Роль пространственной организации геномного локуса в феномене переключения экспрессии глобиновых генов

Ядерная ДНК высших эукариот на протяжении всего клеточного цикла находится в составе сложного нуклеопротеидного комплекса, называемого хроматином. В его состав входит множество белков, осуществляющих архитектурные, каталитические и регулятор-ные функции (Carey, 2005). Хроматин является относительно лабильной структурой, что обуславливает возможность перемещения участков генома в пространстве ядра. Движущие силы этих перемещений на сегодняшний день остаются неизвестны, однако ясно, что взаимное позиционирование участков ДНК, иногда разделённых расстоянием в сотни тысяч пар оснований, является одним из ключевых событий в регуляции экспрессии генов (Soutoglou and Misteli, 2007; Kumaran et al., 2008). На множестве изученных модельных систем показано, что пространственное взаимодействие промоторов тканеспецифичных генов и регуляторных элементов критически важно для запуска транскрипции на строго определённых этапах онтогенеза, и только в тех клеточных типах, где данные гены должны быть активны.

Согласно современным представлениям, геном высших эукариот имеет доменное строение. Геномный домен — это участок ДНК, содержащий один или несколько генов, а также регуляторные и пограничные (не всегда) элементы, контролирующие хроматиновый статус и транскрипцию внутри домена. Следует отметить, что часто домен не является чётко локализованным модулем — регуляторные элементы могут располагаться и на значительном расстоянии от подконтрольных промоторов, однако, и в этом случае понятие домена как некоторой обособленной функциональной единицы генома имеет смысл. В результате диффузии или энергозависимых процессов удалённые друг от друга элементы домена (промоторы, энхансеры/сайленсеры, инсуляторы, области прикрепления к ядерному матриксу и т. д.) оказываются сближенными в пространстве ядра в структурах, получивших название «хроматиновые хабы» (Laat and Grosveld, 2003). Эти ДНК-белковые комплексы, образованные при участии тканеспецифичных и конститутивных факторов транскрипции, являются структурной основой для формирования открытого инициаторно-го комплекса на промоторе и успешной активации транскрипции, и/или преодоления элонгационной паузы (Core et al., 2012). Нет данных структурного анализа, свидетельствующих в пользу того, что хабы поддерживаются за счёт прямых белок-белковых взаимодействий. Возможно, детектируемые дальние взаимодействия в геноме есть результат лишь некоторой сближенности участков интерфазной хромосомы внутри хромосомной территории (Cremer et al., 2006). Однако, как бы там ни было, нокдауны по ряду факторов транскрипции, когезину и белку CTCF (инсуляторный белок позвоночных и D. melanogas.

— 5 ter) приводят к тому, что существующие хроматиновые хабы значительно меняют свою структуру или исчезают вовсе (Degner et al., 2011).

Понятие хроматинового хаба тесно связано с понятием транскрипционных фабрик — особых микрокомпартментов ядра, в которых происходит активная транскрипция, осуществляемая иммобилизованными комплексами РНК-полимераз (Bortle and Corees, 2012). Хотя внутреннее устройство транскрипционных фабрик изучено довольно слабо, можно представить, что каждая отдельная фабрика — это крупный хроматиновый хаб (или их множество), в котором могут быть сближены промоторы и регуляторные элементы сразу нескольких геномных локусов. Структура каждой фабрики, как и хроматинового хаба отдельно взятого геномного домена, представляется динамичной: на разных этапах онтогенеза и в зависимости от спектра сигналов, получаемых клеткой извне, состав фабрики может меняться. Одни промоторы оказываются инактивированы и теряют связь с фабрикой, перемещаясь в другие (к примеру, гетерохроматиновые) компартменты ядра, а их место занимают те промоторы, которые теперь должны быть активированы.

На сегодняшний день большая часть подобных описаний архитектуры транскрипционной машинерии эукариот во многом остаётся спекулятивной. Хабы и функционирующие транскрипционные фабрики не удаётся наблюдать напрямую, и все выводы, касающиеся их устройства и работы, сделаны по косвенным данным. Однако есть все основания полагать, что центральное утверждение в модели хроматинового хаба и транскрипционной фабрики — необходимость пространственной сближенности в хроматине регуля-торных элементов и подконтрольных промоторов — всё же является верным.

Одними из самых популярных объектов в изучении регуляции транскрипции эука-риотических генов на уровне хроматина являются домены глобиновых генов позвоночных животных. Исследования этих участков генома имеют длительную историю и принесли немало крупных открытий, ß—глобиновый ген кролика был первым, который удалось успешно трансфецировать в эукариотические клетки, где была изучена его экспрессия под влиянием его собственных регуляторных элементов. Исследования на мышах с использованием генетических конструкций на основе человеческого домена бета-глобиновых генов в 1980;х гг. привели к открытию зоны контроля локуса, или LCR {англ. Locus Control Region) — позитивного регуляторного элемента, обеспечивающего экспрессию трансгена в эндогенной позиции независимо от места интеграции в геном, и в прямой зависимости от числа копий. На модели домена альфа-глобиновых генов был исследован феномен полнодоменной транскрипции, которая необходима для поддержания хроматинового статуса домена, и является, судя по всему, источником длинных некодирующих РНК, участвующих в формировании ядерного матрикса (Recillas-Targa and Razin, 2001; Razin et al., 2004). На примере глобиновых доменов были изучены свойства инсуляторов — особых генетических элементов, препятствующих распространению гетерохроматина по ДНК, а также блокирующих действие энхансера на промотор (Valadez-Graham et al., 2004). В частности, 5″ -инсулятор домена бета-глобиновых генов кур стал первым инсулятором, открытым у позвоночных животных (Chung et al., 1993).

Полномасштабное исследование домена бета-глобиновых генов кур было начато ещё в середине XX века, и за прошедшие десятилетия этот домен стал классическим модельным объектом в изучении регуляции транскрипции на уровне хроматина. В многочисленных работах были получены обширные сведения о роли зоны контроля локуса в механизмах активации транскрипции глобиновых генов в ходе онтогенеза, о функциональном взаимодействии управляющих элементов домена и роли эпигенетических модификаций в регуляции транскрипции (Ульянов, Гаврилов, 2012). Тем не менее, полностью отсутствуют данные о том, какова пространственная конфигурация домена в эритроидных клетках на разных стадиях онтогенеза, и является ли она эритроидспецифичной, или же спектр взаимодействий элементов домена не зависит от типа ткани.

На модели домена альфа-глобиновых генов кур были выполнены исследования по изучению влияния локальной структуры хроматина на процесс транскрипции и регуляцию активности промоторов удалёнными регуляторными элементами (Разин, Юдинкова, 2007). В более ранних работах нашей лаборатории довольно подробно охарактеризована структурно-функциональная организация домена, в частности механизмы инициации транскрипции входящих в его состав взрослых а°- и аА-глобиновых генов (Gavrilov and Razin, 2008). Изучена пространственная конфигурация домена в раковых куриных эритробластах, индуцированных к терминальной дифференцировке, и в эритроидных клетках на поздних стадиях эмбрионального развития. Выяснено, какие из регуляторных элементов, картированных в пределах домена, взаимодействуют в этих типах клеток с промоторами взрослых альфа-глобиновых генов и обуславливают их активный транскрипционный статус. Однако относительно эмбрионального альфа-глобинового гена я таких данных до сих пор получено не было. Неизвестно, необходимы ли для его экспрессии в геноме какие-либо си-действующие регуляторные элементы.

Также в пределах доменов глобиновых генов кур, как и во всех изученных глобиновых доменах теплокровных животных, был открыт феномен переключения программы экспрессии, который заключается в том, что в ходе онтогенеза происходит поочерёдная активация транскрипции глобиновых генов сначала эмбрионального, затем взрослого типа (Stamatoyannopoulos, 2005). Механизмы этого переключения на сегодняшний день во многом остаются не выясненными. Известно, что переключение сопровождается эпигенетиче.

— 7 ской инактивацией эмбриональных промоторов, расположенных ближе к зоне контроля локуса. Есть основания полагать, что это критически важный этап в переключении программы экспрессии, при нарушении которого не происходит полноценной активации промоторов взрослых глобинов (Beauchemin and Trudel, 2008). Однако не известно, является ли переключение неизбежным следствием только инактивации эмбриональных генов, которые теперь выбывают из конкуренции за регуляторные участки, или же переключение происходит в результате гораздо более масштабных событий внутри домена? В данной работе мы изучали пространственную организацию доменов альфаи бета-глобиновых генов кур в ряде клеточных типов с целью выяснить, изменяется ли спектр пространственных взаимодействий регуляторных элементов и промоторов внутри доменов при переключении программы экспрессии. Для ответа на этот вопрос были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Проанализировать спектр пространственных взаимодействий внутри домена альфа-глобиновых генов кур до момента переключения экспрессии (в эритроид-ных клетках 3-дневных куриных эмбрионов). Сравнить результаты с ранее полученными данными о конфигурации домена в эритроидных клетках 10-дневных эмбрионов, после переключения программы экспрессии.

2. Охарактеризовать спектр пространственных взаимодействий внутри домена бе-та-глобиновых генов кур в эритроидных клетках до и после переключения экспрессии.

3. Охарактеризовать спектр пространственных взаимодействий внутри домена бе-та-глобиновых генов кур в клетках неэритроидного происхождения. Выяснить, существуют ли взаимодействия структурно-функциональных элементов домена, не являющиеся эритроидспецифичными.

Для решения поставленных экспериментальных задач мы использовали метод фиксации конформации хромосомы, или ЗС {англ. Chromosome Conformation Capture), ранее разработанный для детектирования пространственных взаимодействий участков ДНК в хроматине (Dekker et al., 2002).

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

выводы.

1. Продемонстрировано, что в эритроидных клетках домены альфаи бета-глобиновых генов кур имеют сложную пространственную конфигурацию, обеспечивающую возможность прямого взаимодействия промоторов и различных регуляторных элементов. Комплексы регуляторных элементов (хроматиновые хабы) собираются как до, так и после переключения программы экспрессии глобиновых генов, причем до переключения экспрессии характерным является присутствие нескольких равновесных конфигураций хроматиновых хабов.

2. Показано, что переключение экспрессии глобиновых генов у кур коррелирует со значительными изменениями структуры активаторного хроматинового блока домена бета-глобиновых генов, в то время как организация активаторного хроматинового блока домена альфа-глобиновых генов существенно не изменяется.

3. Продемонстрировано, что активные промоторы эмбрионального альфа (я) — и бета-глобинового (е) генов работают изолировано, не взаимодействуя с удаленными регуляторными элементами доменов.

4. Показано, что домен бета-глобиновых генов кур в эритроидных клетках 3- и 9-дневных эмбрионов расположен в изолированной петле хроматина, удерживаемой посредством взаимодействия пограничных инсуляторов домена. В неэрит-роидных клетках это взаимодействие отсутствует.