Образование комплекса при взаимодействии церулоплазмина и лактоферрина

В течение ряда лет в отделе молекулярной генетики изучают нарушения метаболизма металлопротеинов.

Лактоферрин (ЛФ) — или трансферрин молока, один из белков острой фазы воспаления, поступающий в русло крови из вторичных гранул нейтрофилов, обладает антибактериальными свойствами. В частности, молекула ЛФ обладает способностью связывать в специфических сайтах два иона железа, таким образом секвестрируя в очаге воспаления микроэлемент, необходимый для жизни микробов. Этот белок широко представлен в клеточно-тканевых образованиях организма млекопитающих: он выявлен в большинстве барьерных эпителиев пищеварительного, респираторного и мочеполового трактов и их секретах, а также в экзокринных железах и их секретах. Исследования ЛФ, выделенного из грудного молока, были начаты более 50 лет назад, однако его новые функции обнаруживают до сих пор. Об интенсивности проводимых исследований можно судить по материалам международных конференций (Lactoferrin: Structure, Functions and Applications), которые проводят каждые два года. Некоторые недавно обнаруженные функции обусловлены способностью ЛФ взаимодействовать с другими молекулами (гепарином, белками бактериальных клеточных стенок, секреторными белками, ДНК). Такие взаимодействия могут иметь отношение к физиологической роли ЛФ, которая до сих пор однозначно не определена.

Церулоплазмин (ЦП), медьсодержащий белок плазмы крови, проявляя ферроксидазную активность, принимает участие в метаболизме железа, что обеспечивает встраивание Fe в апо-трансферрины. Другие функции ЦП связаны с транспортом меди и окислительными процессами, в которых он выступает как антиоксидант. Работами последних лет показано, что ЦП может приобретать некоторые функции, взаимодействуя с рядом других белков. Так, например, конкурируя с факторами свертывания крови (ФСК) FV и FVIII за связывание с протеином С, ЦП может участвовать в регуляции коагуляции. Взаимодействие ЦП с миелопероксидазой может быть важным для регуляции ее опасных прооксидантных свойств. Взаимодействие ЦП с ферритином наряду с его ферроксидазной активностью необходимо для полноценного встраивания.

Fe3+ в ферритин. Таким образом, изучая взаимодействие ЦП с другими белками, можно получить представление о его новых функциональных свойствах.

Исходя из вышесказанного, представляется актуальным исследование особенностей взаимодействия ЛФ и ЦП и возможности образования комплекса ЦП/ЛФ. Такой комплекс мог бы служить примером белок-белкового взаимодействия (ББВ) двух многофункциональных металлопротеинов. Изучение ассоциации-диссоциации ЦП и ЛФ, а также структурных особенностей комплекса позволит выявить условия его формирования и возможную роль in vivo. Совместное присутствие этих белков в пограничных к инфекции тканях говорит о том, что их комплекс может играть роль в формировании неспецифической резистентности организма. Поскольку в организме ЛФ по большей части не содержит ионы металлов (аполактоферрин, апоЛФ), можно предполагать встраивание в него ионов железа, окисленных ЦП. Известно, что ЛФ оказывает антимикробное действие, которое синергично возрастает при совместном действии с другими антибактериальными белками (лизоцимом или миелопероксидазой). Хотя об антибактериальном действии ЦП известно мало, нельзя исключить, что в комплексе с ЛФ этот эффект усиливается. ЦП человека легко подвергается ограниченному протеолизу, в том числе и в русле крови. Не исключено, что в таком случае апо-ЛФ мог бы секвестрировать ионы меди, высвобождающиеся из ЦП, не допуская развития катализируемых ими цепных окислительных реакций.

В ходе исследований, результаты которых представлены в этой работе, предполагалось детально изучить условия, способствующие и препятствующие образованию комплекса ЦП/ЛФ in vitro, определить константу диссоциации комплекса, уточнить стехиометрическое соотношение ЦП и ЛФ в составе комплекса. Изучение ограниченного протеолиза ЦП в составе его комплекса с ЛФ под действием протеаз и неспецифической деградации под действием перекиси водорода, должно прояснить возможность переноса ионов меди с частично протеолизованного ЦП на апоЛФ, исследовать особенности взаимодействия деградированного и интактного ЦП с ЛФ in vitro. В опытах с лабораторными животными планировалось изучить формирование комплекса ЦП/ЛФ in vivo. Было запланировано проведение экспериментов, позволяющих оценить, влияет ли ЛФ на ферментативную активность ЦП. Также планировалось при помощи биофизических методов оценить конформацию комплекса в целом и его отдельных компонент. Возможно, это позволит построить пространственную модель комплекса ЦП/ЛФ.

Актуальность предложенной работы обусловлена важностью изучения взаимодействия между ЦП и ЛФ как частного случая ББВ — механизма, ответственного за функционирование многочисленных биохимических процессов. Железосодержащий ЛФ и медьсодержащий ЦП являются ключевыми звеньями метаболизма двух важных для организма микроэлементов. Изучение их взаимодействия, приводящего к формированию комплекса ЦП/ЛФ, позволит пролить свет на неизвестные стороны регуляции обмена металлов в норме и при ряде патологических состояний.

Новизна работы состоит в том, что в ней впервые показано прямое взаимодействие ЦП и ЛФ, определены основные характеристики этого взаимодействия и свойства специфического комплекса ЦП/ЛФ, что позволяет высказать гипотезу о его физиологической роли.

Основной целью представленной работы явилось: Выяснение условий, приводящих к образованию комплекса ЦП/ЛФ, и определение некоторых его физико-химических характеристик.

Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:

1) Показать возможность образования комплекса ЦП/ЛФ in vitro и in vivo.

2) Определить стехиометрическое соотношение молекул белков в составе комплекса.

3) Изучить условия диссоциации комплекса ЦП/ЛФ и определить константу диссоциации при физиологических значениях рН и концентрации NaCl.

4) Оценить избирательность взаимодействия ЛФ и ЦП.

5) Изучить условия, при которых происходит переход ионов меди из ЦП в ЛФ.

6) Исследовать возможность влияния ЛФ на ферментативную (ферроксидазную) активность ЦП.

В соответствии с поставленными задачами проводились экспериментальные исследования, результаты которых представлены далее.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Aisen P., and Harris DC. (1989) Physical biochemistry of the transferrins. 1.:1.on carriers and iron proteins. Vol. 5 (Ed. by Loehr T) VCH Publishers, New York. 241−351.

2. Archakov A.I., Ivanov Yu.D. (1999) The optical biosensor study of the protein-protein interactions with cytochrome P450s. In Biophysics of electron transfer and molecular Bioelectronics, Pleum Publication Corporation: USA. 173−194.

3. Argos P. (1988) An investigation of protein subunit and domain interfaces. Protein Eng. 2, 101−113.

4. Baker E.N. (1994) Structure and reactivity of transferrins. Adv. Inorg. Chem. 41,389−463.

5. Baker E.N., Anderson B.F., Baker H.M., Day C.L., Haridas M., Norris G.E., Rumball S.V., Smith C.A., Thomas D.H. (1994) In: Lactoferrin. Structure and function (Ed. by Hutchens T. W, Rumball S.V., Lonnerdal В., Plenum Press, NY & Lond.).

6. Baker E.N., Baker H.M., and Kidd R.D. (2002) Lactoferrin and transferring: Functional variations on a common structural framework. Biochem. Cell Biol. 80, 27−34.

7. Baker E.N., Rumball S.V., and Anderson B.F. (1987) Transferrins: insights into structure and functions from studies on lactoferrin. TIBS 12, 350−353.

8. Bakker G. R., and Boyer R.F. (198в) J. Biol. Chem. 261, 13 182−13 185.

9. Bannister J.V., Bannister W.H., Hill H.A.O., Mahood J.F., Willson R.L., and Wolfenden B.S. (1980) Does ceruloplasmin dismute superoxide? No. FEBS Lett. 118,127−129.

10. Barchas I.D., and Freedman D.X. (1963) Brains amines: response to phisiological stress. Biochem.Pharmacol. 12, 1232−1235.

11. Barlow D.J., Tornton J.M. (1986) The distribution of charged groups in proteins. Biopolymers. 25, 1717−1733.

12. Bellamy W., Takase M., Yamauchi K., Wakabiashi H., Kawase K., and TomitaM. (1992) Identification of the bacterial domain of lactoferrin. Biochim.Biophys.Acta 1121, 130−136.

13. Beltramini M., Salvato В., Santamaria M., and Lerch K. (1990) The reaction of CN' with binuclear copper site of Neurospora tyrosinase: its relevance for a14.