Влияние флавоноидов на перекисное окисление липидов и активность антиоксидантных систем при токсическом поражении печени

Актуальность темы

Печень является барьером на пути фактически всех чужеродных веществ, попадающих в организм человека. Ксенобиотики, всасывающиеся в желудочно-кишечном тракте, поступают в печень, где они биотрансформируются в основном под действием различных форм цитохрома Р450. Дополнительные этапы метаболизма предполагают связывание с глюкуронидом или сульфатом. Образующиеся гидрофильные метаболиты переносятся транспортными белками, находящимися на мембране гепатоцитов, в плазму или желчь и выводятся через почки или желудочно-кишечный тракт. Изменения активности печеночных ферментов (наследственный полиморфизм генов, влияние неблагоприятных экологических факторов, заболевания печени, индукция или ингибирование под действием различных веществ) влечет к повышению или снижению детоксикационной функции печени. На печень, в свою очередь, чужеродные вещества могут оказывать токсическое воздействие, приводящее к токсическому гепатиту, фиброзу и циррозу. Инфекционное поражение печени также является причиной развития печеночно-клеточной недостаточности. Лекарственные средства, как чужеродные вещества, оказывают токсическое действие на печень, и доля гепатотоксических реакций, вызванных лекарствами, составляет 15% от общего числа, причем почти половина из них приходится на парацетамол.

Широкая распространенность острых и хронических заболеваний печени, ранняя инвалидизация лиц трудоспособного возраста ставят поражения печени на одно из первых мест среди заболеваний желудочно-кишечного тракта. Прогноз заболеваний печени во многом зависит от времени появления поздних осложнений при гепатитах, от сохранности функции печени в отдаленный период после перенесенного острого заболевания печени! В патогенезе этих нарушений важную роль играет увеличение уровня перекисного окисления липидов (ПОЛ). В условиях нормы в крови и тканях определяется низкий уровень ПОЛ, который является важным фактором для осуществления функции цитоплазматических мембран и других структур клетки. Однако повышение уровня ПОЛ приводит к нарушению структуры клеточных мембран и функции клеток. При патологии печени отмечается повышение содержания высокоактивных форм молекулы кислорода, которые приводят к оксидативному стрессу и нарушают структуру и функцию клеток, в том числе и гепатоцитов, о чем свидетельствуют многочисленные исследования.

Однако уровень ПОЛ зависит не только от уровня накопления свободных радикалов, но и от функции противоперекисной защиты. Во многих экспериментах установлено, что такими антиоксидантными системами в организме являются ферменты супероксидцисмутазаглутатионпероксидаза, каталаза, а также неферментные факторы защиты, к которым относятся аскорбиновая кислота, витамин Е, глутатион, биофлавоноиды и другие.

Лечение поражений печени антиоксидантными средствами широко исследуется в настоящее время. Изучаются как широко известные препараты расторопши пятнистой (силимар, силимарин и др.), так и исследуется активность новых препаратов — флавоноидов, производных кверцетина, аргинина, хеноксидезоксихолевой кислоты, производных тиобарбитуровой кислоты и других соединений, которые подробно рассмотрены в обзоре литературы. Однако и известные соединения, широко применяющиеся в настоящее время в медицине, изучены не в полной мере.

В этой связи представляются актуальными исследования, но расширению спектра представлений и поиску новых возможностей в использовании лекарственных растений, уже применяющихся в качестве антиоксидантных и гепатопротектрных препаратов, а также выявлению перспективных сырьевых источников для получения фитопрепаратов с обсуждаемой активностью.

Цель И задачи исследования

Цель работы — исследование лекарственных растений и субстанций, содержащих флавоноиды, как эффективных антиоксидантных лекарственных средств.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Получить жидкий экстракт и настойку расторопши пятнистой, установить соответствие показателей качества сырья и препаратов нормативной документации (НД), выделить и проанализировать индивидуальные вещества кверцетин и силибин.

2. Изучить показатели качества препарата «Левзеи экстракт жидкий», их соответствие НД, определить содержание веществ экдистероидной и флавоноидной природы.

3. Изучить интенсивность перекисного окисления липидов, активность ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы в гомогенате печени при токсическом поражении четыреххлористым углеродом.

4. Изучить интенсивность перекисного окисления липидов, активность ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы в гомогенате печени при токсическом поражении четыреххлористым углеродом и одновременном введении этилового спирта.

5. Сравнить влияние карсила, силимара, настойки и жидкого экстракта расторопши на функции антиоксидантных систем в гомогенатах печени на фоне токсического гепатита и установить возможные точки приложения гепатозащитного действия препаратов на процессы перекисного окисления липидов и противоперекисной защиты.

6. Изучить влияние на эти процессы препарата «Экстракт левзеи жидкий» и^{определить} выраженность снижения уровня перекисного окисления липидов в ткани печени при ее токсическом поражении.

7. Изучить влияние индивидуальных флавоноидов дигидрокверцетина, кверцетина, силибина и рутина на отдельные звенья перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты с целью выявления возможности дифференцированного влияния на активность супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы в ткани печени на фоне токсического гепатита.

Научная новизна исследования. Расширен спектр представлений о некоторых лекарственных растениях (расторопша пятнистая, левзея сафлоровидная), содержащих флавоноиды, в плане их использования для получения суммарных препаратов и индивидуальных соединений с антиоксидантными свойствами.

Впервые показано повышение активности супероксиддисмутазы под действием субстанции «Силимар» при токсическом поражении печени.

Впервые установлена антиоксидантная и гепатопротекторная активность препарата «Экстракт лсвзеи жидкий». При его применении снижается уровень перекисного окисления липидов и повышается активность ферментов глутатионпероксидазы и каталазы при токсическом поражении печени. Одним из механизмов гепатопротекторного действия экстракта левзеи является повышение активности ферментов каталазы и глутатионпероксидазы.

Уточнен спектр антиоксидантной активности индивидуальных соединений флавоноидной природы, и на этой основе выявлены зависимости в ряду: химическая структура — действие. Кверцетии увеличивает активность ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы печени при ее токсическом поражении, что является одним из механизмов действия кверцетина. Установлен дополнительный механизм действия силибина, заключающийся в повышении активности фермента глутатионпероксидазы при токсическом гепатите, что является одной из составляющих в реализации гепатопротекторного действия силибина. Показано увеличение активности фермента каталазы под действием рутина при токсическом поражении печени, что также является одним из механизмов гепатопротекторного действия рутина.

Практическая значимость работы. Создана основа для дальнейшей направленной разработки новых лекарственных средств с антиоксидантной активностью на основе сырья расторопши пятнистой и левзеи сафлоровидной. Рекомендовано расширить показания к применению препарата «Экстракт левзеи жидкий» при гепатитах и других поражениях печени в качестве гепатопротектора. Результаты исследования препаратов расторопшн пятнистой и флавоноидов внедрены в учебный и научный процесс на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии и кафедре фармакологии Самарского государственного медицинского университета (акты внедрения от 06.04.2007 г.).

Положения, выносимые на защиту:

1. Соответствие сырья расторопши пятнистой и полученных препаратов экстракт расторопши жидкий и настойка расторопши требованиям нормативной документации.

2. Зависимость антиоксидантной активности от химического строения ряда флавоноидов (флавонолы, флаванонолы, флаволигнаны).

3. Результаты изучения гепатопротекторной активности препаратов расторопши пятнистой — карсила, силимара, настойки расторопши и экстракта расторопши жидкого.

4. Результаты изучения антиоксидантной активности флавоноидовдигидрокверцетина, кверцетина, силибина и рутина.

5. Результаты исследования^{гепатопротекторной} активности экстракта «левзеи жидкого.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Самарского государственного медицинского университета (№ Государственной регистрации 1 200 112 941) и Республиканской программы «Разработка методик качественного и количественного анализа сырья и препаратов лекарственных растений, содержащих фенилпропаноиды и флавоноиды» (№ Государственной регистрации 1 990 007 536).

Апробация работы И публикации. Материалы работы доложены и обсуждены на XXV межрегиональном съезде врачей «Управление качеством здравоохранения через новации» (СамараТольятти, 2005), на IV международной конференции «Медико-социальная экология личности: состояние и перспективы» (Минск, 2006), на XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006), на XXXIX итоговой научно-практической конференции научно-педагогического состава Самарского военно-медицинского института (Самара, 2006), на XXIII International Conference on Polyphenols (Winnipeg-Canada, 2006).

Основное содержание работы опубликовано в 7 научных работах.

Объем И Структура работы. Диссертационная работа изложена на 180 страницах машинописного текста, содержит 59 таблиц, 12 рисунков. Диссертация состоит из введения, литературного обзора (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), глав 3 и 4, отражающих результаты собственных исследований и их обсуждение (глава 5), общих выводов и списка литературы, включающего 273 источника, из которых 119 — на иностранных языках.

выводы.

1. Осуществлена сравнительная оценка уровня содержания флавоноидов в лекарственных средствах из плодов расторопши пятнистой (экстракт расторопши жидкий, настойка расторопши) и корневищ левзеи сафлоровидной (экстракт левзеи жидкий), представленных флаволигнанами, флаванонолами и флавонолами.

2. С использованием УФ-, ЯМР-спектроскопии и физико-химических методов установлено химическое строение силибина, выделенного из плодов расторопши пятнистой, и кверцетина, полученного кислотным гидролизом из рутина.

3. При интоксикации четыреххлористым углеродом в ткани печени статистически достоверно повышается перекисное окисление липидов в 2,0 раза, и снижается антиоксидантная защита, что проявляется в уменьшении активности ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы (каталазы в 1,3 раза, супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы в 1,7 раза).

4.

Введение

спирта одновременно с четыреххлористым углеродом приводит к повышению перекисного окисления липидов в 1,8 раза, и снижению исследуемых факторов ферментной защиты (каталазы в 1,2 раза, супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы в 1,3 раза).

5. Карсил в дозе 25 мг/кг силимарина при введении в желудок крысам вызывает снижение перекисного окисления липидов в 1,4 раза, значительно повышает (в 1,8 раза) активность супероксиддисмутазы, проявляет тенденцию к повышению активности каталазы и глутатионпероксидазы. Силимар в дозе 100 мг/кг вызывает снижение перекисного окисления липидов в 1,2 раза, значительно повышает (в 1,4 раза) активность супероксиддисмутазы, проявляет тенденцию к повышению активности каталазы и глутатионпероксидазы. л.

6. Экстракт расторопши жидкий в дозе 150 мг/кг снижает содержание малонового диальдегида в гомогенате в 1,2 раза, проявляет тенденцию к повышению активности ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы. Настойка расторопши в дозе 150 мкл/кг снижает содержание малонового диальдегида в гомогенате в 1,3 раза, проявляет тенденцию к повышению активности ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы.

7. Препарат «Экстракт левзеи жидкий» в дозе 150 мкл/кг обладает антиоксидантным действием при токсическом повреждении печени. Он снижает количество малонового диальдегида в гомогенате ткани печени в 1,2 раза, в 1,3 раза повышает активность ферментов глутатионпероксидазы и каталазы, что позволяет использовать его в качестве гепатопротектора при заболеваниях печени.

8. Выявлены зависимости антиоксидантной активности от химической структуры. Флавонол кверцетин в дозе 25 мг/кг снижает перекисное окисление липидов в печени крыс в 1,3 раза и усиливает противоперекисную защиту за счет повышения активности ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы в 1,7 раза, 1,3 раза и 1,3 раза соответственно. Его гликозид рутин в дозе 25 мг/кг оказывает антиоксидантное действие, проявляющееся в снижении содержания малонового диальдегида в гомогенате (в 1,3 раза), повышает активность каталазы (в 1,2 раза), проявляет тенденцию к повышению активности ферментов супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы.

9. Флаванонол дигидрокверцетин в дозе 25 мг/кг снижает содержание малонового диальдегида в гомогенате в 1,5 раза, проявляет тенденцию к повышению активности ферментов супероксиддисмутазы, каталазы и.

—————-глутатионпероксидазы.

Ю.Флаволигнан силибин в дозе 25 мг/кг снижает перекисное окисление липидов в 1,3 раза, повышает активность супероксиддисмутазы в 1,5 раза и глутатионпероксидазы в 1,3 раза, проявляет тенденцию к повышению активности каталазы.