Регуляция активности нервно-мышечных синапсов мыши внутриклеточным депонированным кальцием, мобилизуемым кофеином и рианодином

Актуальность исследования. В современной физиологии расширяются исследования внутриклеточных цистерн эндоплазматического ретикулума (ЭР), называемых кальциевыми депо, способных не только запасать, но и высвобождать Са2+ в цитоплазму клетки (Berridge, 1993; 1995а, Ь, 1997; Miller, 1991; Kasai et al., 1994; Kasai, 1999). Известна роль таких цистерн ЭР в функционировании мышечных клеток (Melzer et al., 1995), однако их участие в работе нейронов и синаптических терминалей только начинает изучаться (Kuba, 1994; Henzi, MacDermott, 1992; Pozzan et al., 1994; Cohen et al., 1997). У разных типов нейронов и терминален с помощью.

Caкрасителей обнаружены Caдепо, выброс Ca из которых осуществляется по специальным Са2±активируемым Са2±каналам, получившим название рианодиновых рецепторов (Coronado et al., 1994; Hernandez-Cruz, 1995). Открывание этих каналов может регулироваться, наряду с Ca 5 двумя растительными алкалоидами — рианодином и кофеином. Использование кофеина и рианодина для мобилизации Са2+ из Са2±депо позволило обнаружить существенный вклад внутриклеточного депонированного Са2+ в регуляцию возбудимости, ритмической активности и постсинаптической пластичности нейронов (Brorson et al, 1991; Капо et al., 1995; Simpson et al., 1995; Cohen et al, 1997).

У синапсов процесс вызванной секреции медиатора, как известно, обусловлен повышением уровня ионизированного кальция в аксоплазме за счет его поступления из наружной среды (Katz, Miledi, 1965; 1968). Вместе с тем, в последние годы показана возможность выброса Са2+ из Са2±депо терминалей у многих центральных и периферических синапсов (Blaustein, 1978a, bCunnan, Smith, 1997), однако, роль этой системы в регуляции процессов секреции медиатора остается во многом не ясной. В частности, у нервно-мышечных синапсов скелетных мышц при действии кофеина (Wilson, 1973; Onodera, 1973; Roed, 1982) или рианодина (Nishimura et al., 1990), облегчающих выброс Ca из Са2±депо нервных терминалей, наблюдается увеличение частоты спонтанной и уровня вызванной секреции квантов медиатора. Систематический анализ этого явления не проводился. В связи с этим, в данной работе предпринято специальное изучение пресинаптических эффектов кофеина и рианодина, нацеленное на получение новой информации о роли внутриклеточного депонированного Са2+, выбрасываемого из кофеини рианодин-чувствительных Са2-депо в регуляции активности нервно-мышечных синапсов мыши.

Цели и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в изучении роли системы внутриклеточного депонирования и высвобождения ионов Са2+ в регуляции спонтанной и вызванной активности нервно-мышечных синапсов мыши. В связи с поставленной целью, в работе решались следующие конкретные задачи:

1. Исследовать характер вызванной активности синапсов на фоне действия двух модуляторов работы Садепо — кофеина и рианодина, потенциирующих либо тормозащих мобилизацию депонированного Са2+ в терминалях.

2. Сопоставить действие кофеина и рианодина как миметиков выброса Са2+ из Са2±депо на частоту и характер спонтанной секреции квантов медиатора.

3. Исследовать среднюю величину квантов медиатора и распределение их размеров на фоне действия кофеина и рианодина.

4. Рассмотреть характер секреции «гигантских» квантов медиатора на фоне действия рианодина и кофеина как модуляторов активности Са2 -депо нервных терминалей.

Положения, выносимые на защиту:

1. В нервных терминалях моторных синапсов внутриклеточный депонированный Са2, мобилизуемый действием кофеина и рианодина, участвует в регуляции разных типов квантовой секреции ацетилхолина: усиливает Са2±зависимый вызванный выброс медиатора в ответ на нервный импульс, увеличивает частоту спонтанного высвобождения отдельных квантов медиатора.

2. Специфическая роль депонированного Са, мобилизуемого кофеином и рианодином, заключается в усилении спонтанной секреции особого пула крупных по размеру — т.н. «гигантских» — квантов медиатора, способных поддерживать передачу и возбуждение мышечного волокна без участия наружного кальция.

Новизна полученных результатов.

В работе получен ряд новых фактов, касающихся вклада депонированного Са2+ в регуляцию процессов секреции медиатора у синапсов. Впервые установлено, что при действии кофеина и рианодина, имеющих разный механизм и кинетику мобилизации Са2+ из Са2±депо, наблюдается качественно сходный эффект дозозависимое усиление спонтанной и вызванной квантовой секреции медиатора,.

2+ 2+ тогда как блок выброса Са из Садепо (с помощью 10 мкМ рианодина) приводит к значительному снижению уровня вызванной секреции медиатора. Впервые показано, что в условиях ритмической активности синапса усиленная мобилизация внутриклеточного Са кофеином может приводить к ограничению количества медиатора, выбрасываемого на каждый ритмический стимул, на всем протяжении залпа.

Впервые выявлена специфическая роль депонированного.

Са2+ в регуляции определенных режимов спонтанной секреции квантов медиатора. На фоне кофеина или рианодина значительно возрастает особый вид спонтанной секреции в виде так называемых «гигантских» квантов медиатора, в 2−10 раз превышающих размеры стандартного кванта медиатора.

Новыми являются также данные о том, что в бескальциевой среде потенциирующие эффекты кофеина и рианодина на частоту и размеры спонтанно секретируемых квантов медиатора становится более выраженными. Это позволяет думать, что при ограниченном поступлении наружного Са2 в терминаль мобилизация внутриклеточного депонированного Са2+ может играть роль резервного физиологического механизма регуляции секреции квантов и поддержания синаптической активности.

Научно-практическая ценность. Полученные в работе данные расширяют современные представления о роли кофеини рианодин-чувствительных Са2 -депо в активности нервных терминалей на примере периферических синапсов млекопитающих. В работе получены новые важные доказательства способности таких Са2±депо и мобилизуемого из них.

Са2+ участвовать в регулировании всех режимов секреции медиатора: спонтанного, вызванного и ритмического. Это позволяет взглянуть на внутриклеточные Са депо и депонированный Са2+ как на новый механизм и точку приложения медикаментозных средств, направленных на лечение нарушений синаптической передачи. Проведенное в работе сопоставление эффектов кофеина и рианодина как двух разных по механизмам действия модуляторов мобилизации депонированного могут оказаться полезными при разработке фармакологических аналогов этих препаратов, способных, избирательно воздействуя на рианодиновые рецепторы нервных терминалей, усиливать или модулировать синаптическую передачу.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ I. Роль ионов Ca в активности нейронов и синапсов.

Нормальное функционирование клетки во многом определяется ионным составом ее внутренней и наружной среды (Berne, Levy, 1990; Албертс и др., 1994). Среди ионов, регулирующих жизнедеятельность клеток, кальцию принадлежит л, особое место. Ca является самьм представительным из всех катионов у позвоночных (20−30 г/кг веса тела). Большая часть кальция в организме запасена в костной ткани, но практически все остальные клетки организма также запасают кальций в достаточно высоких количествах (в общей сумме — 2−10 мМ на клетку) — при этом клеточный кальций находится на 90−95% в связанном или депонированном состоянии (Berne, Levy, 1990).

Впервые внимание нейрофизиологов к ионам кальция было привлечено в связи с открытием в 70-ые годы «кальциевых» потенциалов действия (ПД) у нейронов, сердечных и других возбудимых клеток. Стало очевидным, что, наряду с ионами Na, ионы.

Са2+, входя в клетку при возбуждении по специальным кальциевым каналам, могут играть ведущую роль в деполяризации мембраны и генерации ПД в соме нейронов (Kostyuk et al., 1974; Костюк, Крышталь, 1981), в их коротких отростках — дендритах (Pockberger, 1991; Konnerth et al, 1992; Schiller et al., 1997), a также в нервных терминалях аксонов (Katz, Miledi, 1965; 1968). Однако уже в конце 70-х — начале 80-х годов стало очевидным, что роль ионов Ca2 как катионов, деполяризующих мембрану при генерации ПД, не является единственной и, по-видимому, главной ролью этих катионов у возбудимых клеток.

В последние 10 лет в практику физиологических экспериментов широко вошли новые методы флуоресцентного мшфоскопического отслеживания так называемого кальциевого сигнала — то есть колебаний уровня внутриклеточного кальция. Благодаря компьютерному мониторингу кальциевого сигнала, удалось воссоздать картину пространственно-временных колебаний уровня кальция в цитоплазме клетки (Tsien, 1980; 1981; Neher, Zucker, 1993). Изучение широкого круга эукариотических клеток (ооциты лягушки, железистые и секреторные клетки млекопитающих, мышечные клетки, центральные и периферические нейроны и их отростки) показало, что ионы Са2+ играют роль универсальных внутриклеточных посредников как у невозбудимых клеток (Berridge, 1993; 1995; 1997), так и у электровозбудимых клеток (Kuba, 1994; Brorson et at, 1991), В частности, у нейронов такие процессы, как дифференцировка и экспрессия генов, программируемая клеточная смерть нейронов, прорастание и спрутинг аксонов, синаптическая пластичность, нейрональная память, секреция медиатора и многие другие прямо зависят от регионального или генерализованого повышения уровня Са2+ внутри нервной клетки (Албертс и др., 1994; Brorson et.ai., 1991; Berridge, 1993; 1995; 1997; Simpson et al., 1995; Mironov, Hermann, 1996). Очевидно, что кальций как универсальный внутриклеточный посредник должен иметь возможность строго дифференцированно менять свою концентрацию и во времени, и в пространстве клетки. Для решения этой непростой задачи в клетке существует многоуровневая система депонирования и регионального высвобождения Ca2 в цитоплазму.

выводы.

1, Действие на нервные терминали кофеина (0,5 мМ) и рианодина (1 мкМ), способствующих мобилизации депонированного внутриклеточного Са, приводит к увеличению амплитуды одиночных ПКП, соответственно в 1.51 и 2.13 раза — за счет возрастания уровня вызванного выброса медиатора на нервный импульс,.

2, Блокада выброса Са2+ из Са2 -депо нервных терминалей рианодином (10 мкМ) приводит к снижению вызванного выброса квантов медиатора и уменьшению средней амплитуды одиночных ПКП в 2.86 раза.

3, В условиях ритмической активности синапсов (4−20 Гц) в присутствии 0.5 мМ кофеина наблюдается частотно-зависимое затормаживание выброса медиатора по всему ходу залпа, выражающееся в подавлении начального облегчения амплитуды ПКП, углублении начальной депрессии и снижении амплитуды ПКП на фазе «плато»,.

4, Кофеин (0.5−5,0 мМ) и рианодин (0,1−1.0 мкМ) вызывают однонаправленный дозозависимый прирост частоты МПКП в 3−4 раз, при этом эффекты рианодина характеризуются более медленной динамикой развития.

5, При действии кофеина (5 мМ) и рианодина (1 мкМ) в бескальциевом растворе с ЕвТА наблюдается в 9−45 раз более выраженный, но кратковременный прирост частоты спонтанной секреции квантов медиатора.

6, Кофеин и рианодин дозозависимым образом увеличивают дисперсию амплитуд МПКП и видоизменяют характер гистограмм амплитудных распределений МПКП за счет преимущественной секреции пула «гигантских» квантов медиатора, в 2−10 раз превышающих средние значения размера кванта ацетилхолина.

7, Стимулирование кофеином (1,0 мМ) и рианодином (1 мкМ) секреции увеличенных по размеру «гигантских» квантов медиатора усиливается в 2−3 раза в бескальциевом растворе.

8, Секреция пула «гигантских» квантов медиатора затормаживается при действии на терминали блокатора накачки медиатора в везикулы везамикола (1 мкМ).

9. Внутриклеточный депонированный Са2+ нервных терминалей синапсов является специфическим и многосторонним регулятором спонтанной и вызванной секреции квантов медиатора.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В данной работе была исследована спонтанная и вызванная секреция квантов медиатора ацетилхолина (АХ) в нервно-мышечных синапсах мыши в условиях острого действия кофеина и рианодина, являющихся эффективными фармакологическими модуляторами активности внутриклеточных Са2 -депо.

На основании полученных результатов и их анализа можно сделать ряд общих заключений.

Удалось показать, что действие и кофеина, и рианодина сопровождается специфическими изменениями активности синапсов, главным образом, на пресинаптическом уровне. Пресинаптические эффекты кофеина (миметика выброса Са из Садепо) и рианодина (двунаправенного модулятора активности выброса С а2 из Са2 -депо) затрагивают как спонтанную, так и вызванную активность синапсов и имеют характерные концентрационную, временную и температурную зависимости.

И кофеин (0.5 мМ) и рианодин (1 мкМ), усиливая (хотя и с помощью разных механизмов) выброс Са2+ из Са2±депо ЭР нервных терминалей, вызывают качественно сходные эффекты — достоверное увеличение уровня вызванного выброса медиатора АХ в ответ на одиночные нервные импульсы с частотой 0.3 Гц. При этом потенциирующие эффекты кофеина и рианодина имеют разную кинетику и степень выраженности. На наш взгляд, эти различия хорошо укладываются и могут быть объяснены спецификой механизмов, с помощью которых кофеин и рианодин открывают Са2 -каналы рианодиновых рецепторов в составе Са2 -депо (см. «Результаты и обсуждение»). Мы также установили, что блокада выброса Са из Са2 -депо с помощью высокой (10 мкм) дозы рианодина (приводящей к запиранию.

Са2+.

— каналов рианодиновых рецепторов в закрытом состоянии) сопровождается значительным снижением уровня выброса медиатора, которое развивается на протяжении десятка минут.

Согласно традиционным представлениям, и сам акт выброса медиатора, и его уровень определяются кальцием, поступающим по Са2 -каналам синаптической мембраны из наружной среды. Однако входящий снаружи Са2+ имеет строго ограниченный пространственный ареал действия — в пределах десятка нанометров удаления от Саканалов термина ли (Kasai, Petersen, 1994; Kasai, 1999). Поэтому роль наружного Са2+ ограничивается воздействием лишь на строго локализованный и тесно сцепленный с.

Са2+ -каналами комплекс белков (типа синаптотагмина), определяющих лишь самый последний, конечный акт слияния везикул с синаптической мембраной (Van der Kloot, Molgo, 1994), Тогда как многие другие Са2±зависимые белки и реакции, являющиеся составной частью механизма электросекреторного сопряжения, пространственно отставлены от наружной мембраны, могут регулироваться лишь за счет Са, выбрасываемого из внутриклеточных источников. у*.

Вопрос о том, достаточными ли являются количества Са, поступающие из наружной среды при нервном импульсе, для поддержания необходимого уровня выброса медиатора, по существу, мало изучен. Известно лишь, что забуферивание колебаний внутриклеточной концентрации кальция органическими хелатирующими буферами типа АМ-ВАРТА приводят к снижению (но не полной блокаде) вызванного выброса (Van der Kloot, Molgo, 1994).

Наши данные свидетельствуют, что одним из физиологически значимых источников Са2+ в нервной терминали могут быть Са2±депо ЭР, чувствительные к действию кофеина и рианодина. Мы показали, что вызванный выброс медиатора может существенно зависеть и регулироваться за счет депонированного Са2+ как при одиночной, так и при ритмической активности синапса. Мы впервые провели систематический анализ и описание рисунка залповой ритмической активности синапса в зависимости от частоты имульсации (0.3−20 Гц), Были выявлены диапазоны частот, при которых наиболее выражены характерные процессы, имеющие место при ритмической стимуляции, а именно — начальное облегчение, депрессия и фаза плато. Мы установили, что кофеин, несмотря на его способность усиливать квантовый состав и амплитуду одиночных ПКП, не влияет на процесс начального облегчения выброса в ритмическом залпе, и, более того, способствует развитию депрессии передачи в ходе ритмической активности во всем обследованном диапазоне частот. Хорошо известно, что агенты, усиливающие работу Са2±каналов наружной мембраны и увеличивающие «вброс» Са2+ из наружной среды во время нервного импульса, вызывают аналогичные изменения в рисунке ритмического залпа — менее выраженным становится облегчение в начале залпа и более выраженной — депрессия и скорость выхода на плато (Маепо, Enomoto, 1988; Van der Kloot, Molgo, 1994), Считается, что увеличение квантового состава одиночных ПКП в случае усиления поступления наружного Са2+ приводит к более быстрому расходу пула готового к высвобождению медиатора и, как следствие, к более быстрым и выраженным процессам депрессии квантового состава и амплитуды ПКП в ритмическом залпе (Каменская, 1972; Vau der Kloot,.

2+.

Molgo, 1994). Наши исследования показали, что усиление поступления Ca из.

А, другого источника — из Caдепо — под действием кофеина, по существу, вызывает аналогичные эффекты. Однако важно отметить, что в случае действия кофеина (то есть усиленного выброса депонированного Са2+) оказывается менее выраженными не только процесс начального облегчения, и не только усиливается процесс начальной депрессии, но также снижается средний уровень выброса АХ и в «хвосте» залпа, на стадии плато (когда имеет место уже установившийся баланс межу количеством расходуемого (выбрасываемого) и пополняемого медиатора).

Наши результаты, в общем, совпадают с немногочисленными данными ряда других авторов, проводивших анализ эффектов кофеина и рианодина на некоторых центральных и периферических синапсах теплокровных и холоднокровных (Wilson, 1973; Roed, 1982; Nishimura et al" 1990; Cumian, Smith, 1997) и показавших, что под действием кофеина (в миллимолярных дозах) и рианодина (в нано-субмикромолярных дозах) увеличивается уровень вызванного выброса медиатора в ответ на нервный импульс.

Полученные нами данные подтвердили и значительно расширили представление о том, что депонированный Са2+ может усиливать не только вызванную, но и спонтанную секрецию медиатора, В работе удалось впервые выявить специфическую роль депонированного Са2+ как эндогенного внутриклеточного регулятора и усилителя секреции «гигантских» квантов медиатора, проявлением которых являются так называемые «гигантские» МПКП (гМПКП), Особенностью «гигантских» квантов или порций АХ является тот факт, что, во-первых, они столь велики, что выброс одного такого кванта часто может вызвать генерацию мышечного ПД и сокращение мышечного волокна, и, во-вторых, в нормальных условиях работы синапса спонтанная секреция таких «гигантских» порций АХ крайне редка (частота гМПКП обычно ниже 0.01 Гц), Мы впервые показали, что усиленное кофеином (1−5 мМ) и рианодином (1 мкМ) поступление депонированного Са2+ в аксоплазму терминали сопровождается резким приростом частоты гМПКП, свидетельствуя о возрастании частоты секреции гигантских порций АХ под действием именно и только депонированного внутриклеточного Са2. В пользу такой интерпретации данных говорит и тот факт, что на фоне блокирования рианодиновых рецепторов и выброса Са2+ из Са2±депо (с помощью 10 мкМ рианодина) кофеин (1 мМ) оказался не способным вызвать секрецию гигантских квантов АХ. Кроме того, обнаружена еще одна интересная и, на наш взгляд, принципиальная особенность секреции гМПКП. Оказалось, что индуцируемый кофеином (1−5 мМ) или рианодином (1 мкМ) прирост частоты гМПКП ставится значительно более выраженным в бескальциевом растворе. Это п позволяет сделать заключение, что в отсутствии поступления Са из наружной среды система мобилизации депонированного кальция становится более активной и значимой в секреции квантов медиатора и работе синапса.

На наш взгляд, Са2 -депо и мобилизуемый из них Са2 могут играть роль особого резервного механизма, поддерживающего и усиливающего Са2±зависимую секрецию медиатора при длительном отсутствии нервных импульсов и поступления Са2+ снаружи. При патологических или функциональных нарушениях «срабатывания» нервного импульса и поступления Са2+ из наружной среды в терминаль, спонтанная секреция гигантских квантов АХ, усиливаемая за счет депонированного Са, фактически может имитировать импульсную активность синапса и поддерживать мышечный тонус при отсутствии естественной нервной им пульсации мотонейрона.

Таким образом, полученные в работе данные позволяют рассматривать Са2 -депо и мобилизуемый из них внутриклеточный.

Са2+ как систему многообразной функционально значимой регуляции спонтанной и вызванной секреции медиатора в нервных терминалях синапсов.