Моноклональные антитела к антигенам Bac. 
anthracis: получение и применение

Сибирская язва, болезнь, которая относится к числу особо опасных зоонозных инфекций, поражающая сельскохозяйственных животных (крупный и мелкий рогатый скот, лошадей, ослов, верблюдов), диких млекопитающих, а также человека, продолжает регистрироваться во многих странах и причиняет большой экономический ущерб [3, 7, 8]. Высокая заболеваемость обусловлена тем, что возбудитель сибирской язвы способен неопределённо долго сохранять жизнеспособность в почве в виде спор и образовывать стойкие стационарные очаги инфекции. Существование таких очагов в разных регионах мира, в том числе и на территории России, создает постоянную угрозу возникновения эпизоотий и заражения людей, которые могут инфицироваться в процессе переработки и использовании животноводческой продукции, полученной от больных животных (мясо, шкуры, шерсть и др.). По данным Всемирной организации здравоохранения в мире ежегодно заболевает около 20 тыс. человек, нередко отмечается и летальный исход [1−6].

В России в настоящее время зарегистрировано около 72 тыс., потенциальных очагов сибирской язвы [7]. Однако, в силу исторических, социальных и экономических обстоятельств большое количество скотомогильников, одиночных мест гибели или захоронений остаётся неучтённым, и по данным ряда исследователей именно они являются источником поступления возбудителя сибирской язвы в природную среду [7]. В итоге, государственный комитет санитарно-эпидемиологического надзора (Госкомсанэпиднадзор Минздрава РФ) оценивает эпидемическую обстановку в отдельных регионах страны как напряженную [3,7].

Перспективы совершенствования методов борьбы с сибирской язвы, как в медицинской, так и в ветеринарной практике напрямую связаны с созданием и применением в повседневной работе быстрых и достоверных методов обнаружения и идентификации возбудителя, а также с совершенствованием существующих средств профилактики.

Традиционные методы бактериологической индикации и идентификации возбудителя включающие: приготовление и окраску мазков, посев на питательные среды, биопробу, а также проведения ряда дополнительных исследований (тест «жемчужного ожерелья», лизабельность фагом, иммунофлюоресцентный тест), обеспечивают получение окончательного результата в сроки не ранее 2−3 суток от момента начала исследования, что существенно тормозит и соответственно усложняет проведение адекватных мер по локализации очага инфекции.

Иммунохимические методы, которые успешно применяются для индикации патогенных микроорганизмов и соответствующих антител уже более 50 лет, позволят во многом решить эту проблему [8, 51]. Примером могут служить созданные за последние годы лабораторные тест-системы для диагностики таких болезней как бруцеллез, туберкулёз, бешенство, иерсиниоз и др. [76, 109].

В основу всех без исключения иммунохимических методов анализа положено образование высокоспецифического комплекса между антигеном и антителом, в котором в качестве антигена могут выступать низкомолекулярные химические соединения (гаптены), белковые молекулы микробного или растительного происхождения, а также различные микробиологические объекты: бактерии, риккетсии, вирусы и т. д. Главная задача при разработке иммунодиагностической тест-системы состоит в визуализации единичных взаимодействий антигена с антителом путем регистрации макроскопического сигнала или по изменению физических свойств среды, а также увеличение чувствительности и специфичности иммуноанализа, достигаемое за счёт получения антител с максимальным аффинитетом к искомому антигену и разработке молекулярных систем усиления результата специфического взаимодействия антигена с антителом. Наиболее яркими примерами в этой области являются создание гибридомной технологии для получения моноклокнальных антител (МкАт) с заданными свойствами. Их использование в диагностических тест-системах в сравнении с поликлональными антителами обеспечивает получение более стабильных результатов при сохранении высокой чувствительности и специфичности, а стабильность свойств МкАт является определяющим фактором изготовления стандартных образцов препаратов в достаточно больших количествах. [35, 108].

Существующая потребность в более совершенных методах диагностики, выявления Bacillus anthracis и его токсических субстанций позволило нам определить следующую цель работы.

Цель работы.

Получить панель гибридом-продуцентов антител к специфичным антигенам Вас. anthracis и исследовать возможность их применения для иммунохимического анализа сибиреязвенных антигенов и конструирования диагностикумов.

Задачи исследования.

При выполнении работы необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести культивирование сибиреязвенного возбудителя и сапрофитных бацилл и приготовить антигенные препараты для иммунизации животных и тестирования гибридом.

2. Подобрать схемы иммунизации мышей антигенными препаратами Bacillus anthracis оптимальные для получения гибридом-продуцентов.

3. Получить гибридомы-продуценты моноклональных антител к видоспецифичным антигенам Bacillus anthracis.

4. Изучить иммунохимическую характеристику и эффекторные свойства моноклональных антител.

5. Разработать методы использования моноклональных антител для качественного и количественного определения распознаваемых ими антигенов.

Научная новизна.

Создана оригинальная коллекция стабильных гибридом-продуцентов моноклональных антител к протективному антигену Bacillus anthracis.

Представлены доказательства преимущества применения тестов на основе моноклональных антител по сравнению с классическими методами диагностики и идентификации возбудителя.

Положения, выносимые на защиту.

Получение оригинальной коллекции технологичных клонов гибридом-продуцентов антител к протективному антигену сибиреязвенного микроба.

На основе полученных моноклональных антител разработаны специфичные и чувствительные иммуноферментные методы качественного и количественного определения протективного антигена сибиреязвенного токсина в биологическом материале и метод выявления антител к протективному антигену в сыворотке вакцинированных животных. Апробация работы.

Материалы, изложенные в диссертации, доложены:

• на VIII Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В. И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2004» 23−25 мая 2004 г.

• На межлабораторном совещании специалистов ФГУ ВГНКИ 31 мая 2005 года.

• На межлабораторной конференции ГУ НИИВС им. И. И. Мечникова 3 июня 2005 года.

По материалам диссертационной работы опубликовано в периодической печати 3 научные статьи.

Структура диссертации.

Диссертация изложена на 98 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырёх глав собственных исследований,.

Выводы.

1. Получена оригинальная коллекция гибридом-продуцентов моноклональных антител к протективному антигену Вас. anthracis, распознающих четыре различных антигенных детерминанты.

2. На основе отобранных моноклональных антител разработаны варианты количественного сэндвич-ИФА, позволяющие достоверно определять протективный антиген Вас. anthracis в культуральных жидкостях с чувствительностью 5−7 нг/мл. Данный тест видоспецифичен и дифференцирует возбудителя сибирской язвы от других представителей рода Bacillus по признаку токсинообразования.

3. Разработанный метод ИФА с использованием моноклональных антител пригоден для характеристики вакцинных штаммов Вас. anthracis по их способности продуцировать протективный антиген и формировать анти-ПА иммунитет.

4. Предложен метод оценки степени защищенности вакцинированных животных по уровню антител к протективному антигену.

Практические предложения.

Методические рекомендации по идентификации штаммов Вас. anthracis в.

ИФА с помощью моноклональных антител". Утвержденные директором ФГУ.

ВГНКИ академиком РАСХН А. Н. Паниным. Авторы: Романов М. Г., Яковлева.

И.В., Кириллов J1.B., Свиридов В. В. Москва, 2005 г.

Заключение

.

Сибирская язва — одна из опасных остропротекающих инфекционных болезней животных и человека, раз возникнув в какой-либо местности, она может укорениться, сохраняя на многие десятилетия угрозу повторных вспышек. Разработка методов быстрой и точной идентификации возбудителя сибирской язвы актуально для своевременной диагностики заболевания.

Одним из направлений совершенствования лабораторной диагностики возбудителей инфекционных заболеваний является разработка и внедрение в практику новых методов и средств обнаружения патогенных микроорганизмов для своевременного проведения мероприятий по предотвращению распространения заболевания и выявлению очагов потенциальной инфекции. В части создания высокоактивных и высокоспецифичных диагностических препаратов для выявления возбудителя сибирской язвы и его токсических субстанций, одним из перспективных направлений исследований признано конструирование иммунодиагностических препаратов на основе МкАт.

В ряде зарубежных публикаций описано получение МкАт против антигенов трех основных компонентов токсина (летального, отечного и протективного факторов) [82, 83], а также к основному соматическому антигену Вас. anthracis, которые успешно применяют как в диагностических, так и в лечебных целях. Сведения об использовании подобных препаратов в нашей стране в доступной литературе нами не обнаружены.

Целью настоящей работы являлось получение МкАт к диагностически значимым видоспецифичным антигенам сибиреязвенной бациллы и изучение возможности создания на их основе высокоэффективных препаратов, пригодных для анализа проб из объектов внешней среды и клинического материала, а также оценка уровня экспрессии ПА различными вакцинными штаммами in vitro.

В работе использовали шесть вакцинных штаммов Вас. anthracis и пять видов сапрофитных бацилл, полученные из коллекции музея ФГУ ВГНКИ ветпрепаратов. Из штамма 55-ВНИИВВиМ Вас. anthracis, а также пяти основных видов сапрофитных бацилл, которые, по многочисленным литературным данным, имеют максимальный антигенный перекрест с возбудителем сибирской язвы, готовили антигенные препараты: УЗ-дезинтеграт микробных клеток и спор, споры инактивированные 1% формалином, а также культуральные жидкости выше перечисленных бацилл для определения токсических экзокомпонентов. В качестве экспериментальных животных применяли мышей линии BALB/c, массой 18−20 граммов, полученных из питомника РАМН «Крюково». Миеломными партнерами при гибридизации служили клетки мышиной линии P3-X63.Ag8.653. Получение гибридом-продуцентов МкАт к антигенам Вас. anthracis потребовало оптимизации ряда условий проведения различных этапов, в частности, подбор наиболее эффективных схем иммунизации мышей и получения стимулированных спленоцитов, выбор метода скрининга МкАт и т. д.

В качестве последнего был использован непрямой вариант ИФА, удовлетворяющий требованиям специфичности и высокой чувствительности при выявлении минимальных концентраций белка в пробе. Для сенсибилизации планшетов использовали растворы антигенов с концентрацией 1−10 мкг/мл белка.

Сравнение различных схем иммунизации мышей линии BALB/c УЗ-дезинтегратами микробных клеток и спор Вас. anthracis, полученных из штаммов 55-ВНИИВВиМ и СТИ, с эффективностью гибридизации стимулированных этими антигенами спленоцитов с миеломными клетками и выходом активных и стабильных антителопродуцентов позволило установить, что при получении гибридом-продуцентов к соматическим антигенам Вас. anthracis не следует применять длительный цикл иммунизации мышей.

Наиболее эффективный выход клонов-продуцентов анти-ПА Вас. anthracis антител также наблюдался при использовании короткой схеме (не более 3−4 инъекций). Бустерную (заключительную) инъекцию вводили за 3 суток внутривенно или внутрибрюшинно.

Использование более продолжительных по времени схем иммунизации с многократным введением иммуногена и сочетания его с другими антигенными препаратами, например УЗ-дезинтегратом Вас. anthracis или при использовании неполного адъюванта Фрейнда приводило лишь к затягиванию опыта и не обеспечивали достаточного выхода позитивных клонов. Вероятно, при одновременном введении ПА с другими антигенными компонентами, иммунный ответ на балластные белки проявляется в большей степени. При этом антигенная нагрузка на одно животное не должна превышать 100 мкг/мл.

Первоначально в качестве антигенов были использованы дезинтеграты соматических клеток и спор Вас. anthracis. Во всех опытах по получению гибридом-продуцентов МкАт к эпитопам видоспецифичных антигенов клеточной стенки или споровых антигенов, отмечалась быстрая утрата признака антитело продукции большинством из первично позитивных (по результатам тестирования в ИФА) культур. При последующем определении видоспецифичности полученных антител все отобранные образцы пекрёстно взаимодействовали с антигенами многих видав из рода Bacillus как в ИФА так и в ИФлА. На втором этапе работы в качестве антигенов для иммунизации были использованы культуральные жидкости Вас. anthracis (содержащие компоненты токсина) и очищенный протективный антиген для получения антитоксических антител.

В результате, при использовании различных схем иммунизации в шести процедурах гибридизации нами было получено: 4 первичные гибридные культуры к споровым антигенам, 33 к антигенам вегетативной клетки и 85 первичных гибридом к протективному антигену, антитела от 5 из которых были проклонированны и полностью охарактеризованы. Первоначальным источником антител во всех случаях служили супернатанты гибридом, которые с целью концентрирования и увеличения сроков сохранности преципетировали сульфатом аммония при 50% насыщении. Полученные таким в результате препараты использовались для определения изотипа, специфичности и активности отобранных антител.

Таким образом из представленных МкАт требованию видоспецифичности отвечали только антитела полученные в опытах с использованием в качестве иммуногена очищенного ПА, предоставленный сотрудниками ГНЦ п. Оболенск.

Изучение специфичности антител в отношении отдельных субъединиц ПА, проводимое в иммуноблотинге, позволило выявить 4 варианта взаимодействия у 5 моноклональных антител к протективному антигену. Все антитела выявляли цельную молекулу ПА (ПА 83), но по-разному взаимодействовали с отдельными продуктами его деградации.

В ИФА оценивалось взаимодействие МкАт с очищенным ПА при первичном и повторном тестировании, а также проводился анализ видоспецифичности антител с культуральными жидкостями сибиреязвенного штамма 55-ВНИИВВиМ и сапрофитных бацилл. Все полученные МкАт обладали выраженными видоспеспецифичными свойствами и взаимодействовали только с культуральными жидкостями Вас. anthracis, связывая протективный антиген, секретируемый только сибиреязвенными штаммами. Наиболее активным оказалось МкАт ЗА2. Перекрестное взаимодействие, определяемое в ИФА с сапрофитами, было близко к фоновому уровню. Таким образом, реакционная способность и активность МкАт позволяет считать их потенциально пригодными для использования в качестве средства контроля за ПА Вас. anthracis.

Следующей задачей настоящей работы была разработка системы анализов на основе полученных и изученных МкАт для качественного и количественного определения ПА. Для создания подобных иммуноферментных анализов необходимо использовать стандартный препарат выделенного и очищенного антигена, который будет служить референтным образцом. Оценка содержания исследуемого антигена в тестируемых образцах в таком случае осуществляется посредством выражения концентрации вещества через интенсивность иммуноферментной реакции в соответствии с таковой для референс-образца. В качестве стандартного образца мы использовали очищенный ПА что позволило нам разработать и охарактеризовать несколько вариантов количественного ИФА для данного антигена.

Сначала необходимо было подобрать пару антител, не конкурирующих между собой при связывании с антигеном. Для этого были оценена активность приготовленных пероксидазных коныогатов каждого из МкАт к ПА.

Затем в ИФА исследовали попарно конкуренцию за связывание с ПА конъюгатов и немеченых моноклональных антител. Результаты исследования свидетельствуют о том, что отобранные 5 вариантов МкАт распознают 4 различных эпитопа в молекуле ПА и пригодны для двухсайтового связывания молекулы ПА парами МкАт и создания сэндвич-варианта ИФА для выявления ПА.

Далее была оценена способность моноклональных антител сохранять антигенсвязывающую способность после сорбции их на пластике, проанализированы все возможные сочетания отобранных антител для сенсибилизации планшетов и их пероксидазных конъюгатов.

В качестве сенсибилизирующих наилучшими оказались МкАт ЗА2. Другие антитела после адсорбции на пластике теряли антигенсвязывающую способность, что можно объяснить определенной ориентацией молекул сорбированных иммуноглобулинов.

Полученные в этой серии экспериментов результаты свидетельствуют о том, что наибольшей чувствительности удается достичь при использовании в качестве конъюгированных с пероксидазой МкАт 1А1 и 2G5. По данным титрования референтного препарата протективного антигена чувствительность теста составляет 5−7 нг ПА в мл.

В какой мере данная чувствительность достаточна и обеспечивает достоверное выявление ПА в биологическом материале было установлено в оцытах оценки продукции ПА различными вакцинными штаммами сибиреязвенного микроба. Оказалось, что концентрация протективного антигена в культуральной жидкости разных штаммов к 20 часу культивирования микроба достигает 1−2 мкг/мл, что в сотни раз выше чувствительности теста.

Таким образом, можно заключить, что данный вариант анализа пригоден как для характеристики вакцинных штаммов по интенсивности продукции ими протективного антигена, так и для выявления ПА в исследованиях по клонированию гена ПА и получении генноинженерных конструкций как вакцинных препаратов нового поколения.

Следует отметить, что не всегда удается подобрать оптимальную пару моноклонаольных антител для двухсайтового связывания антигена в сендвич-вариантах ИФА. Иногда исследователь располагает лишь одним образцом моноклональных антител требуемой специфичности. Для подобного случая опробован вариант выявления ПА на основе использования только одного варианта МкАт, примененных для сенсибилизации планшетов. В качестве вторых антител была использована антисибиреязвенная поликлональная лошадиная сыворотка. Для проявления реакции был использован пероксидазный конъюгат полученных в лаборатории гибридом моноклональных антител к иммуноглобулину лошади. Эти самым обеспечивалась большая специфичность выявления лошадиных антител по сравнению с применением поликлональных антилошадиных конгъюгатов. Кроме того, при этом варианте тестирования удавалось даже несколько повысить чувствительность реакции за счет связывания с ПА не одной, а большего числа молекул антител.

Заключительным этапом нашей работы явилась оценка содержания антител к протективному антигену в сыворотке морских свинок, вакцинированных различными дозами споровой сибиреязвенной вакцины из штамма 55-ВНИИВВиМ. В соответствии с принятым протоколом испытания через две недели после вакцинации животным вводили разрешающую дозу возбудителя и оценивали выживаемость свинок в группах. Перед заражением у животных отбирали кровь для определения уровня антител к ПА в ИФА. Поскольку для оценки уровня антител необходимо сенсибилизировать планшеты протективным антигеном, выделение и очистка которого весьма сложна и требует особых условий эксперимента, для сенсибилизации планшетов использовали культуральную среду вакцинного штамма Вас. anthracis, протективный антиген из которой заякоривался на планшете через моноклональные антитела ЗА2. Далее в лунки вносили пробы исследуемых образцов сыворотки в различных разведениях и соответствующий антивидовой пероксидазный конъюгат антител.

Анализ данных позволяет заключить, что содержание антител к ПА у вакцинированных животных зависит от дозы веденной вакцины и определяет выживаемость животных при введении разрешающей дозы возбудителя.

Таким образом, можно заключить, что на основе использования полученных моноклональных антител разработаны специфичные и чувствительные иммуноферментные методы качественного и количественного определения протективного антигена сибиреязвенного токсина в биологическом материале и метод выявления антител к протективному антигену в сыворотке вакцинированных животных.