Факторы, определяющие субстратную специфичность 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз Escherichia coli и человека

Молекула ДНК, главный носитель генетической информации, может повреждаться различными агентами физической и химической природы. Окислительные повреждения оснований, очень часто встречающиеся в ДНК, играют значительную роль в онкогенезе, старении и многих патологических процессах. Целостность ДНК после таких повреждений восстанавливается системой репарации ДНК, чаще всего путем эксцизионной репарации оснований (ЭРО). На ранних этапах ЭРО участвуют специфические ферменты двух классов — ДНК-тУ-гликозилазы, распознающие повреждение в ДНК и выщепляющие поврежденное основание, и АП-эндонуклеазы, расщепляющие ДНК по вновь образованному апурин-апиримидиновому (АП-) сайту.

Субстратной специфичности ДНК-гликозилаз посвящено большое количество работ во всем мире. Во всех организмах присутствует несколько ферментов из этой группы: так, у Escherichia coli насчитывается 8 ДНК-гликозилаз, а у человека — 11. Одни ДНК-гликозилазы обладают очень узкой субстратной специфичностью, например, удаляя из ДНК только основания урацила (Ura), в то время как другие способны выщеплять очень широкий спектр поврежденных оснований (например, практически все встречающиеся в природе окисленные пиримидиновые основания). Установление структуры многих ДНК-гликозилаз и их комплексов с поврежденной ДНК за последние 15 лет привело к идентификации важных для субстратной специфичности взаимодействий между аминокислотными остатками активных центров этих ферментов и поврежденными основаниями, а также к пониманию того, что фермент-субстратный комплекс в ходе реакции претерпевает ряд конформационных изменений. В последнее время также становится ясным, что субстратная специфичность ДНК-гликозилаз может по крайней мере частично определяться не только взаимодействиями в активном центре в михаэлисовском комплексе, но и структурными и динамическими особенностями фермент-еубстратного комплекса на ранних стадиях узнавания поврежденного звена ДНК еще до принятия комплексом каталитически компетентной конформации.

Проблема субстратной специфичности ферментов в целом и ДНК-гликозилаз в частности не исчерпывается установлением структуры фермент-субстратного комплекса или даже серии структур, приближенных к комплексам, последовательно образующимся в ходе реакции. В случае ДНК-гликозилаз, например, это подчеркивается тем, что для одного и того же фермента может наблюдаться большая разница в субстратной специфичности при использовании разных методов анализа. В частности, в ряде случаев многие поврежденные основания могут выщепляться из олигонуклеотидных субстратов, но не из поврежденной высокомолекулярной ДНК. Очевидно, что на субстратную специфичность ДНК-гликозилаз как in vitro, так и in vivo может влиять множество факторов, не очевидных из структуры, полученной методами рентгеноструктурного анализа или ядерного магнитного резонанса. В конечном итоге субстратная специфичность любой ДНК-гликозилазы определяется кинетическими факторами и зависит от относительных скоростей выщепления тех или иных оснований. Конкретные условия проведения реакции, различные белок-белковые взаимодействия, посттрансляционная модификация, аминокислотные замены, структура и динамика белка в областях, не взаимодействующих непосредственно с поврежденным основанием могут по-разному влиять на константы скорости отдельных стадий реакции для разных субстратов и тем самым вносить значительный вклад в субстратную специфичность. Для систематического изучения подобных факторов идеально подошла бы ДНК-гликозилаза, способная использовать несколько субстратов с разной эффективностью, причем корректная субстратная специфичность имела бы непосредственное отношение к биологической функции фермента.

Одним из самых распространенных окисленных оснований ДНК является 8-оксогуанин (8-oxoGua). Его способность образовывать энергетически выгодную пару с Ade приводит к тому, что при репликации напротив возникшего при окислении ДНК остатка 8-oxoGua ДНК-полимеразами часто включается dAMP, что после второго цикла репликации приводит к трансверсиям G—>Т. Репарация 8-oxoGua у прокариот и эукариот осуществляется с помощью специальной ферментативной системы (GO-системы), центральными элементами которой являются 8-оксогуанин-ДНК-7У-гликозилазы: Fpg у прокариот и OGG1 у эукариот. Эти белки не гомологичны на уровне последовательности и обладают совершенно разной третичной структурой. Тем не менее, как Fpg, так и OGG1 эффективно удаляют основание 8-oxoGua из пары с Cyt и гораздо хуже используют субстраты 8-oxoGua:Ade, выщепление 8-oxoGua из которых может приводить к трансверсиям G—>Т в тех случаях, когда такая пара возникла при включении dAMP напротив 8-oxoGua при репликации. Пары 8-oxoGua:Ade репарируются с участием других ДНК-гликозилаз. Таким образом, специфичность ферментов Fpg и OGG1 к основанию напротив 8-oxoGua выступает как ключевой фактор корректного функционирования GO-системы. Помимо 8-oxoGua, оба фермента способны удалять из поврежденной высокомолекулярной ДНК основания 2,6-диамино-4-оксо-5-формамидопиримидина, a Fpg — еще и остатки 4,6-диамино-5-формамидопиримидинатакже описано удаление этими многих модифицированных пуриновых оснований из олигонуклеотидных субстратов.

Белок Fpg гомологичен эндонуклеазе VIII — прокариотической ДНК-гликозилазе, удаляющей из ДНК окисленные пиримидиновые основания, но значительно отличается от нее по субстратной специфичности. В свою очередь белок OGG1 входит в суперсемейство эндонуклеазы III, которая также специфична по отношению к окисленным пиримидинам.

Цель настоящей работы заключается в изучении факторов, влияющих на субстратную специфичность ферментов OGG1 и Fpg. В ходе исследования необходимо было решить следующие задачи:

• изучить влияние условий реакции: ионной силы, присутствия ионов Mg2+, краудинг-агентов, полиаминов и т. п. на активность и на субстратную специфичность ферментов OGG1 и Fpg;

• изучить влияние АП-эндонуклеазы человека (АРЕХ1) на активность и субстратную специфичность фермента OGG1;

• изучить процессивность реакции расщепления различных субстратов ферментами Fpg и OGG1 и возможный вклад процессивности в субстратную специфичность этих ферментов;

• изучить влияние некоторых полиморфных и имитирующих фосфорилирование аминокислотных замен на активность и субстратную специфичность фермента OGG1;

• изучить субстратную специфичность ферментов, которые в целом гомологичны белку Fpg, но отличаются от него последовательностями некоторых высококонсервативных в семействе Fpg мотивов.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

6. выводы.

1) Проведено исследование зависимости специфичности 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз Е. coli (Fpg) и человека (OGG1) к основанию напротив 8-оксогуанина (8-oxoGua) от состава реакционной смеси. Показано, что специфичность обоих ферментов по отношению к корректному субстрату 8-oxoGua:Cyt повышается при значениях ионной силы и концентрации ионов Mg2+, близких к физиологическим значениям. В случае Fpg увеличение специфичности достигается за счет уменьшения значений Км для корректного субстрата и увеличения для некорректного субстрата (8-oxoGua:Ade), а в случае OGG1 — за счет увеличения для корректного субстрата значений константы скорости реакции разрыва TV-гликозидной связи (кт) и константы скорости высвобождения апурин-апиримидинового (АП) продукта реакции (кз) и уменьшения этих значений для некорректного субстрата.

2) Показано, что стимуляция активности OGG1 в присутствии АП-эндонуклеазы человека АРЕХ1 происходит по механизму непосредственного вытеснения OGG1 из комплекса с продуктом. При расщеплении корректных биологически значимых субстратов стимуляция протекает эффективнее, чем в случае некорректных субстратов.

3) Разработана новая методика анализа процессивности ДНК-гликозилаз. Показано, что Fpg и OGG1 катализируют процессивное расщепление субстратов, содержащих 8-oxoGua и АП-сайты. Процессивность действия уменьшается с возрастанием ионной силы раствора. Целостность фосфодиэфирного остова двуцепочечной ДНК не влияет на процессивность действия Fpg и OGG1. Процессивность Fpg и OGG1 при расщеплении субстратов 8-oxoGua:Ade выше, чем при расщеплении субстратов 8-oxoGua:Cyt, что указывает на отсутствие вклада фактора процессивности в обеспечение корректной специфичности ферментов.

4) Определены кинетические параметры реакции, катализируемой мутантными формами OGG1: природными полиморфными вариантами A288V, D322N и S326C и фосфомиметическими мутантными формами S280E, S231E, S232E, S231E/S232E и S326E. Активность большинства мутантных форм несколько снижена по сравнению с ферментом дикого типа, однако фермент OGG1-D322N обладает повышенной специфичностью к основанию Cyt напротив поврежденного основания. Активности всех форм OGG1 при выщеплении 2,6диамино-4-оксо-5-формамидопиримидина из высокомолекулярной ДНК сходны, в то время как активность практически всех мутантных форм по отношению к 8-oxoGua заметно снижена, а у белка OGG1-S326C отсутствует. АП-эндонуклеаза АРЕХ1 стимулирует активность фосфомиметических мутантных форм в меньшей степени, чем фермента OGG1 дикого типа.

5) Проведено клонирование паралога генов fpg и эндонуклеазы VIII (nei) Mycobacterium tuberculosis (Mtu-nei2). Получен суперэкспрессирующий штамм Е. coli, из которого выделен белок Mfw-Nei2. Фермент M/w-Nei2 проявляет высокую активность по отношению к ДНК-субстратам, содержащим остатки дигидроурацила и АП-сайты, а также способен с меньшей эффективностью расщеплять субстраты, содержащие остатки 8-oxoGua и урацила. Субстратная специфичность фермента Mtu-Nei2 сходна с субстратной специфичностью Nei Е. coli.

5.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Функционирование GO-системы основано на дискриминации ДНК-гликозилами пар 8-oxoGua:Cyt и 8-oxoGua:Ade. Ферменты Fpg и OGG1 с гораздо большей эффективностью удаляют 8-oxoGua из первой пары оснований, чем из второй. Кроме специфичности к основанию напротив 8-oxoGua, Fpg и OGG1 способны выщеплять характерный для каждого фермента спектр повреждений, при этом часто наблюдается ситуация, когда субстратная специфичность ферментов при использовании ОДН гораздо шире по сравнению с высокомолекулярной ДНК. Факторы, влияющие на субстратную специфичность ДНК-гликозилаз, практически не исследованы. Так, на предпочтение ДНК-гликозилазами (в частности Fpg и OGG1) одних субстратов другим могут влиять ионы Mg2+, полиамины, ионная сила раствора, органические анионы, краудинг-агенты, аналоги пуриновых оснований, посттрансляционная модификация, а также другие ферменты и вспомогательные белки ЭРО. Механизм поиска специфичных для каждого фермента субстратов среди огромного избытка немодифицированных оснований ДНК также может влиять на субстратную специфичность ферментов. Кроме этого одну из главных ролей в осуществлении специфических функций ферментов играют консервативные мотивы и отдельные аминокислотные остатки. Например, при наличии подгрупп с разной субстратной специфичностью внутри структурных семейств ферментов элементы, консервативные внутри всего семейства, преимущественно ответственны за общие каталитические функции, а мотивы и аминокислоты, консервативные внутри определенной подгруппы — для специфических в данной подгруппе свойств.

Настоящая работа представляет собой исследование различных факторов, ответственных за специфичность ДНК-гликозилаз Fpg и OGG1. В результате оказалось, что основной вклад в обеспечение С/А-специфичности обоих ферментов вносят ионная сила, концентрация Mg в реакционной смеси и, в случае OGG1, стимуляция АП-эндонуклеазой АРЕХ1. Аминокислотные замены, наблюдаемые в природных вариантах OGG1, а также имитирующие фосфорилирование белка, влияли на его С/А-специфичность в заметно меньшей степени, однако ранее не исследованный вариант OGG1-D322N обладал повышенной специфичностью по сравнению с ферментом дикого типа. С другой стороны, такие факторы, как присутствие органических анионов (глутамат), полиаминов, краудинг-агентов и некоторых гетероциклических соединений (кофеин, биотин), а также механизм процессивного поиска повреждений не влияли па С/А-специфичность исследованных ферментов. Что же касается специфичности OGG1 по отношению к поврежденным основаниям, на нее оказывала значительное влияние стимуляция АРЕХ1, а также некоторые аминокислотные замены, как полиморфные, так и фосфомиметические. В случае белков семейства Fpg значительный вклад в субстратную специфичность по отношению к поврежденным основаниям, по-видимому, вносят некоторые консервативные мотивы. В частности, присутствие N-концевой консенсусной последовательности Pro-Glu-Gly, малого незаряженного аминокислотного остатка в позиции 151 и остатка Arg в позиции 168, по-видимому, достаточно для сдвига субстратной специфичности от окисленных пуриновых к пиримидиновым основаниям.

От субстратной специфичности различных ДНК-гликозилаз в конечном итоге зависит их способность эффективно удалять из ДНК продукты ее повреждения при генотоксическом стрессе. Исследование разных факторов, обуславливающих эту специфичность, в конечном итоге важно для понимания механизмов функционирования защитно-репарационных систем живых организмов in vivo. В настоящей работе показана необходимость учитывать при исследованиях субстратной специфичности не только структуру ДНК-белковых комплексов, как это часто делается в последнее время, но и разнообразные дополнительные факторы, которые могут значительно модифицировать относительную скорость удаления поврежденных оснований ДНК-гликозилазами.