при использовании увеличивающих рентгенооптических элементов. Создан рентгеновский микротомограф, позволяющий получать реконструкции с разрешением ~10 мкм (без применения рентгенооптического элемента).

2. С использованием методов численного моделирования проведен теоретический анализ изображающих свойств двух рентгенооптических элементов для лабораторной рентгеновской микроскопии — асимметричного кристалла-монохроматора и рентгеновской капиллярной пузырьковой линзы. Выполнены теоретические оценки достижимого разрешения и поля зрения для данных оптических элементов при использовании лабораторных рентгеновских источников. В случае асимметричного кристалла достижимое увеличение — порядка 100, разрешение меняется по полю зрения и может составлять 0,08 мкм, поле зрения — ограничено доступными размерами кристаллов. Для исследованной рентгеновской линзы разрешение достигает 0,5 мкм, а поле зрения около 1 мм.

3. На ряде тест-объектов экспериментально продемонстрирована возможность получения увеличенных изображений при использовании названных оптических элементов и лабораторных рентгеновских источников. В случае использования асимметричного кристалла было получено увеличение 20 (в одном направлении, т.к. использовался один кристалл). При использовании пузырьковой линзы было получено рентгеновское изображение с увеличением до 13 при поле зрения до 1 мм.

4. Разработана методика рентгеновских томографических исследований для автоматизированных лабораторных дифрактометров с позиционно-чувствительным детектором. Эта методика испытана на рентгеновском дифрактометре ДРШ, изготовленном в ИК РАН, на длинах волн 0,15 и 0,07 нм. В экспериментах использовался линейный позиционно-чувствительный детектор с линией задержки, что обеспечивало разрешение не хуже 200 мкм при общей длине окна детектора 100 мм.

5. Методами рентгеновской томографии исследована пространственная структура двух биообъектов разной природы. Восстановлено внутреннее строение амфибии Salamandrella keyserlingii. Получены реконструкции эпифизов в норме, при поражении болезнью Альцгеймера и при шизофрении. Впервые обнаружен факт значительного уменьшения содержания солей кальция и отсутствие связности областей кальцификации при наличии патологии.

При исследовании структуры этих объектов было достигнуто разрешение не ниже 0,2 мм, что превосходит разрешение современных медицинских томографов.

6. Впервые выполнены на основании рентгеновских экспериментов реконструкции трехмерной структуры костей рептилий — геккона Pachydactylus bibronii с характерным размером деталей порядка 10 мкм. Выявлены все характерные особенности строения большой берцовой кости этого животного. Результаты рентгенотомографических и гистологических исследований не позволяют сделать заключение о декальцификации данных костей этих рептилий при пребывании в невесомости.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор считает своим приятным долгом выразить благодарность:

Своему научному руководителю В. Е. Асадчикову, который направлял его научную работу на протяжении более 5 лет.

Ю.В.Пономареву, кафедра ОФВП Физического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова, за его огромную помощь в части работы, касающейся асимметричных кристаллов.

С.В.Савельеву, Институт морфологии человека РАМН, за биологические консультации и весьма приятное общение, а также за предоставленные образцы.

А.В.Бузмакову, студенту кафедры ОФВП Физического факультета МГУ, без которого данная работа существенно замедлилась бы, или вообще могла стать невозможной.

Ю.И.Дудчику, Белорусский государственный университет, за интересные обсуждения и предоставленную микрокапиллярную линзу.

С.В.Кузину и другим сотрудникам ФИАН за предоставленную CCD-камеру и ценные замечания.

Е.А. Черемухину, Г. А. Тудоси и А. И. Чуличкову за консультации по вопросам восстановления томографических изображений.

Автор хочет поблагодарить и сотрудников своего сектора рентгеновской рефлектометрии и нейтронографии И. В. Кожевникова, М. В. Чукалину и В. Н. Шкурко за помощь в работе и участие в обсуждении.

Автор также хочет поблагодарить В. В. Волкова, К. А. Дембо и Л. А. Фейгина, сотрудников лаборатории малоуглового рассеяния ИК РАН.

Отдельную благодарность автор хочет выразить А. В. Меренскому, В. А. Шишкову, А. С. Арсеньтеву, а также другим сотрудникам СКБ ИК РАН, без помощи которых была бы невозможна модификация установок, а, следовательно, и выполнение всей экспериментальной части работы.

ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

1. В. Е. Асадчиков, Б. В. Мчедлишвили, Ю. В. Пономарев, А. А. Постнов, Р. А. Сенин, Т. В. Цыганова. Рентгеновская микроскопия с использованием асимметричного отражения от монокристалла. Письма в ЖЭТФ. 2001, т.73, вып.4, сс.205 — 209.

2. А. В. Андреев, В. Е. Асадчиков, И. А. Артюков, А. В. Виноградов, Ю. С. Касьянов, В. В. Кондратенко, В. Е. Левашов, Б. В. Мчедлишвили, Ю. В. Пономарев, А. Г. Пономаренко, А. В. Попов, А. А. Постнов, С. В. Савельев, Р. А. Сенин, И. И. Струк. Рентгеновская микроскопия в мягком и жестком диапазонах длин волн. // Нижний Новгород, материалы совещания Рентгеновская оптика — 2001, сс.7−15.

3. А. В. Андреев, Ю. В. Пономарев, А. А. Коновко, В. Е. Асадчиков, Р. А. Сенин. Рентгеновская микроскопия с использованием асимметричного отражения от монокристалла. //Третья Национальная конференция по применению Рентгеновского, Синхротронного излучений, Нейтронов и Электронов для исследования материалов (РСНЭ-2001), Москва 2001, с. 404.

4. А. В. Андреев, В. Е. Асадчиков, И. А. Артюков, А. В. Виноградов, В. Н. Зрюев, Ю. С. Касьянов, В. В. Кондратенко, В. Е. Левашов, Б. В. Мчедлишвили, Ю. В. Пономарев, А. Г. Пономаренко, А. В. Попов, А. А. Постнов, С. В. Савельев, Р. А. Сенин, И. И. Струк. Абсорбционная рентгеновская микроскопия в мягком и жестком диапазонах длин волн. //Третья Национальная конференция по применению Рентгеновского, Синхротронного излучений, Нейтронов и Электронов для исследования материалов (РСНЭ-2001), Москва 2001, с. 408.

5. В. Е. Асадчиков, А. В. Виноградов, Ю. И. Дудчик, Н. Н. Кольчевский, Ф. Ф. Комаров, Р. А. Сенин. Использование многоэлементной преломляющей линзы для формирования пучка рентгеновского излучения с энергией фотонов 5.4 кэв. //Третья Национальная конференция по применению Рентгеновского, Синхротронного излучений, Нейтронов и Электронов для исследования материалов (РСНЭ-2001), Москва 2001, с. 422.

6. А. В. Андреев, В. Е. Асадчиков, И. А. Артюков, А. В. Виноградов, В. Н. Зрюев, Ю. С. Касьянов, В. В .Кондратенко, В. Е. Левашов, Б. В. Мчедлишвили, Ю. В. Пономарев, А. В. Попов, А. А. Постнов, С. В. Савельев, Р. А. Сенин, И. И. Струк. Рентгеновская микроскопия трековых мембран и биологических объектов в мягком и жестком диапазонах длин волн. Кристаллография. 2001, т.46, № 4, сс.658 — 663.

7. V.E.Asadchikov, Yu.I.Dudchik, N.N.Kolchevsky, F.F.Komarov, A.V.Popov, R.A.Senin, I.V.Suloev, A.V.Vinogradov. The usage of multielement refractive lens for imaging at5.4 kev. Seventh international conference on X-ray microscopy. Book of abstracts. P.54.

8. V.E.Asadchikov, Yu.I.Dudchik, N.N.Kolchevsky, F.F.Komarov, R.A.Senin, A.V.Vinogradov «Using a multielement refractive lens for formation of a beam of 5.4 keV photons». Proceedings of SPIE. (2002), vol.4765 pp.60−66.

9. S. A. Pikuz, V. E. Asadchikov, К. M. Chandler, D. A. Hammer, Yu. I. Dudchik, N. N. Kolchevsky, F. F. Komarov, M. D. Mitchell, A. V. Popov, T. A. Shelkovenko, R. A. Senin, I. A. Suloev, and A. V. Vinogradov Application of a refractive bubbles-in-capillary x-ray lens to X pinch experiments. Review of Scientific Instruments, 2003, vol.74, № 3, pp. 2247−2250.

10. В. Е. Асадчиков, В. В. Березкин, А. Б. Васильев, Б. В. Мчедлишвили, Р. А. Сенин Рентгеновские и оптические методы в исследовании трековых мембран. Четвертая Национальная конференция по применению.

Рентгеновского, Сннхротронного излучений, Нейтронов и Электронов для исследования материалов (РСНЭ-2003), Москва 2003, с. 442.

11. В. ЕЛсадчиков, А. В. Бузмаков, Ю. В. Заневский, В. Н. Зрюев, Р. А. Сенин, Л. П. Смыков, Г. А. Тудоси, Г. А. Черёмухина, Е. А. Черёмухин, С. П. Черненко, А. И. Чуличков Рентгеновская томография на длинах волн 0,7 -2,29 А с использованием лабораторного источника и линейного позиционно-чувствительного детектора. Четвертая Национальная конференция по применению Рентгеновского, Синхротронного излучений, Нейтронов и Электронов для исследования материалов (РСНЭ-2003), Москва 2003, с. 470.

12. В. ЕЛсадчиков, В. Г. Бабак, А. В. Бузмаков, Ю. П. Дорохин, В. Н. Зрюев, И. В. Кожевников, Ю. С. Кривоносов, В. Ф. Мамич, Л. А. Мосейко, Н. И. Мосейко, Р. А. Сенин, Ю. Н. Шилин, В. А. Шишков. Рентгеновский дифрактометр с подвижной системой излучатель-детектор: конструкция и опыт эксплуатации. // Нижний Новгород, материалы совещания Рентгеновская оптика-2004, сс.149 — 157.

13. В. Е. Асадчиков, А. В. Бузмаков, Ю. В. Заневский, В. Н. Зрюев, Р. А. Сенин, С. В. Савельев, Л. П. Смыков, Г. А. Тудоси, Г. А. Черёмухина, Е. А. Черёмухин, С. П. Черненко, А. И. Чуличков Трансмиссионная рентгеновская томография на длинах волн 0.7−1.54А в лабораторных условиях. // Нижний Новгород, материалы совещания Рентгеновская оптика — 2004, сс.123 — 130.

14. В. Е. Асадчиков, А. В. Виноградов, Ю. И. Дудчик, Н. Н. Кольчевский, Ф. Ф. Комаров, А. В. Попов, Р. А. Сенин, И. В. Сулоев Применение рентгеновских многоэлементных капиллярных линз для получения увеличенных изображений с использованием лабораторного источника на длине волны 2.29А. // Нижний Новгород, материалы совещания Рентгеновская оптика-2004, сс.158 — 165.

15. В. Е. Асадчиков, В. Г. Бабак, А. В. Бузмаков, Ю. П. Дорохин, И. П. Глаголев, Ю. В. Заневский, В. Н. Зрюев, Ю. С. Кривоносов, В. Ф. Мамич, Л. А. Мосейко, Н. И. Мосейко, Б. В. Мчедлишвили, С. В. Савельев, Р. А. Сенин, Л. П. Смыков, Г. А. Тудоси, В. Д. Фатеев, С. П. Черненко, Г. А. Черёмухина, Е. А. Черёмухин, А. И. Чуличков, Ю. Н. Шилин, В. А. Шишков. «Рентгеновский дифрактометр с подвижной системой „излучатель — детектор“», ПТЭ. 2005 т.48, № 3, сс. 99−107.

16. СБ. Савельев, В. Е. Асадчиков, Е. И. Фокин, Р. А. Сенин, А. В. Бузмаков, В. Б. Никитин, Е. А. Ерофеева, Т. В. Быстрова. Пространственная организация конкрементов эпифиза человека при старении. // Сборник научных трудов VII Всероссийской конференции по патологии клетки. Москва ГУ НИИМЧ РАМН (2005) сс. 111−114.

17. А. В. Андреев, В. Е. Асадчиков, И. А. Артюков, А. В. Бузмаков, А. В. Виноградов, Ю. И. Дудчик, В. Н. Зрюев, Ю. С. Касьянов, Н. Н. Кольчевский, Ф. Ф. Комаров, В. В. Кондратенко, Б. В. Мчедлишвилли, Ю. В. Пономарев, А. В. Попов, А. А. Постнов, С. В. Савельев, Р. А. Сенин, И. В. Сулоев. Рентгеномикроскопические методы в исследовании трековых мембран и биологических объектов. Мембраны № 3 (27), 2005. сс. 17−27.