Роль белков р53 и р73 в ответе опухолевых клеток на действие ДНК-повреждающих агентов

ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Р73а в клетки опухолей яичников А2780 не препятствовало росту клонов. Было логично предположить, что р73, может изменить гибель опухолевых клеток при обработках. Тем более закономерно стало это предположение после открытия того, что р73 может активироваться при действии повреждающих агентов, как и р53 (Yuan et al., 1999) — (Costanzo et al., 2002).0казалось, что он активируется не только на уровне… Читать ещё >

Содержание

1. ВВЕДЕНИЕ
2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
- 2. 1. Белок р53, открытие, структура и его мутации в опухолях
- 2. 2. Функции р53 в регуляции клеточного цикла в нормальных условиях 12 и после действия ДНК-повреждающих агентов. Роль р53 в апоптозе и репарации ДНК
- 2. 3. Участие р53 в ответе опухолевых клеток на действие 21 противоопухолевых препаратов
- 2. 4. Белок р73, открытие, структура, р73 сплайсинговые изоформы, 24 экспрессия в опухолях
2.5. Функции р73, как транскрипционного активатора. Специфические транскрипционные активности сплайсинговых вариантов р73, взаимодействие с р53 и другими клеточными белками. Роль р73 в развитии и туморогенезе на моделях мышей с нокаутом по гену р73 Участие р73 в ответе опухолевых клеток на противоопухолевые препараты.
2.6. Роль изоформ DNp73a и р53 в определении чувствительности клеток 34 к противоопухолевым препаратам.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Клеточные линии и их культивирование
3.2. Обработка клеток ДНК-повреждающими агентами
3.3. Плазмиды, трансфекции, селекция клонов и популяций клонов
3.4. Оценка цитотоксического эффекта по методу МТТ
3.5. Оценка цитотоксичности по критерию клоногенности
3.6. Определение апоптоза с использованием Аннексина V
3.7. Нозерн и Саузерн блоттинг
3.8. ОТ-ПЦР
3.9. Определение экспрессии генов микроэррэй анализом
3.10. Определение белка с использованием иммуноблотинга. Антитела, 46 используемые в работе
3.11.Определение про моторной активности с использованием 46 люциферазного метода (Luc-assay) и метода ацетилирования хлорамфеникола (CAT-assay).
3.12. ОТ-ПЦР в реальном времени (real-time RT-PCR)
3.13 Ядер ные экстракты и гель-ретардация
3.14. Определение репарационной способности клеток с использованием метода реактивации поврежденной плазмиды клеткой хозяина
3.15. Иммунофлуоресценция. Иммуногистохимический анализ экспрессии генов.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Р53 и контроль клеточного цикла
4.1.1. Создание модели, экспрессирующей температурочувствительный р53. р53 вызывает блок G2 клеточного цикла.
4.1.2. Транскрипция генаp21/wafl может регулироваться по р53 — 57 независимому пути
4.1.3. Р53 подавляет транскрипцию промотора гена Топоизомеразы 2а
4.1.4. Р53 и ответ клеток на действие противоопухолевых препаратов
4.1.4.1. Роль р53 в ответе на обработку доксорубицином
4.1.4.2. Р53 и действие таксола
4.1.4.3. Р53 и ответ на обработку цисплатиной
4.1.4.4. 72 Pro/Arg р53 полиморфизм в сочетании с «горячими» 76 точковыми мутациями в ДНК-связывакяцем домене и чувствительность к ДНК-повреждающим агентам
4.2. Р73 — второй член семейства р
4.2.1. Взаимодействие р73 и р
4.2.2. Р73 и гены репарации ДНК
4.2.3. Р73 и ангиогенез
4.2.3.1. Р73 и регуляция TSP-1 и VEGF
4.2.3.2. Р73 и васкуляризация опухолей in vivo
4.2.4.Регуляция р73 после действия ДНК-повреждающих агентов
4.2.4.1. Индукция р73 РНК и белка
4.2.4.2. Индукция активности промотора после обработки 103 доксорубицином
4.2.4.3. Участие транскрипционного фактора С/ЕВРа в индукции 104 промотора р
4.2.5. Р73а гиперэкспрессия в клетках опухолей яичников и 108 чувствительность к обработкам ДНК-повреждающими агентами
4.2.6. Изоформа DNp73a и ее роль в ответе опухолевых клеток при 111 действии противоопухолевых препаратов
5. ОБСУЖДЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ

Роль белков р53 и р73 в ответе опухолевых клеток на действие ДНК-повреждающих агентов (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Актуальность исследования.

Несмотря на существенные успехи в лечении опухолевых заболеваний, эта патология продолжает занимать одно из первых мест среди болезней, приводящих к летальному исходу (Cannistra, 1993). Не вызывают сомнения данные о том, что в большинстве случаев на первых этапах лечения достигается положительный химиотерапевтический эффект. Однако выздоровление наступает только у незначительной части больных (Berek et al., 1999). Поэтому усилия многих научных групп направлены на изучение молекулярно-генетических механизмов, ответственных за чувствительность и резистентность опухолей к фармакологическим препаратам, используемым в онкологической практике. Идентифицирована большая группа генов, которые ответственны за чувствительность опухолевых клеток к цитостатикам разного механизма действия. Среди них особое место занимают гены, продукты которых участвуют в контроле клеточного цикла, эксцизионной репарации ДНК и апоптоза. Внимание к ним закономерно, так как, с одной стороны, нарушение их экспрессии приводит к нежелательной пролиферации клеток, а с другой — они вовлекаются в ответ клеток на повреждающее или антипролиферативное действие лекарственных препаратов.

Открытие супрессора опухолевого роста — белка р53, нарушение функции которого обнаруживается более чем в 50% опухолей человека (Harris, 1996), закономерно сделало первостепенным изучение его роли в ответе опухолевых клеток на химиотерапевтические воздействия. Накоплен большой экспериментальный материал о связи статуса р53 (нормальный или мутантный) в разных типах опухолей с их чувствительностью к цитостатикам разной природы, показанных для терапии данных типов опухолей. Однако эти данные крайне противоречивы. По-видимому, это связано с существованием множества различных типов мутаций в гене р53, а также наличием полиморфизма.

Наиболее распространенной и изученной является замена 347G/C, приводящая к замене 72 R/P в области, богатой пролином, не нарушающего свойств нормального р53 (Matlashewski et al., 1987).

Возможно, что чувствительность клеток к различным воздействиям зависит от сочетания типа полиморфизма, который несет нормальный белок и мутаций в гене р53, однако эти данные также противоречивы (Bergamaschi et al., 2003; Concin et al., 2005). Вероятно, что в некоторых типах опухолей сочетание 72/R с мутациями в коровом домене приводит к большей резистентности, чем сочетание 72/Р с теми же мутациями. Высоко вероятно, что это может быть следствием взаимодействия мутантного р53 с другим, открытым позже белком р73 (Kaghad et al., 1997), продуктом гена, также принадлежащего семейству р53. Из первичного продукта транскрипции гена р73 в результате альтернативного сплайсинга 5'- и 3'-концов и альтернативного полиаденилирования формируется ряд изоформ р73, которые проявляют в отношении р53 разнонаправленную модулирующую активность (Melino et al., 2002).

Анализ накопленных данных позволяет считать, что ответ опухолевых клеток является специфичным, как для данного типа клеток, так и для данного фармакологического вещества, и связан со специфическими факторами данной клетки, которые могут 2.

выводы.

1. Опухолевый супрессор р53 участвует в регуляции клеточного цикла, вызывая блоки G1 и G2 при действии ДНК-повреждающих агентов. Будучи транскрипционным фактором, р53 активирует гены, негативно регулирующие клеточный цикл, такие как р21 Wafl, и репрессирует транскрипцию генов, участвующих в репарации повреждений ДНК, таких как топоизомераза 2а. Установлено, что активация p21Wafi может происходить по р53-независимому механизму.

2. В определенных условиях р53 может не только сенсибилизировать клетки к повреждающим агентам, но и повышать их резистентность. Экспрессия транскрипционно-активного р53 в клетках различных опухолей приводит к повышению резистентности клеток к доксорубицину — ингибитору топоизомеразы 2а, таксолу — агенту, действующему на митотический аппарат, и цисплатине — агенту, вызывающему повреждения ДНК.

3. Наличие полиморфизма в пролин-богатой области белка р53 72P/R в сочетании с определенными «горячими» точковыми мутациями в ДНК-связывающем домене р53 может существенно менять ответ клеток на действие ДНК-повреждающих агентов.

4. Белок р73, относящийся к семейству р53 и имеющий большую степень гомологии с р53, может обладать онкогенными свойствами. Как транскрипционный фактор, р73 способен конкурировать с р53 за регуляторные последовательности, находящиеся в промоторных участках р53-зависимых генов-мишеней, и снижать их транскрипцию.

5. Установлено, что р73 активирует XPD, XPG и ХРВ, принимающие участие в эксцизионой репарации ДНК и, таким образом, повышает способность клеток репарировать повреждения ДНК. Это приводит к повышению резистентности к таким агентам, как цисплатина и ультрафиолетовое облучение (УФ). р73 усиливает процесс васкуляризации опухолей, повышая экспрессию VEGF и репрессируя антиваскулярный фактор TSP-I.

6. С-ЕВРа, как впервые показано ингибирует активность промотора гена р73, что приводит к подавление его транскрипции. При обработке клеток доксорубицином С-ЕВРа диссоциирует от промотора р73, что приводит к активации промоторной активности.

7. Изоформа р73 — DNp73a, образующаяся при инициации транскрипции с альтернативного промотора и не имеющая транс-активирующего домена, не обладает вследствие этого транскрипционной активностью. Данная изоформа обладает способностью подавлять трансактивирующий потенциал как р53, так и р73. Поскольку DNp73a экспрессируется во многих типах опухолей, предполагалось, что уровень экспрессии DNp73a может модулировать клеточный ответ на действие различных противоопухолевых препаратов. По нашим данным оказывается, что DNp73a не является существенным детерминантом резистентности.

соответствующего типа. Мы наблюдали увеличение резистентности к доксоруб ицину в присутствии дикого типа р53 по сравнению с изогенной линией SKOV3, лишенной продукции р53. Многообразие генов, активируемых р53, становится все более и более очевидным. Наше заключение не кажется совершенно неожиданным после открытия в последнее время нового генамишени р53 TIGER (Bensaad et al., 2006). TIGER был открыт в микро-эррэй экспериментах при индукции дикого типар53. Экспрессия этого гена наблюдалась в целом ряде опухолевых клеток. Интересно, что элиминация экспрессии TIGER с помощью техники si-RNA приводила к сенсибилизации опухолевых клеток к доксорубицину. Аналогичные данные о сенсибилизации при удалении р53 к доксорубицину были получены на клетках, лишенных р53 в результате гомологичной рекомбинации в линии НСТ116, относящейся к опухолям кишечника (Bunz et al., 1999). При применении другого противоопухолевого агента — цисплатины, оказалось что в некоторых типах клеток инактивация р53 приводит к сенсибилизации при обработках, что по-видимому связано с неспособностью к репарации повреждений, вызываемых цисплатиной в отсутствии р53. Похожие данные и аналогичные выводы были сделаны в другой работе на клетках опухоли груди MCF7 при обработке цисплатиной (Fan et al., 1995) .Таксол, широко используемый при лечении опухолей яичников и действующий на митотический аппарат клеток, также был включен в наши эксперименты. Мы не обнаружили усиления действия таксола в опухолевых клетках, несущих р53. Как раз наоборот, инактивация р53 приводила к сенсибилизации к таксолу, аналогичные данные приводятся в литературе: элиминация р53 с помощью продукта HPV16 Е6 приводила к повышенной чувствительности к таксолу (Wahl et al., 1996). Мы объясняем наши данные отсутствием блока G1, что приводило к ускоренному вступлению клеток, лишенных р53, в митоз и последующей гибели. Таким образом, не получив данные о том, что присутствие р53 сенсибилизирует опухоли, мы тем не менее делаем важный вывод о том, что следует продолжать поиск важных детерминант, и не основываться только на статусе р53. В 1997 был открыт белок р73, что явилось важным событием для исследователей, исследующих р53. Открытие р73 практически образовало семейство р53, которое теперь все время продолжает увеличиваться и включает в настоящее время рбЗ и многочисленные изоформы р53. р73, имеющий большую гомологию с р53, практически очень редко приобретает мутации при опухолеобразовании. Но, если в нормальных клетках р73 экспрессируется на очень низком уровне, при развитии опухолей его количество сильно повышается. Существует мнение, что обладая структурой и транскрипционными свойства, очень схожими с р53, р73 может взять на себя роль р53 когда р53 больше не функционирует. При исследовании р73а в ответе опухолевых клеток мы применили тот же подход, как и в случае р53: получение изогенных линий.

Введение

р73а в клетки опухолей яичников А2780 не препятствовало росту клонов. Было логично предположить, что р73, может изменить гибель опухолевых клеток при обработках. Тем более закономерно стало это предположение после открытия того, что р73 может активироваться при действии повреждающих агентов, как и р53 (Yuan et al., 1999) — (Costanzo et al., 2002).0казалось, что он активируется не только на уровне белка, но и на уровне промоторной активности (Marabese et al., 2003).Мы впервые показали в нашей работе, что промотор р73 находится под негативной регуляцией транскрипционного фактора СЕВР/а. При обработке доксорубицином происходит отсоединение СЕВР/а от промотора р73, и происходит активации за счет связывания с позитивным регулятором E2F1. Мы начали наши исследования с целью понять, какую роль может играть р73 в ответе клеток. Мы обнаружили ряд новых свойств этого белка. Оказалось, что р73 может в некоторых типах опухолей конкурировать с р53 за регуляторные последовательности в генах (Vikhanskaya et al., 2000). Наши данные подтверждались и в других работах (Ueda et al., 1999а). Используя технику микроэррэй мы показали, что р73 индуцирует ряд генов, принимающих участие в эксцизионной репарации и может усиливать репарационные способности клеток. Этот факт привел к увеличению резистентности к обработке цисплатиной. В литературе позднее появились аналогичные данные (Nyman et al., 2005). Присутствие р73 активировало ангиогенез в нашей модели опухолей яичников как in vitro так и in vivo. Р73а подавлял продукцию антиангиогенного фактораТ8Р-1 и усиливал продукцию проангиогенного фактора VEGF. В присутствии экспрессии р73а васкуляризация опухолей ус ил ивалас b (Vikhan skaya et al., 2001). В другой работе, выполненной при исследовании миграции клеток, также оказалось, что р73а усиливал этот процесс (Sablina et al., 2003).

Недавно мы показали (Vikhanskaya et al., 2007b), что в присутствии c-jun р73 активирует целый ряд генов, имеющих в промоторе регуляторную последовательность АР-1. Одним из таких генов является циклин Д, способствущий пролиферации клеток. Роль р73 как антионкогена не является очевидной на существующем уровне исследований. В нашей работе мы посвятили особое место изучению одной из изоформ р73: DNp73a, которая присутствует в изобилии во многих опухолях. Эта изоформа была первоначально открыта в нейронах, и оказалось, что она обладает свойством ингибировать апоптозную активность р73 (Pozniak et al., 2000а). Позже высокий уровень ANp73a нашли в опухолях (Ishimoto et al., 2002а). Существуют клинические данные о том, что экспрессия этой формы является показателем плохого прогноза для пациентов, имеющих патологию опухолей яичников. Нами была создана тетрациклининдуцируемая форма DNp73a в клетках опухолей кишечника и проверена чувствительность к различным химитерапевтическим агентам (Marabese et al., 2005). К сожалению, оказалось, что обладая способностью подавлять активность р53, изоформа DNp73a, исследованная в нашей работе, не влияет на окончательный ответ клетки, и не может являться определяющим детерминантом в чувствительности. Особенно трудно сделать заключение об увеличении чувствительности в результате экспрессии дикого типа р53 и р73 при анализе результатов, полученых на опухолях яичников. Этот тип новообразований отличается очень низким уровнем апоптоза по сравнению с другими видами новообразований. Отсутствие апоптоза, и присутствии р53 может усилить репарационные процессы и увеличение резистентности. В целом «реставрация «апоптозного фенотипа может кардинально усилить чувствительность опухолевых клеток. Пути реставрации апоптоза интенсивно изучаются. Следует ясно представлять, что если имеются опухоли, которые сохраняют дикий типр53, и таких примеров немало, в клетках в процессе карциногенеза произошли изменения, сделавшие р53 неспособным к своим обычным функциям. Вполне вероятно, что эти нарушения, которые могут быть как в трансактивационных путях, стоящих выше р53, так и на уровне передачи информации на гены мишени р53 и являются причиной того, что присутствие дикого типар53 не является фактором, способствующим гибели опухолевых клеток.

Комбинирование классических хемотерапевтических лекарств с агентами, которые могут изменить сигнальные пути, нарушенные в клетках опухолей яичников, является очень перспективным подходом. Нахождение генетических дефектов и характеристика новых генов может помочь в определении более эффективной стратегии, принимающей во внимание генетические изменения. Исследования экпрессии генов на различных стадиях развития опухолей на клиническом оперативном материале с применением техники микроэррэй и Реал тайм ОТ ПЦР и выявление новых мишений в настоящее время является одним из самых многообещающих подходов. Это позволяет выявить широкий спектр изменений, применение современных методов статистики дает объективную оценку результатов.

Очевидно, что определение статуса р53 и р73 в опухолях не является само по себе достаточным для прогноза и выбора лечения. Более того, в самое последнее время стало очевидно, что семейство р53 содержит множество изоформ, которые проявляют антагонизм по отношению к дикому типу р53 (Bourdon et al., 2005). Это еще большее усложняет картину. Становится ясно, что не одни мутации в р53, а даже члены того же семейства, экспрессирующиеся в некоторых типах опухолей, обладают доминантно-негативной активностью по отношению к р53. К настоящему времени еще не существует набор антител к р53, который бы позволил достоверно дифференцировать эти изоформы. Поиск генетических детерминант, которые могут надежно быть использованы в клиники для определения типа лечения все время продолжается. Очевидно, требуется индивидульный подход в каждом особом случае и необходимы дальнейшие поиски специфических препаратов.

Показать весь текст

Список литературы

Ф.Л.Виханская, Т. В. Поспелова, И. В. Волков, А. Н. Кукушкин, С. Б. Светликова, В. А. Поспелов. (1991).Продукт генар53 вовлечен в регуляцию активности промотора протоонкогена c-fos. Доклады Академии наук СССР. 321(4) — 846−9.1. Reference List
Agarwal, M.L., Agarwal, A., Taylor, W.R., and Stark, G.R. (1995). p53 controls both the G2/M and the G1 cell cycle checkpoints and mediates reversible growth arrest in human fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92, 8493−8497.
Ando, T., Kawabe, T., Ohara, H., Ducommun, B., Itoh, M., and Okamoto, T. (2001). Involvement of the interaction between p21 and proliferating cell nuclear antigen for the maintenance of G2/M arrest after DNA damage. J. Biol. Chem. 276,42 971−42 977.
Banin, S., Moyal, L., Shieh, S., Taya, Y., Anderson, C.W., Chessa, L., Smorodinsky, N.I., Prives, C., Reiss, Y., Shiloh, Y., and Ziv, Y. (1998). Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science. 281,1674−1677.
Belloni, L., Moretti, F., Merlo, P., Damalas, A., Costanzo, A., Blandino, G., and Levrero, M. (2006). DNp73alpha protects myogenic cells from apoptosis.Oncogene. 25,3606−3612.
Benoit, V., Hellin, A.C., Huygen, S., Gielen, J., Bours, V., and Merville, M.P. (2000). Additive effect between NF-kappaB submits and p53 protein for transcriptional activation of human p53 promoter. Oncogene. 19, 4787−4794.
Bensaad, K., Tsuruta, A., Selak, M.A., Vidal, M.N., Nakano, K., Bartrons, R., Gottlieb, E., and Vousden, K.H. (2006). TIGAR, a p53-inducible regulator of glycolysis and apoptosis. Cell. 126, 107−120.
Bergamaschi, D., Gasco, M., Hiller, L., Sullivan, A., Syed, N., Trigiante, G., Yulug, I., Merlano, M., Numico, G., Comino, A., Attard, M., Reelfs, 0., Gusterson, B., Bell, A.K., Heath, V., Tavassoli, M.,
Farrell, P.J., Smith, P., Lu, X., and Crook, T. (2003b). p53 polymorphism influences response in cancer chemotherapy via modulation of p73-dependent apoptosis. Cancer Cell .5, 387−402.
Blagosklonny, M.V., Schulte, T.W., Nguyen, P., MimnaughJB.G., Trepel, J., and Neckers, L. (1995). Taxol induction of p21 WAF1 and p53 requires c-raf-1. Cancer Res. 55,4623−4626.
Bourdon, J.C., Fernandes, K., Murray-Zmijewski, F., Liu, G., Diot, A., Xirodimas, D.P., Saville, M.K., and Lane, D.P. (2005). p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity. Genes Dev. 19,2122−2137.
Braithwaite, A.W., Del Sal, G., and Lu, X. (2006). Some p53-binding proteins that can function as arbiters of life and death. Cell Death. Differ. 13,984−993.
Browder, T., Folkman, J., Hahnfeldt, P., Heymach, J., Hlatky, L., Kieran, M., and Rogers, M.S. (2002). Antiangiogenic therapy and p53. Science. 297,471.
Bunz, F., Dutriaux, A., Lengauer, C., Waldman, T., Zhou, S., Brown, J .P., Sedivy, J.M., Kinzler, K.W., and Vogelstein, B. (1998). Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage. Science .282,1497−1501.
Bunz, F., Hwang, P.M., Torrance, C., Waldman, T., Zhang, Y., Dillehay, L., Williams, J., Lengauer, C., Kinzler, K.W., and Vogelstein, B. (1999). Disruption ofp53 in human cancer cells alters the responses to therapeutic agents. J. Clin. Invest .104,263−269.
CaelIes, C., Helmberg, A., and Karin, M. (1994). p53-dependent apoptosis in the absence of transcriptional activation ofp53-target genes. Nature.57(9,220−223.
Carrassa, L., Broggini, M., Vikhanskaya, F., and Damia, G. (2003). Characterization of the 5'flanking region of the human Chkl gene: identification ofE2Fl Junctional sites Cell Cycle. 2,604−609.
Cassinelli, G., Supino, R., Perego, P., Polizzi, D., Lanzi, C., Pratesi, G., and Zunino, F. (2001). A role for loss ofp53 function in sensitivity of ovarian carcinoma cells to taxanes. Int. J. Cancer. 92, 738−747.
Codegoni, A.M., Bertoni, F., Patregnani, C., Marinetti, E., D’Incalci, M., and BrogginiJVL (1999). Allelic expression of p73 in human ovarian cancers Ann. Oncol. 10,949−953.
Colella, G., Vikhanskaya, F., Codegoni, A.M., Bonazzi, C., D’Incalci, M., and Broggini, M. (1998). hMLHl and hMSH2 expression and BAX frameshift mutations in ovarian cancer cell lines and tumors.Carcinogenesis. 19,691−694.
Dameron, K.M., Volpert, O.V., Tainsky, M.A., and Bouck, N. (1994). Control of angiogenesis in fibroblasts by p53 regulation ofthrombospondin-1. Science 265,1582−1584.
Damia, G., Filiberti, L., Vikhanskaya, F., Carrassa, L., Taya, Y., D’Incalci, M., and Broggini, M. (2001). Cisplatinum and taxol induce different patterns ofp53 phosphorylation. Neoplasia. 3,1016.
Davison, T.S., Vagner, C., Kaghad, M., Ayed, A., Caput, D., and Arrowsmith, C.H. (1999). p73 and p63 are homotetramers capable of weak heterotypic interactions with each other but not with p53. J. Biol. Chem. 274, 18 709−18 714.
Debernardis, D., Sire, E.G., De Feudis, P., Vikhanskaya, F., VaIenti, M., RussoJP., Parodi, S., D’Incalci, M., and BrogginiJVL (1997). p53 status does not affect sensitivity of human ovarian cancer cell lines to paclitaxel. Cancer Res. 57, 870−874.
Di Como, C.J., Gaiddon, C., and Prives, C. (1999). p73 function is inhibited by tumor-derived p53 mutants in mammalian cells. Mol. Cell Biol. 19,1438−1449.
Downes, C.S., Clarke, DJ., Mullinger, A.M., Gimenez-Abian, J.F., Creighton, A.M., and Johnson, R.T. (1994). A topoisomerase II-dependent G2 cycle checkpoint in mammalian cells/. Nature. 372,467−470.
El Deiry, W.S., Tokino, T., Velculescu, V.E., Levy, D.B., Parsons, R., Trent, J.M., Lin, D., Mercer, W.E., Kinzler, K.W., and Vogelstein, B. (1993). WAF1, a potential mediator of p53 tumor suppression. Cell .75, 817−825.
Eliyahu, D., Michalovitz, D., Eliyahu, S., Pinhasi-Kimhi, 0., and Oren, M. (1989). Wild-type p53 can inhibit oncogene-mediated focus formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86, 8763−8767.
Fan, S., Smith, M.L., Rivet, D.J., Duba, D., Zhan, Q., Kohn, K.W., Fornace AJ-, Jr., and O’connor, P.M. (1995). Disruption ofp53 function sensitizes breast cancer MCF-7 cells to cisplatin and pentoxifylline. Cancer Res. 55, 1649−1654.
Fink, D., Aebi, S., and Howell, S.B. (1998). The role of DNA mismatch repair in drug resistance. Clin. Cancer Res. 4, 1−6.
Finlay, C.A., Hinds, P.W., and Levine, A.J. (1989). The p53 proto-oncogene can act as a suppressor of transformation. Cell .57,1083−1093.
Flores, E.R., Tsai, K.Y., Crowley, D., Sengupta, S., Yang, A-, McKeon, F., and Jacks, T. (2002). p63 and p73 are required for p53-dependent apoptosis in response to DNA damage. Nature.476, 560 564.
Folkman, J. and Hanahan, D. (1991). Switch to the angiogenic phenotype during tumorigenesis. Princess Takamatsu Symp. 22,339−347.
Frazier, M.W., He, X., Wang, J., Gu, Z., Cleveland, J.L., and Zambetti, G.P. (1998). Activation of c-myc gene expression by tumor-derived p53 mutants requires a discrete C-terminal domain. Mol. Cell Biol. 18, 3735−3743.
Gatz, S.A. and Wiesmuller, L. (2006). p53 in recombination and repair. Cell Death. Differ. 13, 1003−1016.
Giannakakou, P., Sackett, D.L., Ward, Y., Webster, K.R., Blagosklonny, M.V., and Fojo, T. (2000). p53 is associated with cellular microtubules and is transported to the nucleus by dynein. Nat. Cell Biol. 2, 709−717.
Giono, L.E. and Manfredi, J.J. (2006). The p53 tumor suppressor participates in multiple cell cycle checkpoints. J. Cell Physiol. 209, 13−20.
Gong, J.G., Costanzo, A., Yang, H.Q., Melino, G., Kaelin, W.G., Jr., Levrero, M., and Wang, J.Y. (1999). The tyrosine kinase c-Abl regulates p73 in apoptotic response to cisplatin-induced DNA damage. Nature .399, 806−809.
Gonzalez, S., Prives, C., and Cordon-Cardo, C. (2003). p73alpha regulation by Chkl in response to DNA damage. Mol. Cell Biol. 23, 8161−8171.
Gottifredi, V., Kami-Schmidt, О., Shieh, S.S., and Prives, C. (2001). p53 down-regulates CHK1 through p21 and the retinoblastoma protein. Mol. Cell Biol. 21,1066−1076.
Graniela Sire, E.A., Vikhanskaya, F., and Broggini, M. (1995). Sensitivity and cellular response to different anticancer agents of a human ovarian cancer cell line expressing wild-type, mutated or no p53. Ann. Oncol. 6, 589−593.
Gregoiy, R.E. and DeLisa, A.F. (1993). Paclitaxel: a new antineoplastic agent for refractoiy ovarian cancer. Clin. Pharm. 12,401−415.
Gudkov, A.V. and Komarova, E.A. (2005). Prospective therapeutic applications ofp53 inhibitors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 726−736.
Harris, С .С. (1996). Structure and function of the p53 tumor suppressor gene: clues for rational cancer therapeutic strategies. J. Natl. Cancer Inst. 88, 1442−1455.
Haupt, Y., Maya, R., Kazaz, A., and Oren, M. (1997). Mdm2 promotes the rapid degradation of p53.Nature. 387, 296−299.
Hermeking, H., Lengauer, C., Polyak, K., He, T.C., Zhang, L., Thiagalmgam, S., Kinzler, K.W., and Vogelstein, B. (1997). 14−3-3 sigma is a p53-regulated inhibitor of G2/M progression. Mol. Cell i, 3−11.
Hochhauser, D., Stanway, C.A., Harris, A.L., and Hickson, I.D. (1992a). Cloning and characterization of the 5'-flanking region of the human topoisomerase II alpha gene. J. Biol. Chem. 267, 18 961−18 965.
Hochhauser, D., Stanway, C.A., Harris, A.L., and Hickson, I.D. (1992b). Cloning and characterization of the 5'-flanking region of the human topoisomerase П alpha gene J. Biol. Chem. 267,18 961−18 965.
Jost, C.A., Marin, M.C., and Kaelin, W.G., Jr. (1997). p73 is a simian correction of human. p53-related protein that can induce apoptosis. Nature. 389, 191−194.
Kastan, M.B., 0nyekwere, 0., Sidransky, D., Vogelstein, B., and Craig, R.W. (1991). Participation of p53 protein in the cellular response to DNA damage. Cancer Res. 51, 6304−6311.
Kern, S.E., Kinzler, K.W., Baker, S.J., Nigro, J.M., Rotter, V., Levine, A.J., Friedman, P., Prives, C., and Vogelstein, B. (1991). Mutant p53 proteins bind DNA abnormally in vitro. Oncogene. 6, 131−136.
Kovalsky, 0., Lung, F.D., Roller, P .P., and Fornace, A.J., Jr. (2001). Oligomerization of human Gadd45a protein. J. Biol. Chem. 276, 39 330−39 339.
Mai, M., Yokomizo, A., Qian, C., Yang, P., Tindall, D.J., Smith, D.I., and Liu, W. (1998). Activation of p73 silent allele in lung cancer. Cancer Res. 58, 2347−2349.
Maisse, C., Munarriz, E., Barcaroli, D., Melino, G., and De, L., V (2004). DNA damage induces the rapid and selective degradation of the DeltaNp73 isoform, allowing apoptosis to occur. Cell Death. Differ. 11, 685−687.
Maltzman, W. and Czyzyk, L. (1984). UV irradiation stimulates levels ofp53 cellular tumor antigen in nontransformed mouse cells. Mol. Cell Biol. 4, 1689−1694.
Mantovani, F., Piazza, S., Gostissa, M., Strano, S., Zacchi, P., Mantovani, R., Blandino, G., and Del Sal, G. (2004). Pinl links the activities ofc-Abl andp300 in regulating p73 function. Mol. Cell 14, 625−636.
Marabese, M., Vikhanskaya, F., and Broggini, M. (2007). p73: A chiaroscuro gene in cancer. Eur. J. Cancer. ?3(9):1361−72.
Marabese, M., Vikhanskaya, F., Rainelli, C., Sakai, T., and Broggini, M. (2003). DNA damage induces transcriptional activation of p73 by removing C-EBPalpha repression on E2F1. Nucleic Acids Res. 31,6624−6632.
Melino, G., Bernassola, F., Ranalli, M., Yee, K., Zong, W.X., Corazzari, M., Knight, R.A., Green, D.R., Thompson, C., and Vousden, K.H. (2004). p73 Induces apoptosis via PUMA transactivation and Bax mitochondrial translocation. J. Biol. Chem. 279,8076−8083.
Michalovitz, D., Halevy, 0., and Oren, M. (1990). Conditional inhibition of transformation and of cell proliferation by a temperature-sensitive mutant of p53. Cell.62,671−680.
Moll, U.M., Erster, S., and Zaika, A. (2001). p53, p63 and p73--solos, alliances and feuds among family members. Biochim. Biophys. Acta./5.52,47−59.
Moll, U.M., Wolff, S., Speidel, D., and Deppert, W. (2005). Transcription-independent pro-apoptotic functions ofp53. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 631−636.
MukhopadhyayJD., Tsiokas, L., and Sukhatme, V.P. (1995). Wild-type p53 and v-Src exert opposing influences on human vascular endothelial growth factor gene expression. Cancer Res. 55,6161−6165.
Murphy, M., Ahn, J., Walker, K.K., Hoffman, W.H., Evans, R.M., Levine, A.J., and George, D.L.1999). Transcriptional repression by wild-type p53 utilizes histone deacetylases, mediated by interaction with mSin3a. Genes Dev. 13,2490−2501.
Murphy, M.E. (2006). Polymorphic variants in the p53 pathway. Cell Death. Differ. 13, 916−920.
Ng, S.W., Yiu, G.K., Liu, Y., Huang, L.W., Palnati, M., Jun, S.H., Berkowitz, R.S., and Mok, S.C.2000). Analysis of p73 in human borderline and invasive ovarian tumor. Oncogene .19,18 851 890.
Nyman, U., Sobczak-Pluta, A., Vlachos, P., Perlmann, T., Zhivotovsky, B., and Joseph, B. (2005). Full-length p73alpha represses drug-induced apoptosis in small cell lung carcinoma cells. J. Biol. Chem. 280, 34 159−34 169.
O’connor, P.M., Jackman, J., Jondle, D., Bhatia, K., Magrath, L, and Kohn, K.W. (1993). Role of the p53 tumor suppressor gene in cell cycle arrest and radiosensitivity of Burkitt’s lymphoma cell lines. Cancer Res. 53,4776−4780.
Offer, H., Zurer, I., Banfalvi, G., RehaT^M., Falcovitz, A., Milyavsky, M., Goldfinger, N., and Rotter, V. (2001). p53 modulates base excision repair activity in a cell cycle-specific manner after genotoxic stress. Cancer Res. 61, 88−96.
Oren, M. (1985). The p53 cellular tumor antigen: gene structure, expression and protein properties. Biochim. Biophys. Acta .823, 67−78.
Osada, M., Park, H.L., Nagakawa, Y., Begum, S., Yamashita, K., Wu, G., Kim, M.S., Trink, B., and Sidransky, D. (2006). A novel response element confers p63- and p73-specific activation of the WNT4 promoter. Biochem. Biophys. Res. Commun. 339, 1120−1128.
Petty, R.D., Cree, I.A., Sutherland, L.A., Hunter, E.M., Lane, D.P., Preece, P.E., and Andreotti, P.E. (1994). Expression of the p53 tumour suppressor gene product is a determinant of chemosensitivity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 199,264−270.
Pozniak, C.D., Radinovic, S., Yang, A., McKeon, F., Kaplan, D.R., and Miller, F.D. (2000a). An anti-apoptotic role for the p53 family member, p73, during developmental neuron death. Science. 289,304−306.
Pozniak, C.D., Radinovic, S., Yang, A., McKeon, F., Kaplan, D.R., and Miller, F.D. (2000b). An anti-apoptotic role for the p53 family member, p73, during developmental neuron death. Science. 289,304−306.
Raycroft, L., Wu, H.Y., and Lozano, G. (1990). Transcriptional activation by wild-type but not transforming mutants of the p53 anti-oncogene. Science. 249,1049−1051.
Roemer, K. (1999). Mutant p53: gain-of-function oncoproteins and wild-type p53 inactivators Biol. Chem. 380, 879−887.
Sablina, A.A., Chumakov, P.M., and Kopnin, B.P. (2003). Tumor suppressor p53 and its homologue p73alpha affect cell migration. J. Biol. Chem. 278, 27 362−27 371.
Sanchez-Prieto, R., Rojas, J.M., Taya, Y., and Gutkind, J.S. (2000). A role for the p38 mitogen-acitvated protein kinase pathway in the transcriptional activation ofp53 on genotoxic stress by chemotherapeutic agents. Cancer Res. 60,2464−2472.
Sandri, M.I., Isaacs, R.J., Ongkeko, W.M., Harris, A.L., Hickson, I.D., Broggini, M., and Vikhanskaya, F. (1996). p53 regulates the minimal promoter of the human topoisomerase Ilalpha gene. Nucleic Acids Res. 24, 4464−4470.
Scian, M.J., Stagliano, K.E., Ellis, M.A., Hassan, S., BowmanJVl., Miles, M.F., Deb, S.P., and Deb, S. (2004). Modulation of gene expression by tumor-derived p53 mutants. Cancer Res. 64, 7447.7454.
Sherr, C.J. (1996). Cancer cell cycles. Science. 274,1672−1677.
Sigal, A. and Rotter, V. (2000). Oncogenic mutations of the p53 tumor suppressor: the demons of the guardian of the genome. Cancer Res. 60, 6788−6793.
Slade, N., Zaika, A.I., Erster, S., and Moll, U.M. (2004). DeltaNp73 stabilises TAp73 proteins but compromises their function due to inhibitory hetero-oligomer formation. Cell Death. Differ. 11, 357−360.
SIomiany, B.A., D’Arigo, K.L., Kelly, M.M., and Kurtz, D.T. (2000). C/EBPalpha inhibits cell growth via direct repression of E2F-DP-mediated transcription. Mol. Cell Biol. 20, 5986−5997.
Stewart, N., Hicks, G.G., Paraskevas, F., and Mowat, M. (1995). Evidence for a second cell cycle block at G2/M by p53. Oncogene. 10, 109−115.
Stiewe, T. and Putzer, B.M. (2000). Role of the p53-homologue p73 in E2Fl-induced apoptosis. Nat. Genet. 26,464−469.
Stiewe, T., Zimmermann, S., Frilling, A., Esche, H., and Putzer, B.M. (2002). Transactivation-deficient DeltaTA-p73 acts as an oncogene. Cancer Res. 62, 3598−3602.
Sun, X., Shimizu, H., and Yamamoto, K. (1995). Identification of a novel p53 promoter element involved in genotoxic stress-inducible p53 gene expression. Mol. Cell Biol. 15, 4489−4496.
Sunahara, M., Ichimiya, S., Nimura, Y., Takada, N., Sakiyama, S., Sato, Y., Todo, S., Adachi, W., Amano, J., and Nakagawara, A. (1998). Mutational analysis of the p73 gene localized at chromosome lp36.3 in colorectal carcinomas. Int. J. Oncol. 13,319−323.
Tanaka, H., Arakawa, H., Yamaguchi, T., Shiraishi, K., Fukuda, S., Matsui, K., Takei, Y., and Nakamura, Y. (2000). A ribonucleotide reductase gene involved in a p53-dependent cell-cycle checkpoint for DNA damage. Nature. 404, 42−49.
Tanaka, Y., Kameoka, M., Itaya, A., Ota, K., and Yoshihara, K. (2004). Regulation of HSF1-responsive gene expression by N-terminal truncated form of p73alpha. Biochem. Biophys. Res. Commun. 317, 865−872.
Taraboletti, G., Roberts, D., Liotta, L.A., and Giavazzi, R. (1990). Platelet thrombospondin modulates endothelial cell adhesion, motility, and growth: a potential angiogenesis regulatory factor. J. Cell Biol. Ill, 165−112.
Taylor, W.R., DePrimo, S.E., Agarwal, A., Agarwal, M.L., Schonthal, A.H., Katula, K.S., and Stark, G.R. (1999). Mechanisms of G2 arrest in response to overexpression of p53. Mol. Biol. Cell. 10, 3607−3622.
Toh, W.H., Siddique, M.M., Boominathan, L., Lin, K.W., and Sabapathy, K. (2004). c-Jun regulates the stability and activity of the p53 homologue, p73. J. Biol. Chem. 279,44 713−44 722.
Tomkova, K., El Rifai, W., Vilgelm, A., Kelly, M.C., Wang, T.C., and Zaika, A.I. (2006). The gastrin gene promoter is regulated by p73 isoforms in tumor cells. Oncogene. 25, 6032−6036.
Ueda, Y., Hijikata, M., Takagi, S., Chiba, T., and Shimotohno, K. (1999a). New p73 variants with altered C-terminal structures have varied transcriptional activities. Oncogene .18,4993−4998.
Ueda, Y., Hijikata, M., Takagi, S., Chiba, T., and Shimotohno, K. (1999b). New p73 variants with altered C-terminal structures have varied transcriptional activities. Oncogene. 18, 4993−4998.
Ventura, A., Kirsch, D.G., McLaughlin, M.E., Tuveson, D.A., Grimm, J., Lintault, L., Newman, J., Reczek, E.E., Weissleder, R., and Jacks, T. (2007). Restoration of p53 function leads to tumour regression in vivo. Nature .445, 661−665.
Vikhanskaya, F. and Broggini, M. (2002). Genetic alterations in ovarian cancer cells that might account for sensitivity to chemotherapy in patients. Int. Rev. Cytol. 219,157−198.
Vikhanskaya, F., Colella, G., Valenti, M., Parodi, S., D’Incalci, M., and Broggini, M. (1999). Cooperation between p53 and hMLHl in a human colocarcinoma cell line in response to DNA damage.Clin. Cancer Res. 5, 937−941.
Vikhanskaya, F., D’Incalci, M., and Broggini, M. (1995). Decreased cytotoxic effects of doxorubicin in a human ovarian cancer-cell line expressing wild-type p53 and WAF1/CIP1 genes.Int. J. Cancer .61,397−401.
Vikhanskaya, F., D’Incalci, M., and Broggini, M. (2000). p73 competes with p53 and attenuates its response in a human ovarian cancer cell line. Nucleic Acids Res. 28,513−519.
Vikhanskaya, F., Erba, E., D’Incalci, M., and Broggini, M. (1996). Changes in cyclins and cyclin-dependent kinases induced by DNA damaging agents in a human ovarian cancer cell line expressing mutated or wild-type P53. Exp. Cell Res. 227, 380−385.
Vikhanskaya, F., Lee, M.K., Mazzoletti, M., Broggini, M., and Sabapathy, K. (2007a). Cancer-derived p53 mutants suppress p53-target gene expression—potential mechanism for gain of function of mutant p53. Nucleic Acids Res. 35,2093−2104.
Vikhanskaya, F., Marchini, S., Marabese, M., Galliera, E., and Broggini, M. (2001b). P73a overexpression is associated with resistance to treatment with DNA-damaging agents in a human ovarian cancer cell line. Cancer Res. 61,935−938.
Vikhanskaya, F., Siddique, M.M., Kei, L.M., Broggini, M., and Sabapathy, K. (2005). Evaluation of the combined effect of p53 codon 72 polymorphism and hotspot mutations in response to anticancer drugs. Clin. Cancer Res. 11,4348−4356.
Vikhanskaya, F., Toh, W.H., Dulloo, I., Wu, Q., Boominathan, L., Ng, H.H., Vousden, K.H., and Sabapathy, K. (2007b). p73 supports cellular growth through c-Jun-dependent AP-1 transactivation. Nat. Cell Biol. 5,698−706.
Vikhanskaya, F.L., Khrebtukova, I.A., and Manuilova, E.S. (1985). Semi-conservative synthesis of DNA in UV-sensitive mutant cells of Chinese hamster after UV-irradiation Mutat. Res. 149, 271−273.
Viktorsson, K., De Petris, L., and Lewensohn, R. (2005). The role ofp53 in treatment responses of lung cancer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 868−880.
Vossio, S., Palescandolo, E., Pediconi, N., Moretti, F., Balsano, C., Levrero, M., and CostanzoA (2002a). DN-p73 is activated after DNA damage in a p53-dependent manner to regulate p53-induced cell cycle arrest. Oncogene. 21, 3796−3803.
Vossio, S., Palescandolo, E., Pediconi, N., Moretti, F., Balsano, C., Levrero, M., and Costanzo, A. (2002b). DN-p73 is activated after DNA damage in a p53-dependent manner to regulate p53-induced cell cycle arrest. Oncogene .21, 3796−3803.
Vousden, K.H. (2006). Outcomes of p53 activation-spoilt for choice. J. Cell Sci. 119,50 155 020.
Vousden, K.H. and Lu, X. (2002). Live or let die: the cell’s response to p53. Nat. Rev. Cancer. 2, 594−604.
Wahl, A.F., Donaldson, K.L., Fairchild, C., Lee, F.Y., Foster, S.A., Demers, G.W., and Galloway, D.A. (1996). Loss of normal p53 function confers sensitization to Taxol by increasing G2/M arrest and apoptosis. Nat. Med. 2,72−79.
Wakasugi, T., lzumi, H., Uchiumi, T., Suzuki, H., Arao, T., Nishio, K., and Kohno, K. (2007). ZNF143 interacts with p73 and is involved in cisplatin resistance through the transcriptional regulation of DNA repair genes Oncogene.26,5194−203.
Waldman, T., Kinzler, K.W., and Vogelstein, B. (1995). p21 is necessary for the p53-mediated G1 arrest in human cancer cells. Cancer Res. 55, 5187−5190.
Wang, Q., Zambetti, G.P., and Suttle, D.P. (1997). Inhibition of DNA topoisomerase II alpha gene expression by thep53 tumor suppressor. Mol. Cell Biol. 17, 389−397.
Wang, X.W., Zhan, Q., Coursen, J.D., Khan, M.A., Kontny, H.U., Yu, L., Hollander, M.C., O’connor, P.M., Fornace, A.J., Jr., and Harris, C.C. (1999). GADD45 induction of a G2/M cell cycle checkpoint. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A .96,3706−3711.
Xue, W., Zender, L., Miething, C., Dickins, R.A., Hernando, E., Krizhanovsky, V., Cordon-Cardo, C., and Lowe, S.W. (2007). Senescence and tumour clearance is triggered by p53 restoration in murine liver carcinomas. Nature .445,656−660.
Yaginuma, Y. and Westphal, H. (1992). Abnormal structure and expression of the p53 gene in human ovarian carcinoma cell linesCancer Res. 52,4196−4199.
Yuan, Z.M., Shioya, H., Ishiko, T., Sun, X., Gu, J., Huang, Y.Y., Lu, H., Kharbanda, S., Weichselbaum, R., and Kufe, D. (1999). p73 is regulated by tyrosine kinase c-Abl in the apoptotic response to DNA damage. Nature. 399, 814−817.
Zacchi, P., Gostissa, M., Uchida, T., Salvagno, C., Avolio, F., Volinia, S., Ronai, Z., Blandino, G., Schneider, C., and Del Sal, G. (2002). The prolyl isomerase Pinl reveals a mechanism to control p53 functions after genotoxic insults. Nature .419,853−857.
Zhou, J., Ahn, J., Wilson, S.H., and Prives, C. (2001). A role for p53 in base excision repair. EMBO J. 20, 914−923.
Zurer,!., Hofseth, L J., Cohen, Y., Xu-Welliver, M., Hussain, S.P., Harris, C.C., and Rotter, V. (2004). The role of p53 in base excision repair following genotoxic stress. Carcinogenesis. 25, 11−19.1. ЛИСТ СОКРАЩЕНИЙ
ГЩР полимеразная цепная реакция
ОТ-ПЦР обратной транскрипции- полимеразная цепная реакция1. АТР аденозин 5 'трифосфат
Aip4/Itch протеин из семейства ЕЗ лигаз
ASPP белки, стимулирующие апоптоз
BER эксцизионная репарация основанийп.о. пары основанийт.п.о. тысяча пар оснований
CAT хлорамфениколацетилтрансфераза
С/ЕВРа ССААТ/энхансер связывающий белок1. DMSO диметилсульфоксид
DNp73 доминантно-негативная форма р731. DTT дитиотритол
HAT гистон-ацетилтрансферазыhTERT человеческая теломер-обратная транскриптаза
EDTA этилендиаминотетраацетиловая кислота1. KJD тысяча килодальтон
NEDD8 убиквитин (иЬ)-зависимый посттрансляционныймодификатор1. OD оптическая плотность
PAGE электрофорез в полиакриламидном геле
PBS солевой изотонический раствор фосфатного буфера
PMSF фенилметилсульфонилфлуорид
PTEN фосфатаза и гомолог тензина
SDS додецил сульфат натрия
TGFp фактор роста опухолей
TSP-1 тромбоспондин-1- антиангиогенный фактор TEMED N ', N, N ', N 'тетраметилэтилендиамин
UbcH5B/С Убиквитин-коньюгированный энзим UbcH5B/C VEGF васкулоендотелиальный ростовый фактор YB1 транскрипционный фактор член Y- бокс семейства.
Y-бокс элемент (CYE), включает Y-бокс и прилежащую 3 'инвертированную последовательность Wt дикий тип

Заполнить форму текущей работой