Стимуляция роста нервных волокон стромальными клетками жировой ткани и дифференцировка этих клеток в нейральном направлении

Физиологическое обновление нервной ткани взрослого организма происходит благодаря пролиферации и дифференцировке нейральных стволовых клеток в центральной и периферической нервной системе. Однако при обширных повреждениях мозга в результате инсультов и травм, при нейродегенеративных заболеваниях, а также при утрате значительной части нерва, активности нейральных стволовых клеток оказывается недостаточно для полноценного восстановления нервной ткани. Так, повреждения нервного волокна протяженностью более 3 см индуцируют его дегенерацию [1], поэтому в таких случаях восстановления иннервации ткани-мишени не происходит. В свою очередь ткань, не получающая нервные импульсы в течение длительного времени, также подвергается дегенерации [2], поэтому скорость восстановления нервного волокна играет решающую роль в сохранении функциональной ткани. Поскольку существующие методы медикаментозной терапии и классической нейрохирургии не приносят желаемых результатов, а использование донорских нервных трансплантатов ограничено в связи с иммунологическими реакциями на чужеродные ткани, поиск подходов для стимуляции роста нервных волокон и восстановления клеток центральной нервной системы является актуальной темой в медицинской биологии.

Эффективным подходом для лечения неврологических заболеваний может оказаться трансплантация клеток, которые способны не только встроиться в поврежденную ткань, по и долговременно стимулировать репарацию этой ткани путем секреции нейротрофических и других факторов роста. В начале 80-х годов для леченияневрологических заболеваний была предложена клеточная терапия. В частности, для репарации поврежденного спинного мозга была использована трансплантация эмбриональных стволовых клеток, мезенхимальных клеток костного мозга, нейральных стволовых клеток [36]. Однако применение аллогенных клеток для трансплантации может приводить к переносу инфекций от донора реципиенту, а также вызывать реакцию отторжения со стороны иммунной системы реципиента. Поэтому возможно, более эффективной станет трансплантация аутологичных клеток. Терапия собственными (аутологичными) клетками уже находит применение для лечения ишемических заболеваний [7], невропатий [8], для замещения костных и хрящевых дефектов, а также для восстановления кожного покрова после ожогов. Исследования последних лет показали огромный потенциал клеточной трансплантологии для восстановления иннервации после повреждения периферических нервов [9]. Немаловажное значение иннервация имеет для ишемизированных тканей, так как известно, что рост сосудов зависит от роста нервов [10].

С точки зрения регенерации поврежденных нервных окончаний наиболее изученными в клеточной терапии являются эмбриональные стволовые клетки [11], гемопоэтические стволовые клетки [12], нейральные предшественники [13−15], мезенхимальные клетки костного мозга [16−18] и культивированные предшественники эндотелиальных клеток [19−21].

Несмотря на воодушевляющие эффекты применения этих клеток сложность и болезненность их получения в достаточном количестве, а также препятствии их использования по этическим причинам (в случаеэмбриональных стволовых клеток) приводят к необходимости поиска других источников мультипотентных клеток.

Доступным источником аутологичных прогениторных клеток оказалась жировая ткань. Ее строма содержит клетки по своему фенотипу, экспрессии генов и дифференцировочным способностям сходные с хорошо изученными мезенхимальными прогениторными клетками костного мозга. Но в отличие от клеток костного мозга, стромальные клетки жировой ткани (СКЖТ) возможно получить в достаточном количестве с помощью ферментативной обработки жировой ткани и последующего фракционирования полученной суспензии практически для каждого пациента. Полученные таким образом СКЖТ способны адгезировать на пластик и пролиферировать в культуре, а значит могут быть наращены, а количестве, необходимом для трансплантации.

Стромальные клетки жировой ткани способны дифференцироваться во многие типы клеток и секретировать ангиогенные и антиапоптотические факторы [22], а также нейротрофические [23, 24] и другие факторы роста [25]. На различных моделях ангиогенеза in vitro и in vivo было показано, что эти клетки стимулируют рост сосудов [26]. Стимулирующий эффект СКЖТ на рост сосудов опосредован их секреторной активностью, а также способностью этих клеток встраиваться в периэндотелиальное пространство новообразованных сосудов [26].

В то же время, известно, что рост сосудов сопряжен с ростом нервовэти процессы имеют общие сигнальные молекулы и механизмы регуляции [27]. Клетки эндотелия секретируют нейротрофический фактор BDNF и привлекают растущие нервные окончания [28], а шванновские клетки периферических нервов секретируют VEGF, тем самымактивизируя ангиогенез [29]. Сопряженность нервов и сосудов подтверждается и тем фактом, что все крупные сосуды иннервируются, а нервные волокна кровоснабжаются. Поэтому способность СКЖТ стимулировать ангиогенез дает основания предполагать, что эти клетки могут стимулировать и рост нервов.

В то же время, есть данные, что эти клетки могут дифференцироваться в нейральном направлении и способствуют репарации повреждений спинного мозга [30−32].

Цель данной работы заключалась в исследовании способности стромальных клеток жировой ткани стимулировать рост нервных волокон, экспрессировать нейротрофические факторы и их рецепторы, а также дифференцироваться в нейральном направлении.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие экспериментальные задачи:1. Проанализировать влияние стромальных клеток жировой ткани на рост нервных волокон in vivo в матригеле.

2. Оценить экспрессию нейротрофических факторов роста стромальными клетками жировой ткани при культивировании в условиях нормального и сниженного содержания кислорода.

3. Изучить экспрессию рецепторов нейротрофических факторов роста стромальными клетками жировой ткани при культивировании в условиях нормального и сниженного содержания кислорода.

4. Подобрать условия индукции нейральной дифференцировки стромальных клеток жировой ткани in vitro.

5. Оценить влияние нейральной дифференцировки на экспрессию нейротрофических факторов роста in vitro, их способностьстимулировать рост нервных волокон в матригеле in vivo и жизнеспособность этих клеток при трансплантации в нервную ткань.

выводы.

1. Впервые обнаружено, что стромальные клетки жировой ткани (СКЖТ), известные активаторы ангиогенеза, стимулируют также рост нервных волокон.

2. Показано, что СКЖТ секретируют как ангиогенные, так и нейротрофические (ВБ№, N0?, СО№) факторы, причем гипоксия активирует как экспрессию этих факторов, так и стимулирующее влияние этих клеток на рост нервных волокон.

3. Выявлена субпопуляция СКЖТ, экспрессирующих маркерные гены нейральной дифференцировки. Эти клетки имеют на поверхности рецепторы к ряду нейротрофических факторов.

4. Культивирование СКЖТ с ВБОТ или ретиноевой кислотой в сочетании с ДНК-деметилируюгцим агентом 5-азацитидином повышает экспрессию маркеров нейральной дифференцировки в этих клетках.

5. Индукция нейральной дифференцировки СКЖТ, вызываемая этими факторами, повышает экспрессию нейротрофических факторов (ВОКР, N0?, ООИР), а также увеличивает жизнеспособность СКЖТ при трансплантации в головной мозг.