Роль иммунофенотипирования в диагностике опухолевого поражения костного мозга при периферических В-клеточных неходжкинских лимфомах

Актуальность проблемы.

Биологические особенности В-клеточных периферических неходжкинских лимфом (В-HXJI) определяют тропность данной группы нозологий к костному мозгу (т.н. homing-effect). Верификация вовлечения гемопоэтической ткани играет чрезвычайно важную роль в клинической практике в первую очередь по следующим причинам:

1. Полноценное первичное стадирование лимфомы, которое определяет адекватную терапевтическую тактику, в первую очередь, для мелкоклеточных вариантов В-клеточных лимфом. Вовлечение костного мозга, например, при фолликулярной лимфоме определяет IV — диссеминированную стадию процесса и требует проведения системной химиотерапии, а не комбинированного химиолучевого лечения, применяющегося в начальных стадиях процесса. При I и II стадиях MALT-лимфомы, с поражением желудка, при которой установленным этиологическим агентом является Helicobacter pylori, с успехом применяется антихеликобактерная эрадикационная терапия. При диссеминированном процессе с вовлечением костного мозга, речь может идти только о системной полихимиотерапии [Malek SN et al., 2003].

2. На основании исследования костного мозга можно осуществлять мониторинг полноты ремиссии у пациентов после проведенного лечения. Эта диагностическая задача стала актуальной с внедрением в клиническую практику новых химиотерапевтических агентов, а также терапевтических моноклональных антител, что позволило добиться полных ремиссий при ряде В-НХЛ, например, при В-лимфоме из малых лимфоцитов/хроническом лимфолейкозе. Важно отметить, что полнота достигнутой ремиссии после индукционных режимов полихимиотерапии определяет интенсивность и количество курсов консолидации при HXJI.

3. Костный мозг при наличии лимфомного поражения может быть единственным диагностическим материалом в случае лимфом с первичным поражением костей/костного мозга или с недоступным экстрамедуллярным очагом (изолированное поражение забрюшинных и медиастинальных лимфоузлов, тяжелый соматический статус больного, панили тромбоцитопения). Гистологические дифференциально — диагностические критерии такие как объем, форма, локализация поражения, а также цитологические особенности лимфомных клеток, определяемые на стандартно окрашенных препаратах костного мозга, являются важными, но не абсолютными. Так, паратрабекулярный и диффузный типы лимфоидной инфильтрации считаются маркерными для лимфом, в то время как очаговый тип поражения костного мозга может иметь большое сходство с реактивным процессом, а выявление минимальной интерстициальной или интрасинусоидальной локализации лимфомных клеток вообще крайне затруднительно даже при высочайшей квалификации морфолога.

Для повышения чувствительности обнаружения минимального поражения костного мозга при B-HXJI в настоящее время используются иммунологические и молекулярно-биологические методы. Иммунофенотипирование лимфомных клеток костномозгового пунктата (аспирата) методом проточной цитометрии позволяет выявить неопластические клетки даже при незначительном содержании лимфоцитов/ пролимфоцитов в костном мозге. Это становится возможным на основании знаний об особенностях иммунофенотипа клеток первичной опухоли, их линейной принадлежности и стадии дифференцировки. Важным преимуществом метода проточной цитофлуориметрии является возможность оценки коэкспрессии нескольких молекул (2−3 и более) на уровне одной клетки. Другим иммунологическим методом выявления поражения костного мозга при B-HXJI является иммуногистохимическое исследование материала трепанобиоптатов. Этот метод позволяет не только установить линейную принадлежность опухоли и соотнести иммунофенотип неопластических клеток костномозгового субстрата лимфомы с экстрамедуллярным компонентом, но и оценить диагностически — значимую локализацию опухолевых клеток в их взаимоотношении с костной и гемопоэтической тканью. Анализ чувствительности иммунологических методов обнаружения поражения костного мозга при B-HXJI путем сопоставления данных иммунофенотипирования (проточная цитофлуориметрия и иммуногистохимия) со стандартными методами (цитологическое и гистологическое исследования) является несомненно актуальной задачей, решение которой позволит более точно стадировать B-HXJI и определять вариант в рамках современной классификации ВОЗ (2001). В свою очередь максимально точное стадирование и определение иммуноморфологического варианта лимфомы позволит выбрать наиболее оптимальную лечебную тактику как при первичном процессе, так и в случае рецидива у каждого конкретного больного с B-HXJ1. Цель исследования.

Оценка значения иммунофенотипирования при поражении костного мозга при различных морфоиммунологических вариантах периферических B-HXJI, выделенных в соответствии с классификацией ВОЗ (2001). Задачи исследования.

1. Изучение частоты возникновения и диагностического значения разных гистологических типов поражения костного мозга периферических B-HXJ1;

2. Сопоставление диагностической значимости цитологического (миелограмма) и иммунологического (метод проточной цитометрии) исследований аспирата костного мозга.

3. Сопоставление гистологического и иммунологического (иммуногистохимия) методов исследования материала трепанобиоптатов костного мозга.

4. Сопоставление иммунофенотипа экстрамедуллярной опухоли и костномозгового субстрата лимфомы в костном мозге.

5. Сопоставление диагностического значения проточной цитофлуориметрии и иммуногистохимического исследования костного мозга при различных вариантах В-НХЛ. Научная новизна работы.

Сопоставление морфоиммунофенотипических особенностей лимфомных клеток экстрамедуллярной опухоли и костномозгового субстрата привело к систематизации знаний об особенностях homing-эффекта периферических В-клеточных лимфом. Полученные данные легли в основу разработки дифференциально-диагностических критериев установления вариантов периферических B-HXJI по костномозговому биоптату в рамках классификации ВОЗ (2001).

Практическая значимость.

Выбор наиболее адекватной комбинации иммуноморфологических методов для диагностики поражения костного мозга в зависимости от варианта B-HXJI, с учетом особенностей homing-эффекта лимфом позволила с максимальной точностью определять наличие специфической инфильтрации при любом объеме поражения костного мозга. Это сказалось на стадировании болезни (первичном и в процессе лечения), решит проблему дифференциальной диагностики, а также позволило наиболее адекватно оценивать полноту полученной/ сохраняющейся ремиссии. Все вышеперечисленное лежит в основе выбора оптимальной терапевтической тактики у каждого конкретного пациента с HXJL.

Выводы.

Иммунофенотипирование лимфоидных клеток костного мозга (проточная цитометрия, иммуногистохимия) является методом выбора в диагностике и стадировании неходжкинских лимфом по костному мозгу. Это обусловлено отсутствием патогномоничных цитологических и гистологических признаков опухолевого поражения костного мозга для большинства вариантов лимфом, выделяемых согласно классификации ВОЗ (2001).

В-клеточный хронический лимфолейкоз или лимфома из мелких лимфоцитов характеризуются интерстициальным типом поражения костного мозга опухолевыми В-лимфоцитами, коэкспрессирующими антигены CD5 и CD23. Диагноз (или поражение костного мозга) устанавливается при иммуноцитометрическом исследовании аспирата костного мозга, трепанобиопсия с иммуногистохимическим исследованием не показаны.

Генерализация мантийноклеточной лимфомы сопровождается поражением костного мозга по очаговому (позже — очагово-диффузному) межтрабекулярному типу, реже — в сочетании с паратрабекулярным. Диагностический иммунофенотип опухолевых В-лимфоцитов (CD5+CD23-) устанавливается по пунктату костного мозга, иммуногистохимического исследования не требуется. Морфологическое изучение трепанобиоптата костного мозга показано для диагностики трансформации в бластоидный вариант.

Поражение костного мозга при фолликулярной лимфоме носит очаговый характер: паратрабекулярный, межтрабекулярный тип или их сочетание. Комплексное иммуноморфологическое исследование трепанобиоптата и аспирата костного мозга показано во всех случаях, так как позволяет провести дифференциальный диагноз с лимфомой маргинальной зоны селезенки и реактивными процессами.

5. Лимфома маргинальной зоны селезенки характеризуется интрасинусоидальным, фолликулоподобным и диффузным интерстициальным типами поражения костного мозга. Интрасинусоидальный и фолликулоподобный межтрабекулярный рост опухолевых клеток в костном мозге являются специфическими для данного варианта лимфомы и устанавливаются только при иммуногистохимическом исследовании на основании подтверждения В-клеточной природы опухолевых элементов и обнаружения CD21+CD23+ фолликулярных дендритных клеток.

6. Поражение костного мозга при диффузной В-крупноклеточной лимфоме во многом взаимосвязано с первичной локализацией опухоли: для первичных нодальных локализаций более характерен диффузный локализованный тип роста бластных клеток, для экстранодальных — морфологически «дискордантные» ситуации с формированием в костном мозге очаговых структур из Т-лимфоцитов. Иммуногистохимическое исследование трепанобиоптата необходимо при отсутствии лимфомных (бластных) клеток в аспирате костного мозга или при морфологических признаках «дискордантности».

7. Лимфома Беркитта характеризуется высокой частотой поражения костного мозга по типу острого лейкоза (цитологически ЬЗ-вариант). В срезах трепанобиоптатов костного мозга среди диффузно растущих бластных клеток отмечаются вкрапления разрозненных макрофагов (картина «звездного неба» как и в первичной опухоли). Периферический иммунофенотип В-бластов с высокой пролиферативной активностью устанавливаются по пунктатам костного мозга. Иммуногистохимическое исследование трепанобиоптатов необходимо при обнаружении нетипичных форм лимфоидной инфильтрации.

8. В костном мозге больных с иммуноморфологически диагностированной лимфомой желудка MALT-типа могут обнаруживаться очаговые мелкоклеточные лимфоидные инфильтраты (межтрабекулярные, паратрабекулярные), напоминающие на морфологическом уровне лимфомное поражение. В большинстве случаев состав этих инфильтратов преимущественно Т-клеточный (реактивные), что может быть установлено при иммуногистохимическом исследовании трепанобиоптатов костного мозга.

9. При плазмоцитомах и лимфоплазмоцитарных опухолях костный мозг может быть единственной экстранодальной локализацией лимфомного поражения, доступной для гистологического исследования. Иммунологическая верификация диагноза основывается на установлении моноклональности (к/А.) с подтверждением плазмоклеточной дифференцировки (CD138). 1 2 3 4 5 6 7 8 9.

Заключение

.

Как уже говорилось, биологические особенности B-HXJI предопределяют тропность лимфомных клеток к костному мозгу (homing-эффект), определяя тем самым гемопоэтическую ткань одним из основных органов диссеминации опухолевого процесса. Это одно из ключевых этапов развития лимфоидной опухоли, изменяющее как течение самой болезни, так и общий соматический статус больного.

Каждая нозологическая форма периферической B-HXJ1, выделенная в последнем пересмотре ВОЗ (2001), отражает уровень блока нормальной В-линейной дифференцировки, приводящего к иммортализации конкретного этапа, со всеми молекулярно-биологическими свойствами лимфоидных клеток данного «возраста». Иными словами, при единой направленности вектора диссеминации каждый вариант периферической В-линейной НХЛ имеет свои особенности, обусловленные степенью зрелости лимфомных клеток, к основным из которых относятся вероятность лейкемизации на ранних этапах заболевания, а также характер интрамедуллярного распространения. Оба этих процесса определяются профилем экспрессии молекул адгезии, изучение которого, равно, как и более глубоких патогенетических механизмов лейкемизации, к сожалению, не вошло в задачи нашего исследования (см. главу «Обзор литературы»). Оценка показателя тропности оказалась также невозможной, так как выборка всех больных не была случайной — главным критерием отбора, как уже неоднократно говорилось, служило заподозренное на морфологическом уровне или уже доказанное одним из иммунологических методов вовлечение костного мозга. Задача оптимизации диагностики поражения костного мозга при В-НХЛ привела нас к необходимости создания персонифицированных диагностических алгоритмов для каждой нозологии на основании подбора оптимального сочетания иммуноморфологических методов исследования двух основных типов материала костного мозга — аспирата и трепанобиоптата.

Наиболее уместной основой составления диагностических комбинаций, с нашей точки зрения, стал вероятностный показатель тропности к костному мозгу, который определяет количество костномозгового опухолевого компонента, влияющего, в свою очередь, на цель диагностики. Так, если иммунофенотипирование выраженного костномозгового субстрата лимфом с высокой тропностыо (вероятность лейкемизации >50%) служит, в первую очередь, межвариантной дифференциальной диагностике, то для В-НХЛ со средней и низкой вероятностью лейкемизации (< 50%) первая задача иммунологического исследования — исключение реактивного (доброкачественного) характера процесса, определяющее стадирование лимфомы. 1. В-ХЛЛ/ЛМЛ.

Все 6 случаев данного варианта лимфомы, подробно описанные в соответствующем разделе главы № 3, характеризовались отчетливым патологическим лимфоцитозом в аспирате костного мозга. Во всех наблюдениях, даже при невысоких цифрах неопластических лимфоцитов (25.8%) характерный облик клеток, в сочетании с известной иммуноморфологией экстрамедуллярного компонента позволили с большой долей вероятности уже на уровне стандартной цитологии предположить поражение костного мозга при В-ХЛЛ/ЛМЛ. Иммунофенотипирование методом проточной цитофлуориметрии подтвердило специфический характер процесса. Наиболее важным моментом исследования стала возможность анализа диагностической коэкспрессии молекул CD5 и CD23 на поверхности CD 19+ лимфоцитов, а также количественное определение уровня экспрессии CD20. При морфологическом исследовании материала трепанобиоптатов, проведенного в 2 случаях из 6, никакой дополнительной диагностической информации получено не было — классический облик неопластических лимфоцитов, а также характерный тип интрамедуллярной диссеминации в виде дисперсии между элементами нормального гемопоэза (интерстициальный тип) послужили простым подтверждением данных комплексного исследования аспирата. Иммуногистохимическое исследование материала трепанобиоптата не требовалось ни в одном случае, кроме того сложности применения диагностических антител CD5 и CD23 на парафиновом материале и невозможность оценки их коэкспрессии на лимфоидном компоненте определили абсолютное преимущество метода проточной цитофлуориметрии в представленных случаях.

Исследования последних лет привели к выделению более надежных, по сравнению с морфологическими ориентирами прошлого маркеров молекулярно-биологического уровня (наличие соматических гипермутаций, уровень р2-микроглобулина, экспрессия CD38). Таким образом, гистологический тип интрамедуллярного роста лимфомы (см. главу «Обзор литературы»), считавшийся фактором прогноза в последней трети прошлого века, явно утратил свою актуальность. На этом основании требует обсуждения вопрос вообще о целесообразности проведения трепанобиопсии костного мозга при В-ХЛЛ/ЛМЛ на этапе первичной диагностики при условии наличия отчетливого патологического лимфоцитоза в материале аспирата костного мозга .

Наши данные могут свидетельствовать в пользу отказа от морфологического (гистологического) исследования костного мозга в классических случаях В-ХЛЛ/ЛМЛ при условии возможности проведения комплексного иммуноморфологического исследования аспирата с использованием проточной цитофлуориметрии. 2. Лимфома из клеток мантии (ЛКМ).

Данная нозология, как и В-ХЛЛ/ЛМЛ, относится к лимфомам с высоким риском лейкемизации на ранних этапах развития заболевания. Как уже говорилось в главе «Обзор литературы», частота поражения костного мозга на момент первичной диагностики, по данным некоторых иностранных авторов превышала 90% [Cohen PL с соавт., 1998]. Все 6 случаев ЛКМ нашего исследования отличались наличием выраженного лейкемического субстрата — минимальный процент патологических лимфоцитов при подсчете миелограммы составил 50%.

Выраженный патологический лимфоцитоз аспирата костного мозга позволил с успехом применить метод проточной цитофлуориметрии (ПЦ) для характеристики иммунофенотипа во всех наблюдениях. Помимо определения диагностической экспрессии Т-клеточного антигена CD5 на клональных В-лимфоцитах, одним из важных поисковых событий для JIKM была возможность количественной оценки уровня экспрессии молекулы CD20 (см. главу «Обзор литературы») на лимфомных клетках с помощью ПЦ. Напомним, что степень экспрессии пан-В-клеточного маркера CD20 является хорошим диагностическим ориентиром для проведения дифференциальной диагностики JIKM с В-ХЛЛ/ЛМЛ и считается лучшей альтернативой определению экспрессии молекулы FMC7 [Hiibl W с соавт., 1998].

При исследовании материала трепанобиоптатов основной особенностью лимфомы была тенденция к образованию очагов в гемопоэтической ткани с межтрабекулярной локализацией и тенденцией к слиянию (формирование псевдодиффузного типа инфильтрации) (Таблица № 3.7), при этом характер интрамедуллярной диссеминации лимфомы был одинаков во всех 6 случаях. Иммуногистохимическое исследование, проведенное только в одном случае, безусловно, принесло дополнительную диагностическую информацию в виде выявления экспрессии лимфомными клетками молекул циклина D1. Однако, несмотря на то что в нашем исследовании все иммуногистохимические реакции прошли удачно, существуют объективные сложности исследования циклина D1, связанные с внутриклеточной локализацией его эпитопов, которые могут приводить к ложным результатам. Иными словами существуют реальные трудности с оценкой иммунофенотипа костномозгового клона ЛКМ на материале трепанобиоптата.

Стандартное морфологическое исследование трепанобиоптата является, однако, с нашей точки зрения, обязательным во всех случаяхвысокая пролиферативная активность ЛКМ по сравнению со всеми остальными мелкоклеточными В-клеточными вариантами НХЛ может приводит к появлению дополнительных хромосомных аббераций и, как следствие, к трансформации в более агрессивный бластоидный вариант. Существенным моментом видоизменения опухоли является независимый характер явления — то есть вероятность зарождения не только в субстратах разных локализаций, но, также и в разных частях одного опухолевого компонента (подобные ситуации носят название композитных)[Османов Д.Ш., 2004].

Явление не поддается диагностике методом ПЦ, так как не сопровождается изменением профиля экспрессии иммунологических маркеров — видимые преобразования касаются только морфологического облика клеток (два подобных случая детально описаны нами в соответствующем разделе главы № 3).

Таким образом, при ЛКМ наилучшим методом иммунофенотипирования может считаться проточная цитофлуориметрия, однако даже комплексного иммуноморфологического исследования материала аспирата, как при В-ХЛЛ/ЛМЛ, не достаточно — для исключения трансформации в бластоидный вариант требуется обязательное сочетание со стандартной морфологией трепанобиоптата. 3. Лимфома маргинальной зоны селезенки.

Полученные нами результаты полностью подтвердили данные иностранных авторов о высокой тропности данного варианта периферической В-НХЛ к костному мозгу. Во всех б случаях, описанных в работе, в аспирате костного мозга на момент первичной диагностики определялся четкий патологический лимфоцитоз, составлявший только в одном наблюдении из 6 или менее, чем в 30% (см. таблицу № 4.10), во всех остальных превышавший 50%. Важной деталью явилось отсутствие возможности изучения очагов экстрамедуллярного роста лимфомы, поэтому вся диагностическая нагрузка в рамках классификации ВОЗ (2001) легла на костномозговой компонент. Тем не менее, тщательный сбор клинических данные оказался крайне полезным — сведения о наличии спленомегалии с изменением эхогенной структуры органа во всех случаях, а также виллезных" лимфоцитах периферической крови помогли в отношении конкретизации варианта лимфомы.

Исследование аспирата методом проточной цитофлуориметрии позволило определить во всех наблюдениях CD5- и CD 103- (для случаев с «виллезным» комопонентом) негативный В-иммуноподвариант периферической лимфомы (см. соответствующие рисунки главы № 4). Таким образом, цитометрически были исключены такие варианты периферических В-HXJI как В-ХЛЛ/ЛМЛ, лимфома из клеток мантии и волосатоклеточный лейкоз, однако, информации, полученной с помощью ПЦ, было явно недостаточно для проведения дифференциальной диагностики с фолликулярной лимфомой (CD 10 «-» ситуации). При исследовании трепанобиоптатов все наблюдения поделились поровну между двумя основными гистологическими типами поражения — очаговым, с выраженной зональностью и межтрабекулярной локализацией, а также диффузным интрасинусоидальным, с локализацией лимфоидных элементов в основном внутри дилятированных микрососудов костного мозга и только частично между элементами нормального гемопоэза. Важным моментом явялется частое сочетание обоих патогномоничных типов. Патологические нодули, как уже отмечалось, характеризовались, помимо четких контуров выраженной зональностью, определявшей их крайнее сходство с реактивными лимфоидными фолликулами. Таким образом, показания для иммуногистохимического исследования трепанобиоптатов костного мозга были двояки — помимо необходимости проведения дифференциальной диагностики с фолликулярной лимфомой требовалось также исключение реактивной природы процесса.

Иммуногистохимическое исследование определило мономорфную В-клеточную композицию очагов, исключившую реактивную природу процесса. Выявление конгломератов В-клеток (CD20+, CD79a+) в синусоидах помогло не только определить патогномоничный тип инфильтрации, но и выделить поражение костного мозга там, где оно не было распознано на световом уровне. Важным диагностическим подспорьем оказалось обнаружение фолликулярных дендритных клеток в центральных отделах нодулей — признака, считающегося патогномоничным для всех лимфом маргинальной зоны. Отсутствие паратрабекулярной локализации и типичной центроцитоидно-центробластной морфологии, в сочетании с тенденцией к образованию лимфоидных «сладжей» в микрососудах позволило с высокой долей вероятности провести дифференциальный диагноз с фолликулярной лимфомой.

Таким образом, можно сказать, что для такой иммунологически и цитогенетически «бесцветной» лимфомы как лимфома маргинальной зоны селезенки существуют отчетливые патогномоничные признаки поражения костного мозга иммуноморфологического уровня, поэтому определяющим (при отсутствии возможности проведения спленэктомии) является иммуногистохимическое исследование трепанобиоптата костного мозга. Исследование можно считать незаменимым при проведении дифференциальной диагностики с фолликулярной лимфомой (CD 10 «-» случаи) и реактивным процессом, а также для правильного стадирования (выявление незаметной на световом уровне интрасинусоидальной инфильтрации). 4. Лимфома маргинальной зоны. Вариант, ассоциированный со слизистыми (MALT-тип).

Во всем мире нозология относится к вариантам периферических мел ко клеточных В-клеточных НХЛ с низкой тропностью ккостному мозгу. Косвенным подтверждением данного утверждения можно считать малое количество случаев, попавших в наше исследование. Особенностью всех наблюдений можно считать классическую локализацию лимфомы (желудок), а также доказанную связь с Helicobacter Pylori.

Лимфоидная инфильтрация во всех случаях была обнаружена только при исследовании трепанобиоптатов костного мозга, при этом никаких качественно-количественных изменений состава миелограмм обнаружено не было. Во всех наблюдениях предположительным морфологическим диагнозом была, с учетом знаний об иммуноморфологии первичного субстрата, лейкемизация мелкоклеточной лимфомы (см. таблицу № 4.8), поэтому диагностика поражения костного мозга была решающей для стадирования нозологии. Доказанное поражение костного мозга определило бы IV стадию процесса что, в свою очередь, привело бы к необходимости значительной интенсификации лечения с применением системной полихимиотерапии взамен антибактериальных курсов эррадикации Helicobacter Pylori.

Как видно из таблицы № 4.8 в 2 случаях очаги оказались смешанноТ- и Вклеточными, в третьем — мономорфно Т, то есть исходя из сформулированного выше диагностического алгоритма, во всех случаях поражение костного мозга было исключено. Таким образом, можно сказать, что обнаружение лимфоидной инфильтрации любого типа в материале трепанобиоптатов пациентов с лимфомой MALTтипа есть абсолютное показание для проведения иммуногистохимического исследования, определяющего стадию и итоговую клиническую тактику. 5. Фолликулярная лимфома (ФЛ).

Следует напомнить, что по данным иностранных авторов ФЛ лейкемизируется в 40−60% случаев. В нашей работе поражение костного мозга было подтверждено в 4 случаях, что составило 57%. Как известно, особенности лейкемизации ФЛ проявляются в достаточно редком появлении патологического лимфоцитоза в аспирате костного мозга, а также специфическом интрамедуллярном росте опухолевых очагов в тесном контакте с трабекулами (паратрабекулярный тип). В материале аспирата костного мозга больных ФЛ нашего исследования клетки, подозрительные в отношении опухолевых (см. описание в соответствующем разделе главы № 4), были обнаружены только в 3 случаях, причем в двух из них процент от общего числа миелокариоцитов составил менее 5%. Подобная минимальная концентрация клеток с морфологией опухолевых (типа центроцитоидных) не позволила провести исследование их иммунофенотипа методом проточной цитофлуориметрии. ПЦ, проведенная в третьем случае (процент лимфоидных клеток составил 27.4%), помогла выделить преобладающее большинство Тклеточной популяции, при отсутствии маркеров клональности на В-клетках, то есть исключить наличие лимфомного компонента (см. соответствующие рисунки главы № 4). При исследовании трепанобиоптатов мелкоклеточная лимфоидная инфильтрация была выявлена во всех случаях. В таблице № 4.5 представлено сопоставление морфологического диагноза и данных иммунологического исследования трепанобиоптатов при ФЛ. Важным морфологическим аспектом в пользу диагноза ФЛ были цитологические особенности лимфоидных клеток — сочетание небольшого размера с плотной структурой хроматина «угловатых» ядер, при этом патогномоничная паратрабекулярная локализация процесса была обнаружена в 4 случаях из 7. В 2 случаях из них лимфоидные скопления локализовались также и межтрабекулярно. В 3 случаях паратрабекулярная локализация лимфоидных скоплений вообще обнаружена не была, лимфоидные очаги локализовались исключительно межтрабекулярно. Основой диагноза во всех случаях (за исключением одного) ФЛ служило первичное иммуноморфологическое исследование экстрамедуллярного субстрата. Информация об исходном иммуноморфологическом варианте лимфомы у пациента с мелкоклеточной «центроцитоидной» инфильтрацией костного мозга, как видно из таблицы № 4.5, в 100% случаев заставила морфолога сделать предположительное заключение в пользу костномозговой инвазии мелкоклеточной лимфомы, предположительно ФЛ. При проведении иммуногистохимического исследования первичной задачей для нас было, конечно, проведение дифференциального диагноза с реактивным процессом. Иммунологический уровень решения подобной проблемы базируется на знаниях о фракционном соотношении Ти В-лимфоидных клеток, которое в норме находится в пределах 5:1, то есть существенно смещено в сторону преобладания Т-компонента. Сведения иностранных исследователей, посвященные этому вопросу, сводятся к довольно простым практическим рекомендациям для периферических мелкоклеточных B-HXJI, которые были приняты нами за диагностическую основу:

1. Определение значительного увеличения в костном мозге В-лимфоцитов (CD20+, CD79a+), с тенденцией к образованию скоплений и изменением внешнего облика — явный знак B-HXJI;

2. Мономорфный Т-клеточный состав лимфоидной инфильтрации у пациента с экстрамедуллярной B-HXJI — реактивный процесс;

3. Сочетанная композиция лимфоидных очагов (присутствие Ти В-клеток) с обязательным существенным преобладанием Т-клеток (CD3+, CD45RO+) -вероятностный маркер реактивного (доброкачественного) характера изменений.

В 3 случаях ФЛ из 7 состав очагов оказался сочетанным Ти В-клеточным, в 1-мономорфно Т-клеточным, то есть, исходя из предложенной диагностической схемы,-реактивным или доброкачественным. Важным обстоятельством было также то, что облик центроцитоидных лимфоцитов имел как раз Т-клеточный компонент (CD3+, CD45RO+), а В-клетки (CD20+, CD79a+) имели малый размер и правильную округлую форму ядер, то есть типичный облик малого лимфоцита. Поражение костного мозга при ФЛ в этих случаях было исключено. В 4 — лимфоидный компонент состоял на 90% из В-клеток с морфологией центроцитоидных, причем некоторые В-клетки имели облик центробластов — в этих наблюдениях был установлен диагноз ФЛ.

Таким образом, в 43% случаев морфологический диагноз фолликулярной лимфомы иммунологически подтвержден не был и исследование явилось основополагающим для исключения поражения костного мозга при ФЛ или правильного стадирования нозологии. В наблюдении больной С., 71 года, отличающегося преимущественной паратрабекулярной локализацией очагов даже смешанных лимфомных популяций, полностью исключить вероятность минимального поражения при ФЛ не удалось. Этот случай послужил примером предела метода иммуногистохимии, так как окончательный ответ о природе В-популяции могло бы дать только исследование клональности В-клеток (IgVhгенов) с помощью молекулярнобиологических методов, например ПЦР. Таким образом, подводя итог в отношении диагностики поражения костного мозга при ФЛ, можно сказать, что во всех случаях нозологии оптимальным сочетанием диагностических методов является иммуноморфологическое исследование и аспирата и трепанобиоптата, причем основополагающим может быть исследование последнего. Итак, можно сделать заключение, что диагноз лейкемизации фолликулярной лимфомы не может быть установлен только на основании стандартного морфологического исследования трепанобиоптата даже при обнаружении типичного центроцитоидного облика лимфоидных клеток и/или их паратрабекулярной локализации. Проведение иммуногистохимии трепанобиоптата является абсолютным показанием, даже при констатации отсутствия поражения по данным иммунологического исследования материала аспирата костного мозга методом проточной цитофлуориметрии (см. описание случая больной М., 58 лет). Проведение последнего, однако, желательно даже в случаях ФЛ с минимальным процентом лимфоидных элементов подозрительной морфологии или общим относительным увеличением количества зрелых лимфоцитов более 15% от числа всех миелокариоцитов.

6. Диффузная В-клеточная крупноклеточная лимфома (ДВКЛ).

Довольно интересным оказался уже тот факт, что пациенты с нозологией, вероятность лейкемизации которой в процентном эквиваленте по данным иностранных коллег составляет не более 30%, составили самую многочисленную группу в данной работе. Забегая вперед хочется сказать, что как раз для этого варианта из всех периферических В-НХЛ нами были получены самые любопытные результаты.

По отношению к диагностическим методам верификации поражения костного мозга все пациенты с данной нозологией разделились на две неравные группы — с и без показаний для иммуногистохимического исследования трепанобиоптатов костного мозга. Группа без показаний оказалось много меньше — всего 6 человек из 20 или — 30%. В данных наблюдениях, подробно описанных в главе № 3, субстрат ДВКЛ определялся как в трепанобиоптате, так и в аспирате костного мозга. При сопоставлении обоих исследований был обнаружено, что при относительно невысоком уровне патологических бластов аспирата (не более 20%), при гистологическом исследовании трепанобиоптатов тех же больных определялось субтотальное замещение нормальной гемопоэтической ткани субстратом опухоли. Исходя из сопоставления собственных данных с анализом современной литературы (см. главу «Обзор литературы»), можно высказать предположение, что в основу феномена легли биологические особенности лимфомы, определяющие не интерстициальную, «поклеточную» диссеминацию лимфомы, а мультифокальный, саркомоподобный ее рост без дисперсии отдельных клеток между элементами нормального гемопоэза. Подтверждением сказанному может быть явление интактности островков нормального гемопоэза, выявленное во всех 6 образцах костного мозга.

Отчетливый патологический бластоз этих 6 случаев позволил применить метод проточной цитофлуориметрии, определивший принадлежность опухолевых клеток к периферическим этапам В-клеточной дифференцировки (CD20+, CD19+, CD37+, CD34-, CD10-) (см. соотв. рисунки № 3.12 и 3.13 главы № 3). Сочетание подобных иммунологических характеристик опухолевых клеток аспирата с характерной гистологической картиной материала трепанобиоптатов позволило установить диагноз лейкемизации ДВКЛ. Иммуногистохимическое исследование трепанобиоптатов, проведенное в некоторых случаях, не принесло дополнительной информации по сравнению с данными ПЦ и даже более того выглядело более скудным по причине более узкой панели антител для фиксированного материала. В двух других наблюдениях, подробно описанных в соответствующем разделе главы № 4 отмечалось повышение уровня лимфоцитов по данным исследования только аспирата костного мозга, при этом в трепанобиоптате никакой лимфоидной инфильтрации выявлено не было. При исследовании аспиратов методом проточной цитофлуориметрии у обоих пациентов определялось значительное преобладание Т-клеточной лимфоидной субпопуляции. В-клетки составляли абсолютное меньшинство и не несли признаков клональности, при этом мофрологические признаки разбавления аспирата периферической кровью отсутствовали. Комплексное исследование костного мозга данных больных позволило, таким образом, говорить о наличии реактивного Т-лимфоцитоза без видимого морфологического эквивалента на уровне стандартного исследования трепанобиоптата. В остальных 14 случаях ДВКЛ лимфоидная инфильтрация костного мозга, подозрительная в отношении поражения костного мозга была выявлена только при исследовании трепанобиоптатов, причем цитологические характеристики лимфоидных клеток в 10 случаях создавали прецедент гистологической дискордантности с экстрамедуллярным субстратом. В двух случаях лимфоидный субстрат костного мозга имел бластную морфологию. Оба случая детально описаны в соответствующем разделе главы № 4. Именно иммуногистохимическое исследование трепанобиоптатов этих больных позволило установить диагноз в рамках классификации ВОЗ, так как в одном наблюдении биопсия экстрамедуллярного компонента не могла быть проведена по техническим причинам, а другой вообще относился к редким случаям изолированной костномозговой/костной локализации лимфомы. Основой диагноза лейкемизации ДВКЛ в обоих случаях стало иммунологическое определение принадлежности бластных клеток к периферическим этапам В-линейной дифференцировки (CD20+, CD34-) в сочетании с характерным центробластно/иммунобластным обликом клеток и локальным диффузным t мультифокальным) гистологическим типом роста.

Анализ 10 случаев с мелкоклеточным и смешанным характером лимфоидной инфильтрации, по нашему мнению, представляет собой один из ключевых моментов всего исследования. В современной мировой литературе явление дискордантных гистологических ситуаций при крупноклеточной В-клеточной лимфоме обсуждается довольно мало. Суммируя весь доступный литературный материал, можно выделить три основные причины дискордантности, выделяемые зарубежными коллегами:

1. Трансформация в более агрессивный вариант (крупноклеточную НХЛ) наиболее характерно для фолликулярной лимфомы и В-ХЛЛ (синдром Рихтера) Представляет собой явление опухолевой прогрессии.

2. Реактивный процесс. Мелкоклеточные инфильтраты в КМ в противопоставление экстрамедуллярной крупноклеточной лимфоме, с потдвержденной В-линейностыо имеют Тклеточную природу, с разным преобладанием CD4+/CD8+ популяций.

3. Истинная биклональность. Одновременное сосуществование двух лимфопролиферативных процессов, с разными иммуноморфологическими и молекулярнобиологическими клональными особенностями. Подобные первично-множественные процессы называется, также композитными.

Иммуногистохимическое исследование, проведенное в 9 случаях трепанобиоптатов, стало основополагающим для диагностики качества процесса. Во всех случаях с лимфоцитарным типом поражения мелкоклеточный лимфоидный компонент оказался представленным мономорфно Т-клетками (CD3+, CD45RO+). Ситуации со смешанным составом очагов (как бы центроцитоидно-центробластного типа) на микроскопическом уровне стандартного окрашивания выглядели подобными фолликулярной лимфоме, причем паратрабекулярная локализация инфильтратов, обнаруженная в двух случаях, еще более усиливала сходство. При проведении иммуногистохимического исследования было обнаружено, что весь мелкоклеточный компонент экспрессировал Т-клеточные маркеры, а В-клеточные антигены (CD20, CD79a) несли только крупные бластные клетки с выраженным ядерным плеоморфизмом и высокой митотической активностью. Дискретное расположение последних среди плотного Т-компонента напоминало гистологическую картину варианта ДВКЛ богатого Т-клетками (T-cell rich), что на самом деле было ни чем иным как уникальным морфологическим отражением феномена реактивности Т-клеточного звена иммунитета в ответ на начинающуюся костномозговую инвазию ДВКЛ. Немаловажным фактом является то, что все случаи (кроме одного) с первичной экстранодальной локализацией ДВКЛ попали в группу с гистологической дискордантностыо или, как было определено иммуногистохимически, с феноменом Т-клеточной реакции. Большую часть случаев с первичной нодальной локализацией экстрамедуллярного субстрата ДВКЛ отличало как раз минимальное количество Т-клеток в костном мозге и быстрые темпы интрамедуллярного роста с появлением патологических бластов в аспирате. Безусловно, наши наблюдения достаточно поверхностны, и могут служить лишь прологом для последующих глубоких исследований механизмов противоопухолевой активности или толерантности иммунной системы. Таким образом, возвращаясь к основной задаче работы, следует сказать, что оптимальная комбинация диагностических методов определения характера лимфоидной инфильтрации при ДВКЛ может быть определена только после комплексного морфологического исследования как аспирата, так и трепанобиоптата костного мозга.

1. При обнаружении отчетливого бластоза в аспирате костного мозга может быть применен метод проточной цитофлуориметрии, однако, исследование должно быть обязательно дополнено стандартным исследованием трепанобиоптата, и при обнаружении характерной гистологической картины ДВКЛ проведение иммуногистохимического исследования можно считать нецелесообразным.

2. Обнаружение лимфоидной инфильтрации, морфологически отличающейся от основного экстрамедуллярного субстрата ДВКЛ, есть абсолютное показание для проведения иммуногистохимического исследования трепанобиоптата костного мозга.

7. Лимфома Беркитта.

Частота поражения костного мозга в нашем исследовании составила 50%, причем лейкемизация возникла в 2 случаях из 4 на ранних этапах развития заболевания. Как подробно описано в соответствующем разделе главы № 3, костномозговой компонент как в аспирате, так и трепанобиоптате отличался типичными для нозологии чертамибластный компонент аспирата имел морфологию L3, а в материале трепанобиоптата обнаруживалась характерная морфологическая картина «звездного неба». Комплексное исследование аспирата с применением проточной цитофлуориметрии позволило определить классический для лимфомы Беркитта иммунофенотип — сочетание экспрессии молекул периферических этапов В-клеточной дифференцировки с экспрессией молекулы CD 10. Морфологическая картина трепанобиоптата костного мозга сыграла второстепенную роль уточнения и тем более не требовала проведения иммуногистохимии трепанобиоптатов. В двух других случаях фенотип лимфомы был установлен на основании морфоиммунофенотипического исследования экстрамедуллярного компонента. В аспирате костного мозга никаких изменений не определялось, однако, при проведении морфологического исследования трепанобиоптатов была выявлена мелкоклеточная очаговая лимфоидная инфильтрация, образовывавшая в одном случае нодулярные структуры с четкими контурами и зональностью. Дискордантный тип лимфоидных инфильтратов послужил показанием для проведения иммуногистохимического исследования трепанобиоптатов. Состав очагов в обоих случаях оказался смешанным Ти В-клеточным, со значительным преобладанием клеток Т-линии. Морфология В-клеток более всего напоминала облик малого лимфоцита и не имела ничего общего с субстратом лимфомы Беркитта. Таким образом, в этих случаях поражение костного мозга с большей долей вероятности было исключено.

Подводя итог, можно сказать, что биологические особенности лимфомы Беркитта не определяют высокой тропности к гемопоэтической ткани, однако при возникновении лейкемизации высокий пролиферативный потенциал лимфомы приводит к быстрой диссеминации с появлением лейкозоподобной картины аспирата костного мозга. Специфичность цитологической картины бластов, в сочетании с характерным иммунологическим профилем экспрессии маркеров периферических этапов В-линейной дифференцировки определяют комплексное исследование аспирата при лимфоме достаточным не только для установления поражения костного мозга, но и просто для диагностики варианта в рамках классификации ВОЗ (2001). В этой связи встает вопрос не только о целесообразности проведения иммуногистохимического исследования трепанобиоптатов костного мозга, но и вообще о необходимости проведения даже стандартного морфологического исследования костного мозга при лимфоме Беркитта [Bain BJ., 2001]. Для случаев с гистологической дискордантностью ситуация выглядит обратной, так как только на основании сочетанного иммунологического исследования аспирата и трепанобиоптата можно установить истинную природу нехарактерной для лимфомы Беркитта лимфоидной инфильтрации. 8. Нестандартные диагностические ситуации.

К нестандартным диагностическим ситуациям можно отнести единичные примеры лейкемизации лимфом, вовлечение костного мозга при которых рассматривается в мировой литературе как казуистика или составляет в процентном отношении менее 5%. Детальное описание характерных черт их лейкемизации крайне важно, так как может послужить моделью для создания диагностических алгоритмов. Из подобных вариантов периферических B-HXJI в нашем исследовании встретились I. Нодальный вариант лимфомы маргинальной зоны.

По данным иностранных авторов лейкемизируется менее чем в 2% случаев (см. главу «Обзор литературы»). В случае больного Е., 67 лет нам удалось наблюдать вовлечение в процесс костного мозга возможно по причине длительного анамнеза развития болезни (более 10 лет), прошедшего до момента установления диагноза гемобластоза. К особенностям клинического наблюдения нашего исследования относились — невысокие цифры патологического лимфоцитоза аспирата костного мозга (менее 25%), а также нодулярный тип роста, с межтрабекулярной локализацией, а трепанобиоптате. Иммунофенотипированию были подвергнуты оба материала костного мозга, при этом в основополагающим стало иммуногистохимическое исследование трепанобиоптата — в пользу нодального варианта лимфомы маргинальной зоны говорил клеточный облик моноцитоидного типа и формирование четких нодулярных межтрабекулярных структур неопластическими клетками.

И. Первичная медиастинальная В-крупноклеточная лимфома (ПМВЛ).

Вероятность лейкемизации, описанная в мировой литературе, также как и для предыдущей нозологии составляет менее 2% (см. главу «Обзор литературы»). В нашей работе приведено описание клинического случая данного варианта B-HXJI с лейкемизацией по типу острого лейкоза, где относительные цифры патологического бластоза аспирата составили более 50%, причем бласты отличались обильной вакуолизацией цитоплазмы. Иммунофенотипирование аспирата методом проточной цитофлуориметрии позволило установить фенотип периферических этапов В-линейной дифференцировки неопластических клеток, а отсутствие экспрессии молекулы HLA-DR опухолевыми лимфоцитами стало одним из основных критериев их тимической принадлежности. Гистологическое исследование трепанобиоптата позволило выделить патогномоничные для ПМВЛ морфологические особенности — выраженный фиброз коллагенового типа, как бы сепарирующий опухолевую ткань на дольки, и вторичные некротические изменения. Иммуногистохимическое исследование не принесло дополнительной информации и более того, по причине более узкой панели выглядело по сравнению с ПЦ нецелесообразным.

Таким образом, подводя итог можно сказать, что иммуногистохимическое исследование костного мозга при периферических Вклеточных неходжкинских лимфомах является необходимым диагностическим мероприятием, которое с успехом может служить межвариантной диагностике или стадированию лимфом. Максимальную информацию ИГХ — исследование может дать только при наличии у патолога данных комплексного исследования материала всех субстратов опухоли в каждом конкретном клиническом случае.