Теоретическое исследование рН-зависимой регуляции электронного и протонного транспорта в хлоропластах

Математическое моделирование давно применяется для анализа световых и темновых стадий фотосинтеза. Моделирование процессов электронного и протонного транспорта с учетом структурных и функциональных особенностей тилакоидных мембран может играть важную роль для количественного анализа механизмов регуляции электронного транспорта и энергетического сопряжения в хлоропластах. Это связано с тем, что непосредственные измерения рН внутри компартментов малых размеров (например, в узкой межтилакоидной щели) с помощью рН-чувствительных зондов затруднены. Однако количественное описание биоэнергетических процессов в фотосинтетических системах осложняется высокой степенью компартментализации фотосинтетического аппарата на разных уровнях структурной организации.

В первой части диссертационной работы рассматривается математическая модель электронного и протонного транспорта в хлоропластах высших растений, учитывающая фотоиндуцированные изменения рН во внутритилакоидном пространстве и в строме хлоропласта (Глава 3). В этой модели наряду с нециклическим (линейным) транспортом электронов от ФС2 к конечному акцептору ФС1, учитываются процессы синтеза АТФ, сопряженного с трансмембранным переносом протонов через АТФ-синтазу, потребление АТФ в цикле Кальвина, а также окислительно-восстановительные превращения конечного акцептора электрона ФС1. В данной модели феноменологически описываются процессы активации цикла Кальвина, обусловленные зависимостью скоростей реакций цикла Кальвина от рН стромы хлоропласта. Результаты численного эксперимента показали, что процессы светоиндуцированной активации ферментов цикла Кальвина, влияющие на скорость оттока электронов от ФС1, могут заметным образом сказываться на кинетике электрон-транспортных процессов в интактных хлоропластах. В частности, рН-зависимое ускорение оттока электронов на акцепторном участке ФС1 за счет активации цикла Кальвина может быть причиной многофазной (немонотонной) кинетики окислительно-восстановительных превращений Р700 при освещении адаптированных к темноте хлоропластов, которая наблюдается в опытах с интактными хлоропластами in situ.

Во второй части диссертации описаны свойства двух модельных систем, построенных для квантовохимического моделирования двух элементарных стадий реакции окисления хинола в хинон-связывающем центре Qc цитохромного /^комплекса, являющейся лимитирующей в цепи электронного транспорта в хлоропластах (Глава 4). Обе модели основаны на рентгеновской кристаллической структуре цитохромного 6^комплекса зеленой водоросли Chlamodomonas reinhardtii. Методом функционала плотности рассчитаны энергетические диаграммы для двух элементарных стадий реакции окисления триметил-1,4-бензохинола (аналог пластохинола) в центре Q0, сопряженных с процессами переноса протона от молекулы хинола к железо-серному центру Риске и высокопотенциальному цитохрому Показано, что построенные модельные системы дают корректное описание реакции окисления хинола в центре Q0, согласующееся с представлениями о бифуркационном характере этой реакции в соответствии с механизмом Q-цикла Митчелла. Результаты расчетов хорошо согласуются с известными представлениями о том, что лимитирующей стадией в работе цепи электронного транспорта между двумя фотосистемами является первая стадия окисления хинола в хинон-связывающем центре Q0 цитохромного б^комплекса.

ВЫВОДЫ.

1. Построена математическая модель процессов электронного и протонного транспорта в хлоропластах, впервые учитывающая не только фотоиндуцированные изменения рН внутритилакоидного пространства (pHj), но и изменения рН в строме (рН0), влияющие на процессы активации реакций цикла Кальвина.

2. Выделены два основных фактора рН-зависимой регуляции электронного транспорта, определяющие немонотонную временную зависимость редокс-превращений Р700и других электронных переносчиков: а) торможение электронного транспорта между фотосистемами 2 и 1 вследствие уменьшения рН— б) ускорение оттока электронов от ФС1, обусловленное увеличением рНо.

3. Построены модельные системы для описания методом функционала плотности двух стадий окисления пластохинола в хинон-связывающем центре Qc цитохромного Ьф комплекса фотосинтетической цепи переноса электронов.

4. Расчеты спиновой плотности на ядрах атомов водорода анион-радикала триметил-1,4-бензохинона дали хорошее согласие с экспериментом, что свидетельствует об адекватности использованного метода расчета электронных характеристик молекул хиноидной природы.

5. Впервые рассчитаны энергетические диаграммы для двух элементарных стадий реакции окисления триметил-1,4-бензохинола (аналог пластохинола) в центре Q0, сопряженных с процессами последовательного переноса электронов от молекулы хинола к железо-серному центру Риске и цитохрому be'. Полученные результаты хорошо согласуются с представлениями о том, что лимитирующей стадией в работе цепи электронного транспорта между фотосистемами 2 и 1 является первая стадия окисления хинола в хинон-связывающем центре Q0 цитохромного /^комплекса.

Заключение

.

В диссертационной работе построена математическая модель электронного и протонного транспорта в хлоропластах высших растений и клетках цианобактерий, которая является развитием созданных ранее моделей фотосинтеза, посвященных рН-зависимой регуляции фотосинтеза [72−80]. В этой модели вместе с нециклическим (линейным) транспортом электронов от ФС2 к конечному акцептору ФС1, учитываются процессы синтеза АТР, сопряженного с трансмембранным переносом протонов через АТР-синтазу, а также потребление AIP и NADPH в цикле Кальвина. Наряду с фотоиндуцированными изменениями рН во внутритилакоидном пространстве, влияющими на скорость электронного переноса на пластохиноновом участке цепи электронного транспорта, были смоделированы рН-зависимые процессы электронного переноса на акцепторном участке ФС1, а также рассмотрено (в рамках феноменологического подхода) влияние фотоиндуцированных изменений стромального рН на потребление терминального акцептора ФС1 в реакциях цикла Кальвина. Учет фотоиндуцированных изменений рН в строме и во внутритилакоидном пространстве позволил описать влияние процессов активации ферментов цикла Кальвина на кинетику фотоиндуцированных окислительно-восстановительных превращений ряда переносчиков электрон-транспортной цепи хлоропластов. Сравнение результатов численных экспериментов, выполненных для различных метаболических состояний хлоропластов, с известными из литературы экспериментальными данными для листьев высших растений и клеток цианобактерий показывает, что модель адекватно описывает основные закономерности сложной немонотонной кинетики фотоиндуцированных окислительно-восстановительных изменений первичного донора электронов ФС1 (Р700), а также фотоиндуцированные изменения рН&bdquoи рН-.

Во второй части диссертационной работы описаны свойства двух модельных систем, построенных для квантово-химического моделирования окисления хинола в хинон-связывающем центре Q0. Обе модели основаны на рентгеновской кристаллической структуре цитохромного комплекса b (f зеленой водоросли Chlamodomonas reinhardtii. Одна из модельных систем (рис. 3) построена для моделирования окисления хинола в центре Q0- для этой системы рассчитан энергетический профиль первой стадии реакции окисления хинола — перенос атома водорода от аналога пластохинона триметил-1,4,бензохинол (TMQH2) на железо-серный белок Риске. Вторая модельная система (рис. 4) построена для моделирования переноса протона от семихинона (TMQH) на низкопотенциальный гем цитохрома be,. Обе стадии окисления хинола рассматриваются как процессы, в ходе которых атом водорода, отдаваемый одной из гидроксильных групп TMQH2, идет к одному из акцепторов депротонированный остаток (Hisl55 или Glu78) по дну энергетической «долины», определяемой фиксированными атомами модельной системы.

Среди факторов, влияющих на энергетику реакций переноса атома водорода в модельных системах, описанных выше, выделим положение хинола и ближайших групп, принимающих протон (Hisl55 и GIu78). Вероятность переноса протона от TMQH2 на депротонированный остаток Hisl55, координирующий атом Fe (ТегЗг^кластера ISP, очень чувствительна даже к незначительным структурным изменениям комплекса. Варьирование расстояния туннелирования и ориентации донора (TMQH2) и акцептора протона (Hisl55-[Fe2S2]) может заметно влиять на энергетические профили реакции переноса протона (рис. 9). Сравнительный анализ энергетических профилей для структур с различными атомными конфигурациями позволил выбрать наиболее приемлемую, на наш взгляд, конфигурацию модельной системы для адекватного описания первой (лимитирующей) стадии окисления хинона. Анализируя изменение геометрии исходной (рентгеновской) системы в ходе оптимизации, было обнаружено, что одна из частично оптимизированных систем (обозначенная как А—1) может быть использована как базовая структура для расчетов первой стадии окисления TMQH2. Атомная конфигурация системы А—1 близка к геометрии исходной системы, построенной на основе рентгеноструктурных данных. В этой системе энергия формирования фермент-субстратного комплекса определяется как понижение энергии при взаимодействии TMQH2 со свободной частью системы, которое составляет относительно малую величину, SE ~ -2 ккал/моль.

Результаты расчетов показали, что модельные системы, представленные на рис. 3 и 4, в принципе дают правильное объяснение энергетики РСЕТ реакции окисления окисления хинола в центре Q0. Первый шаг окисления хинола, моделируемый как перенос протона от TMQH2 к Hisl55, представляет собой эндогенный процесс (AG° — 10.7 ккал/моль при 298 К) с относительно большим активационным барьером (24,36 ккал/моль при 298 К). Этот результат хорошо согласуется с известными предположениями о том, что перенос первого электрона при окислении хинола в цитохромном комплексе be 1 является энерго-акцепторным процессом [65,66,152,157,162−166]. Следующий шаг окисления хинола (QH —* ?6L), рассматриваемый в рамках второй модельной системы (рис. 4), является экзогенным процессом (АЕ2~ -9,6 ккал/моль), что указывает на то, что перенос второго протона происходит значительно быстрее, чем перенос первого протона.

Эти результаты согласуются с общепринятой точкой зрения, что первый шаг окисления хинола является лимитирующим процессом, определяющим скорости родственных цитохромных комплексов b (f и Ъс [65,66,162−173].

Интерпретация полученных результатов, основанная на использовании уравнений классической теории электронного транспорта Маркуса, находится в хорошем согласии с кинетическими данными, доступными в литературе, что подтверждает вывод об эндогенной природе первого шага окисления хинола в центре Q0. Рассматривая первый шаг окисления TMQH2 как лимитирующую реакцию электронного транспорта, сопряженной с переносом протона вдоль водородной связи междуОН группой TMQH2 и соседним атомом Nc остатка гистидина Hisl55 окисленного железо-серного центра, была сделана оценка общей константы скорости &-рсЕТ окисления хинола. Значение &-рсЕТ было вычислено на основании структурных данных и рассчитанного энергетического профиля для первой стадии окисления хинола. Были рассчитаны изменение свободной энергии A G° и высота барьера реакции AGpCET. Согласие значений расчетной и экспериментальной констант скоростей 280 с-1 [149−151]) было получено в предположении, что реакция переноса водорода характеризуется сравнительно малыми значениями энергии реорганизации Я ~ 0,9−1,4 ккал/моль (40−60 мэВ).

Большое значение константы скорости для второй стадии окисления хинола (&-рсет 109−10п с" 1), полученное на основании расчетных данных, может обеспечить условия для высокой эффективности бифуркционной реакции концертного двуэлекгронного окисления хинола до хинона, объясняющая механизм переноса второго электрона исключительно по высоко-потенциальную цепь. В этом случае, энергетически выгодная стадия окисления TMQH, вообще говоря, не требует обязательного смещения семихинона внутри полости Q0 в сторону цитохрома. Иными словами, можно предположить, что обе стадии переноса протона в реакции бифуркационного окисления хинола до хинона могут происходить «концертно» и без вращения семихинона в полости Q0. Разумеется, что этот механизм вовсе не исключает того, что первичные элементарные стадии окисления хинола в каталитическом центре фермента сопровождаются конформационной релаксацией белковой глобулы и релаксационными процессами в его ближайшем окружения (см., например, [175]). Нельзя также исключить того, что после переноса протона на Glu78 может происходить вращение протонированного амиокислотного остатка Glu78, которое, как предположил Крофтс с сотрудниками [65,66], необходимо для выхода протона из центра Qc цитохромного^{-комплекса.} Несомненно, что более глубокое понимание механизмов работы цитохромного й^комплекса невозможно без изучения динамических особенностей этой системы методами молекулярной динамики. Однако детальный анализ этих процессов выходит за рамки задач, поставленных в данной диссертационной работе. Касаясь дальнейших перспектив нашей работы, можно предположить, что описанные выше модели могут быть использованы как базовые структуры для исследования окисления хинола в более сложных системах с использованием современных методы компьютерной химии (таких как, QM/MM метод).