Формирование внутренних градиентов pH в ионообменной хроматографии: моделирование и экспериментальная проверка

Актуальность работы. Среди гибридных методов в аналитической химии в последние годы, широкое распространение получили" ионообменная, комплексообразова+ельная и другие варианты жидкостной хроматографии. Развитие и совершенствование этих методов связано с расширяющимся кругом определяемых компонентов, анализируемых объектов, возможностью сочетания хроматографии с. другими методами анализа. В 1979 г. Слайтерманом был создан новый метод препаративного разделения и определения белков на ионообменных колонках, основанный на элюировании с внутриколоночным (внутренним) градиентом рН, -хроматофокусирование. Выбор компонентов хроматографической системы сорбента, стартового раствора и элюента — в методе хроматофокусирования в большинстве случаев основан на эмпирическом, подходе, а существующие модели формирования внутреннего градиента рН дают лишь крайне упрощенное представление, о системе. Многие характерные участки градиента рН невозможно объяснить с помощью существующих моделей. В то же время стоимость химических реактивов, используемых для получения внутренних градиентов рН, достаточно высока. Особенно это относится к буферным элюентам, составленным из синтетических полиамфолитов,. свойства которых могут быть плохо воспроизводимы. Кроме того, подобные элюенты под действием бактерий быстро разрушаются. В целом это приводит к высокой стоимости. метода хроматофокусирования при его рутинном использовании. В связи с этим актуально изучение процессов формирования внутренних градиентов рН и создание физико-химической и математической модели, описывающей все особенности градиента. На основании полученных закономерностей, связывающих форму внутреннего градиента рН с параметрами хроматографической системы, можно будет подбирать элюенты, составленные из небольшого числа простых протолитов. Кроме того, необходимо создать программу или пакет программ, позволяющих до начала эксперимента подобрать его условия, что сэкономит время, химические реактивы и снизит стоимость анализа в целом, а также поможет исследователю подобрать градиент требуемой формы. .

Цель работы: разработка методов расчета профилей внутренних градиентов рНпоиск закономерностей, связывающих форму градиента рН с параметрами системыпоиск дешёвых элюентов, составленных из небольшого числа простых протолитов, для получения рабочих градиентов рН требуемой формысоздание информационной базы данных по внутренним градиентам рН.

Достижение поставленной цели предусматривало решение следующих задач:

1. Анализ литературных данных по формированию внутренних градиентов рН в хроматофокусировании (теоретические принципы, модельные представления и практическое применение);

2. Разработка физико-химической и математической модели формирования’внутреннего градиента рН, учитывающей гомогенные и. гетерогенные химические равновесия, протекающие в системе, и описывающей все основные особенности профиля градиента рН;

3. Анализ модели, т. е. выявление закономерностей, связывающих форму' градиента с параметрами модели;

4. Получение экспериментальных значений отдельных параметров модели (констант протонирования аминогрупп для сорбентов АР-БЮг, Еп-ЭЮг и Те^еп-БЮг' коэффициентов ионного обмена хлорида на анионы слабых кислот и коэффициентов обмена протона на натрий на сорбированных дикарбоновых кислотах);

5. Проверка адекватности модели литературным и собственным экспериментальным данным;

6. Разработка аппаратурного оформление для получения экспериментальных внутренних градиентов рН;

7. Поиск дешевых элюентов, составленных из небольшого числа простых протолитов;

8. Разработка пакета программ, позволяющих до начала эксперимента подобрать его условия (сорбент, стартовый раствор, элюент, требуемая форма градиента рН), для экономии времени и стоимости химического анализа. Научная новизна. Найдены основные закономерности формирования внутриколоночных градиентов рН в хроматофокусировании и требования к сорбентам и составу подвижных фаз стартового раствора и элюента.

В качестве сорбентов для получения квази-линейных градиентов рН исследованы' кремнеземы с привитыми олигоэтиленаминами: Еп-вЮг, .??еп-вЮг и Те^еп-вЮгБыли определены константы протонирования аминогрупп этих сорбентов, а также коэффициенты ионного обмена хлорида на анионы органических кислот и коэффициенты катионного обмена протона на натрий на сорбированных дикарбоновых кислотах.

Изучено влияние природы и состав стартового раствора, и элюента,-составленного из простых протолитов, на форму градиента рН. Впервые показано влияние ионной силы на форму градиента рН.

Разработана физико-химическая и математическая модель формирования внутренних градиентов рН в хроматофокусировании при использовании смеси протолитов в качестве элюента, учитывающая ионообменные равновесия в гетерогенной динамической системе, а также полиэлектролитные и полифункциональные свойства сорбента. Модель описывает все известные из экспериментальных данных характерные участки на профиле градиента рН.

Профили градиентов рН, рассчитанных на основе модели, хорошо согласуются с полученными экспериментально в аналогичных условиях. Модель впервые позволила объяснитьобразование так называемых «аномальных» участков на. профиле градиента (увеличение рН эффлюента выше значения рН стартового раствора), что в принципе невозможно было объяснить с помощью моделей, учитывающих только буферные свойства системы, и лишь частично — с помощью модели локальных равновесий Фрея*. Frey D.D., Barnes A., Strong J. Numerical studies, of multicomponent chromatography using pH-gradient.//AlChE Journal. 1995. V.41 N5. P.1171−1183.

Практическая значимость работы. Даны практические рекомендации по созданию Дешевых элюентов простого состава и способы управления формой градиента рН за счет изменения ионной силы подвижных фаз. Показана возможность хроматографического разделения модельной смеси аминокислот и изоформ плазминогена. Создан пакет программ для операционной системы Windows 95, 98 — Acid Base Calculator, Cfocusing, Alpha и база данных «pH-gradients». Эти программы позволяют до начала эксперимента подобрать его условия (т.е. сорбент, состав стартового раствора и элюента, и требуемую для разделения исследуемых веществ форму градиента рН).

Положения, выносимые на защиту:

1. Физико-химическая и математическая модель формирования внутренних градиентов рН в хроматофокусировании при использовании смеси протолитов в качестве элюента, учитывающая ионообменные равновесия в гетерогенной динамической системе, а также полиэлектролитныё и полифункциональные свойства сорбента.

2. Результаты моделирования внутренних градиентов рН и их сравнение с экспериментальными данными.

3. Влияние ионной силы и слабого основания на профиль градиента рН.

4. Коэффициенты ионного обмена хлорида на анионы органических кислот и коэффициенты катионного обмена протона на натрий на сорбированных дикарбоновых кислотах.

5. Способы получения квази-линейных градиентов рН с использованием элюентов на основе небольшого числа дешевых реагентов простого состава.

6. Программное обеспечение для расчета внутренних рН-градиентов, рН и ионной силы смесей кислот и оснований в водных растворах, степени протонирования сорбента, а также информационная база данных по модельным и экспериментальным градиентам рН.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на VIII Всероссийской конференции «Физико-химические основы и практическое применение ионообменных процессов» (Воронеж, 1996 г.) — Международном конгрессе по аналитической химии (ICAC-97) (Москва, 1997 г.) — Международной конференции студентов и аспирантов по.

1997 г.) — Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-98» (Москва, МГУ, 1998 г.) — Всероссийском симпозиуме по теории и практике хроматографии и электрофореза (Москва, 1998 г.) — Всеукраинской конференции по аналитической химии (Ужгород, 1998 г.) — 2-й Всероссийской конференции по истории и методологии аналитической химии (ИМАХ-2) (Москва, 1999 г.) — Всероссийском симпозиуме по химии поверхности, адсорбции и хроматографии (SCAC'99) (Москва, 1999 г.) — VII Всероссийской конференции «Органические реагенты в аналитической химии» (Саратов, 1999 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 статей и 9 тезисов докладов:

1. A.B. Гармаш, А. Б. Тессман, A.B. Иванов, П. Н. Нестеренко. Физико-химическая и математическая модели формирования внутреннего линейного градиента pH в хроматографической колонке. // Журн. физич. химии. 1997. Т. 71. N 9. С. 1683−1689.

2. A.B. Гармаш, А. Б. Тессман, A.B. Иванов, П. Н. Нестеренко. Расчет внутренних градиентов pH. //Журн. физич. химии. 1997. Т. 71. N 10. С. 1872−1876.

3. A.B. Гармаш, А. Б. Тессман, A.B. Иванов, П. Н. Нестеренко. Расчет влияния инертных компонентов элюента на градиент pH при хроматофокусировании. //Журн. физич. химии. 1997. Т. 71. N 11. С. 2054;2059.

4. A.V. Garmash, A.B. Tessman, A.V. Ivanov, P.N. Nesterenko. Modeling of internal pH-gradient in chromatofocusing // Fresenius' J. Anal. Chem. 1998. V. 361. N3. P. 274−275.

5. А. Б. Тессман, A.B. Иванов, E.B. Курочкина, A.B. Гармаш, П. Н. Нестеренко. Моделирование внутренних градиентов pH в хроматофокусировании. // Теория и практика сорбционных процессов. Воронеж: ВГУ, 1998. Т. 22. С.347−358.

6. А. Б. Тессман, A.B. Иванов, A.B. Гармаш, П. Н. Нестеренко. Образование аномальных участков внутреннего градиента pH в хроматофокусировании // Теория и практика сорбционных процессов. Воронеж: ВГУ, 1999. Т. 23. С.20−23.

7. А. Б. Тессман, A.B. Иванов, П. Н. Нестеренко, A.B. Гармаш. Применение слабых органических протолитов для формирования градиента pH в хроматофокусировании. // Журн. физич. химии. 1999. Т. 73. N 8. С. 1476−1279.

8. A.B. Иванов, А. Б. Тессман. Непрерывный контроль pH эффлюента в хроматографии с градиентом pH. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер.2. Химия. 1999. Т.40. N4. С.241−244.

9. A.B. Иванов, А. Б. Тессман, П. Н. Нестеренко. Применение кремнезема с привитыми группами оксипролина для одновременного ионохроматографического определения натрия, хлорида и анионов дикарбоновых кислот. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер.2. Химия, (в печати).

10. А. Б. Тессман, A.B. Иванов, П. Н. Нестеренко, A.B. Гармаш, В. К. Рунов. Аномальные участки на профиле внутреннего градиента pH в хроматофокусировании. //Журн. физич. химии. 2000. Т.74. N6. С. 10 691 072.

11. А. Б. Тессман, A.B. Иванов, М. С. Вакштейн. Влияние ионной силы и слабого основания на профиль градиента pH в хроматофокусировании: теоретические принципы и экспериментальная проверка. //Журн. физич. химии. 2000. (в печати).

12. A.B. Гармаш, А. Б. Тессман, A.B. Иванов, П. Н. Нестеренко. Математическое моделирование внутреннего градиента pH в хроматофокусировании. / Тез. докл. VIII Всесросс. конф. «Физико-химические основы и практическое применение ионообменных процессов». Воронеж: ВГУ, 1996. С.8−9.

13. A.V.Garmash, A.B.Tessman, A.V. Ivanov, P.N. Nesterenko. Modeling of internal pH-gradient in chromatofocusing. / International Congress on Analytical Chemistry. Moscow, 1997. E-19.

14. А. Б. Тессман. Расчет кислотно-основных равновесий с применением компьютерного программирования. / Тез. докл. Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам Ломоносов-98. М: МГУ, 1998. С. 6.

15. A.B. Иванов, П.H. Нестеренко, A.B. Тессман, A.B. Гармаш. Формирование внутренних градиентов pH с использованием слабых органических протолитов и аминокислот. / Тез. докл. Всеросс. симп. по теории и практике хроматографии и электрофореза. М.: Научный совет по хроматографии РАН. 1999. С. 48.

16. A.B. Гармаш, A.B. Тессман, A.B. Иванов, П. Н. Нестеренко. Математическое моделирование внутреннего градиента pH в хроматофокусировании. / Тез. докл. Всеукр. конф. по аналитической химии. Ужгород, 1998. С. 43.

17. A.B. Иванов, A.B. Тессман, П. Н. Нестеренко, A.B. Гармаш. Определение коэффициентов катионного обмена на сорбированных дикарбоновых кислотах и их использование при расчетах градиентов pH. / Тез. докл. Всеросс. симп. по химии поверхности, адсорбции и хроматографии (SCAC'99). М.: Научный совет по хроматографии РАН, 1999. С. 107.

18. А. Б. Тессман, А. В. Иванов, П. Н. Нестеренко, А. В. Гармаш. Образование «аномальных» участков внутреннего градиента pH в хроматофокусировании. / Тез. докл. Всеросс. симп. по химии поверхности, адсорбции и хроматографии (SCAC'99). М.: Научный совет по хроматографии РАН, 1999. С. 108.

19. А. Б. Тессман, А. В. Иванов. Исторические и методологические аспекты автоматизации расчета кислотно-основных равновесий. / Тез. докл. 2-ой Всеросс. конф. по истории и методологии аналитической химии (ИМАХ-2) М.: ИОНХ РАН, 1999. С. 99.

20. А. В. Иванов, П. Н. Нестеренко, А. Б. Тессман. Применение ионообменных свойств кремнезема с привитыми группами пролина и оксипролина в хроматографии. / Тез. докл. VII Всеросс. конф. «Органические реагенты в аналитической химии». Саратов: СарГУ. 1999. С. 222.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, шести глав экспериментальной части, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 158 страницах машинописного текста, включает 70 рисунков и 14 таблиц.

Список литературы

содержит 110 работ зарубежных и отечественных авторов.

Выводы.

1. Разработана физико-химическая и математическая модель формирования внутреннего градиента рН, учитывающая гомогенные и гетерогенные химические равновесия, протекающие в хроматографической системе. Модель описывает все известные из экспериментальных данных характерные. участки на профиле градиента рН.

2. Установлены зависимости, связывающие протолитические свойства сорбентов на основе кремнезема с привитыми олигоэтиленаминами с их химической природой и полиэлектролитными свойствами.

3. Получены экспериментальные, значения отдельных параметров модели (константы, протонирования аминогрупп для. сорбентов En-Si02, Dien-Si02 и Tetren-Si02' коэффициенты ионного обмена хлорида на анионы слабых кислот К (С1,А) и коэффициенты обмена протона, на натрий К (Н, Na) на сорбированных дикарбоновых кислотах).

4. Изучено влияние природы и состава стартового раствора и элюента, составленного из простых, протолитов, на форму градиента рН. Впервые показано влияние ионной силы подвижных фаз на форму внутреннего градиента рН. .

5. На основание модели впервые объяснено, образование так называемых «аномальных» участков на профиле градиента (увеличение рН эффлюента выше значения рН стартового раствора),.

6. Предложены способы получения квази-линейных градиентов рН с использованием простых элюентов на основе нескольких дешевых компонентов.

7. Создан пакет программ для операционной системы Windows 9x/NT, позволяющий до начала эксперимента подобрать его условия (т.е. сорбент, состав стартового раствора и элюента, и требуемую для разделения исследуемых веществ форму градиента рН) для экономии времени и стоимости химического анализа.