Разработка и сравнительная характеристика систем экспрессного иммунохимического определения микотоксинов

Развитие нормативной базы пищевой безопасности — как на национальном, так и на международном уровне — расширяет ряд потенциально опасных контролируемых соединений и предъявляет ужесточающиеся требования к их предельно допустимому содержанию [1]. Среди объектов контроля особое место занимают микотоксинынизкомолекулярные вторичные метаболиты плесневых грибов. Контаминация продуктов микотоксинами является серьезной проблемой для сельского хозяйства и здравоохранения практически всех стран мира. Обладая высокой токсичностью, данные соединения при попадании в продукты питания и корма могут причинить значительный вред здоровью человека и сельскохозяйственных животных. Их деконтаминация крайне затруднена — микотоксины стабильны при нагревании и обработке химическими агентами. Попадая в сырье, они не разлагаются в ходе технологических процессов и сохраняются до конечного продукта производства. Мониторинг содержания данных соединений на всех стадиях производства, транспортировки и хранения является необходимой и сложной задачей, решение которой требует наличия достоверных, чувствительных и производительных методов. Традиционные физико-химические методы анализа (прежде всего хроматографические), хотя и обеспечивают высокую чувствительность, сопряжены с использованием дорогого стационарного оборудования и длительными процедурами пробоподготовки. В связи с этим крайне актуально создание иммунохимических методов определения микотоксинов, сочетающих экспрессность, низкую стоимость и простоту применения. Однако, так как допустимые уровни содержания данных соединений в пищевых продуктах крайне низки, известные иммуно-химические методы их определения не всегда удовлетворяют практическим требованиям.

В связи с этим данное исследование направлено на разработку новых подходов с использованием конъюгатов антител и наночастиц коллоидного золота для создания двух высокочувствительных и экспрессных систем определения микотоксинов — им-мунохроматографического анализа и иммуносенсорного анализа на основе эффекта поверхностного плазменного резонанса.

Несмотря на широкое применение конъюгатов антител с коллоидным золотом в аналитических целях, вопросы, связанные с влиянием состава конъюгатов и реакционной способности антител в них на характеристики иммуноаналитических систем, остаются малоизученными. Проведенное в работе исследование этих взаимосвязей позволяет направленно оптимизировать иммуноаналигические системы с применением коллоидного золота и расширить возможности их использования для детектирования как микотоксинов, так и других биологически активных соединений.

Целые настоящей работы являлось изучение взаимодействий нативных и иммобилизованных на коллоидном золоте антител с микотоксинами для разработки универсальных подходов, позволяющих снизить пределы обнаружения иммуноаналитических систем.

Достижение поставленной цели включало решение следующих задач:

• изучить взаимосвязь между составом и свойствами конъюгатов антител с коллоидным золотом;

• разработать и охарактеризовать методы усиления сигнала в проточных аналитических системах;

• провести сравнительную оценку пределов обнаружения микотоксинов в различных форматах иммуноанализа;

• апробировать разработанные тест-системы для анализа растительных проб, содержащих микотоксины.

выводы.

1. Предложен метод характеристики иммунохимических свойств конъюгатов антитела — коллоидное золото, основанный на определении эквивалентного количества свободных антител. Установлен характер зависимости реакционной способности синтезируемых конъюгатов от количества специфических иммуноглобулинов.

2. Разработан высокочувствительный метод определения микотоксинов в иммуно-сенсорной системе с оптической регистрацией поверхностного плазмонного резонанса с использованием конъюгатов антивидовые антитела — коллоидное золото. Показано существенное усиление сигнала и снижение предела обнаружения до 40 пг/мл по сравнению с регистрацией взаимодействия с немечеными специфическими антителами.

3. Определены условия проведения иммунохроматографического анализа для контроля содержания микотоксинов в пробах с высоким содержанием органического растворителя (до 35% метанола). Пределы обнаружения в растительных экстрактах при визуальной детекции результатов составляют 10 нг/мл для афлатоксина В1 и 50 нг/мл для охратоксина А, а при видеоцифровой регистрации — 0,2 и 2 нг/мл, соответственно.

4. Предложен новый метод иммунохроматографического анализа, основанный на разделении стадий специфического взаимодействия и введения коллоидного маркера. Предел обнаружения афлатоксина В1 данным методом составляет 100 пг/мл, что в 10 раз ниже по сравнению с традиционным форматом анализа.