Новые подходы к диагностике и элиминации Helicobacter pylori при язвенной патологии желудочно-кишечного тракта

Актуальность: Заболевания, опосредованные инфицированием организма человека Helicobacter pylori, составляют важную медико-социальную проблему современной медицины (Григорьев, 1996). Н. pylori является широко распространённой бактерией, и по разным данным, инфицированность населения варьирует в пределах 60−90% (Cave, 1997). В развивающихся странах частота инфицирования Н. pylori составляет от 8090%- в США от 35−40% (Lacy et al., 2001) и в РФ от 71−90% (Reshetnikov et al., 2001). H. pylori выявляют у 80−100% больных хроническим гастритом, у 70−80% страдающих язвой желудка, у 90−100% — язвой двенадцатиперстной кишки, а также у 100% пациентов с MALT-лимфомами (Alkan et al., 1996; Sipponen, 1992; Sipponen et al., 1999), у 80−95% с аденокарциномами желудка (Lord et al., 2000) и у 60% больных с диспепсиями неязвенной этиологии (Moran et al., 1996). Кроме того, ряд авторов предполагает наличие взаимосвязи между инфицированием H. pylori и развитием ишемической болезни сердца (Mendall et al., 1994; Sandifer et al., 1996; Roussos et al., 2003).

Известно, что инфицированность H. pylori в четыре раза повышает риск развития язвенной патологии желудочно-кишечного тракта (Forman, 1991, 1996). При этом колонизация бактериями слизистой желудка не всегда вызывает развернутую картину хронического гастрита. Чаще можно наблюдать латентный процесс либо бессимптомное носительство (Haas et al., 1994). Только у 15- 20% лиц инфицированы Н. pylori развивается язвенной патологии желудка и двенадцатиперстной кишки (Anand et al., 1996; Figura, 1996; Blaser, 1998; Lacy et al., 2001).

Следует отметить, что, несмотря на определенные успехи, до настоящего времени эффективность рекомендованных схем лечения хеликобактериозов варьирует в пределах 65−87%, но в большинстве случаев она зависит от чувствительности бактерий к применяемым антибактериальным препаратам (Brzozowski et al., 2003; Graham et al., 1996). Длительный прием препаратов, входящих в схему лечения, часто проводит к развитию резистентности и формированию устойчивых штаммов. В Европе резистентность Н. pylori к метронидазолу в среднем составляет 27% и к кларитромицину 10% (Glupczynski et ah, 2001). В частности, в странах восточной Европы, резистентность к метронидазолу и к кларитромицину составляет 40,3% и 10,6% (Boyanova et al., 2002) — в Великобритании 59% и 11% (Nicola et al., 2005) — и в Голландии 14% и 1% (Janssen et al., 2006). В США резистентность к метронидазолу и кларитромицину составляет 25,1% и 12,9% (Duck et al., 2004) и в странах латинской Америки отмечают до 80% случаев резистентности к метронидазолу (Magalhaes et al., 2002). В странах Азии резистентность хеликобактеров к метронидазолу увеличилось с 22% в 1991 году до 73% в 1995 году (Ling et al., 1996). Отмечено и стремительный рост резистентности Н. pylori к тетрациклину (Ribiero et al., 2004) и по данным Jeng Yih Wu, (2005г) резистентность Н. pylori к тетрациклину достигает 59% в Китае.

В РФ резистентность бактерий к метронидазолу у больных, ранее получавших антихеликобактерную терапию по поводу язвенной болезни, может достигать 100% (Кудрявцева, 1999). Резистентные штаммы Н. pylori значительно труднее поддаются элиминации, что существенно снижает (до 50%) эффективность проводимого лечения и делает его экономически невыгодными (Иваницкий, 1998; Мерабишвили, 2001; Иваников, 2002). С повышением резистентности бактерий связывают рост, осложнений гастродуоденальной патологии, и, следовательно, значительное увеличение затрат на лечение, что является не только медицинской, но и социально-экономической проблемой.

Минерализованные воды и озон нашли применение при лечении гастродуоденальной патологии. JI. В. Игнатко и В. В. Швардака (2001), отмечали, что сульфидная слабоминерализованная вода в дозе 5мл/кг массы тела в комплексной терапии приводит к эрадикации Н. pylori у детей. Еще в 1994 г, Hawrylik и соавторы сообщили об ингибирующем действием бисульфитных и сульфитных катионов на рост H. pylori in vitro. По данным б.

В.А. Максимова и соавторы (1994), озон воздействует на различные звенья патогенеза язвенной болезнии внутривенное введение озонированного физиологического раствора на фоне противоязвенной терапии ведет к эрадикацией Н. pylori в 40−60% случаев (Каратаев, 2001).

Вышеуказанное делает перспективным поиск и внедрение в практику новых доступных подходов к элиминации Н. pylori, направленных на улучшение результатов лечения язвенной гастродуоденальной патологии.

Золотым стандартом" бактериологической диагностики хеликобактериозов является выделение возбудителя из биоптатов слизистой (Баженов и соавт., 1990; Аруин, 1993). Важный момент бак. анализа — выявление уреазы, косвенно свидетельствующей о наличии H.pylori. К настоящему времени предложены различные методики. Тем не менее, можно столкнуться с ложноположительными результатами, связанной с ростом в посевах сопутствующей флоры. Этот факт представляет существенно значимой проблему разработки новых селективных сред и более устойчивых уреазных тестов.

Цель: разработать новые подходы к идентификации и элиминации Н. pylori у пациентов с язвенными поражениями желудка и двенадцатиперстной кишки.

Задачи исследования: В соответствии с целью перед исследованием были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние озонированной и сульфидной минерализованной воды на культуральные и биохимические свойства Н. pylori in vitro.

2. Разработать новую питательную среду и модифицировать уреазный тест для ускоренного выделения Н. pylori.

3. Определить частоту обнаружения Н. pylori у пациентов с раком желудка, гастродуоденитами и соответствующими язвенными поражениями в зависимости от пола и возраста больных и установить корреляцию между нею и заболеваемостью гастродуоденального отдела желудочно-кишечного тракта.

4. Определить вирулентные свойства и чувствительность к антибактериальным препаратам штаммов Н. pylori, выделенных от больных язвенной патологии желудка и двенадцатиперстной кишки.

5. Определить частоту повторного обнаружения Н. pylori у прооперированных больных, получавших курсы премедикации и послеоперационной антибактериальной терапии и оценить их эффективность.

6. Изучить возможность длительного сохранения культур Н. pylori. Научная новизна.

Впервые установлено, что озонированная вода концентрация озона 5мкг/мл снижает жизнеспособность Н. pylori in vitro, в том числе за счет ограничения их подвижности, снижения уреазной активности и подавления роста на плотных средах. Сульфидная минерализованная вода из источника санатория «Чувашия» в различных концентрациях проявляет аналогичные свойства в отношении культур Н. pylori in vitro.

Выявлена корреляция между степенью вирулентности изолятов Н. pylori и тяжестью последовательных патологий слизистой желудка.

Впервые разработан и использован на практике эритрит-сывороточный агар с мочевиной (ЭСАМ) для ускоренной идентификации Н. pylori из клинического материала.

Впервые разработан модифицированный уреазный тест, включающий применение 1% раствора Люголя и фурацилина, для определения уреазной активности Н. pylori в биоптатах.

Предложена методика длительного сохранения выделенных штаммов Н. pylori в консервирующей смеси при -10 °С.

Практическая значимость.

Новые методы выделения и идентификации II. pylori, предложенные в работе, значительно облегчают культивирование и идентификацию бактерий, выделенных из клинического материала. Разработанная модификация уреазного теста отличается простотой проведения, доступностью и воспроизводимостью полученных результатов.

Положения, выносимые на защиту.

1. Озонированная вода в концентрации 5мкг/мл и сульфидная минерализованная вода из источника санатория «Чувашия» в различных концентрациях снижают жизнеспособность Н. pylori in vitro, проявляющуюся ограничением их подвижности, угнетением синтеза уреазы и подавлением роста на плотных средах.

2. Степень тяжести последовательных патологий желудочно-кишечного тракта зависит от степени вирулентности Н. pylori.

3. Возможно длительное хранение изолятов Н. pylori при — 10 °C в консервирующей смеси (сахарозо-желатиновой среде в буферном растворе) на срок до 12 месяцев.

4. Для ускоренной идентификации Н. pylori из клинического материала можно использовать эритрит-сывороточный агар с мочевиной (ЭСАМ) и модифицированный уреазный тест, включающий применение 1% раствора Люголя и фурацилина.

Апробация материалов работы.

Основные положения диссертации доложены на 11-ой научно-практической конференции Поволжского региона «Окружающая среда и здоровье населения» (Казань 2004) — на 13-ой научно-практической конференции Поволжского региона «Окружающая среда и здоровье населения» (Казань 2005) — на международном симпозиуме «Научные основы обеспечения зашиты животных от экзотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» (Казань 2005), на научно-практическом семинаре «Современные возможности выявления Н. pylori и кампилобактерий в лабораторной практике» (Казань 2005).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

История открытия Helicobacter pylori тесно связаны с историей изучения этиологии и патогенеза гастродуоденальной патологии, в первую очередь, язвенных гастрита и дуоденита. Не смотря на то, что по данным молекулярно-генетических исследований, «возраст» Н. pylori не превышает 2500−1 ЮООлет (Achtman, 2001; Falush et al, 2001), в прошлом тысячелетии, постулат Карла Шварца «нет кислоты — нет язвы» был самым достоверным объяснением патогенеза язвенной болезни желудка (Hellstrom, 2006). Впервые идея об инфекционном начале язвенной болезни возникла только в конце XIX века, и неким подтверждением права на ее существование явились находки спиралевидных бактерий в желудке животных и человекавпервые их обнаружили в желудке собак. До 1975 года, появлялись и другие сообщения о находках спиралевидных бактерий в желудке, однако тогда этим сообщениям особого внимания не уделяли (Аруин, 1990).

В 1983 году Б. Маршал и Р. Уоррен выделили из биоптата слизистой желудка больного с антральным гастритом грамотрицательные спиралевидные бактерии (Marshall, Warren, 1984). Р. Уоррен предложил включить их в состав рода Campylobacter под названием С. pyloris (Warren, 1984). Однако детальное изучение бактерий выявило у них существенные морфологические особенности, иной набор жирных кислот клеточной стенке, а так же по отсутствие выраженной гомологии ДНК с прочими кампилобактерами (Marshall, Royce, 1984). В 1989 году для них был организован новый род Helicobacter с одним видом —Н. pylori (Goodwin et al., 1989), название, данное бактериям, отражает их морфологические и экобиологические особенности: in vivo они спиралевидные (helical), in vitro — палочковидные (bacter) — кроме того бактерии предпочитают колонизировать пилорический отдел желудка. В настоящее время род Helicobacter насчитывает примерно 30 видов выделяемых от людей и животных. У человека обычно выделяют Н. pylori, реже — Н. mustelae, Н. felis, Н. muridarum, Н. fenneliae, Н. canis, Н. piilloram, Н. bizzozeronnii, Н. heilmanii, Н. rappini и H. cinnaedi (Fox, 2002).

выводы.

1. Частота выделения Н. pylori у обследованных пациентов (304 человека) с заболеваниями гастродуоденального тракта составила 39% у лиц в возрасте 24 года, 56% у пациентов в возрасте 25−44 года, 68% в возрастной группе 45−64 года и 79% у лиц в вострасте 65 лет и выше.

2. Обнаружение бактерий прямо зависит от тяжести заболевания: чаще их выделяли от больных раком желудка (80% случаев), язвенной болезнью желудка (81%), язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки (82%) и гастритом (61%). Зависимости частоты обнаружения Н. pylori от пола пациента не установлено.

3. Установлена корреляция между тяжестью патологии желудочно-кишечного тракта и вирулентными свойствами изолятов бактерий, а также уровнем обсемененности. При раках желудка 100% изолятов были вирулентными, при язвах желудка и двенадцатиперстной кишки — 88% штаммов. У этих пациентов уровни высокой обсемененности (104−105 КОЕ/биоптат) выявляли у 61% пациентов с онкологическими заболеваниями желудка, у 47% больных, страдающих язвами желудка и у 43% с язвами двенадцатиперстной кишки.

4. Выделенные изоляты были чувствительны к кларитромицину, амоксицилину и ципрофлоксацину (85%), тетрациклину (60%) и эритромицину (65%), фурацидолу (40%) и метронидазолу (32%). Все штаммы были абсолютно устойчивы к цефазолину, цефалотину и цефалексину.

5. Проведение антибактериальной терапии значительно снижает уровень.

2 3 обсемененности (до 10−10 КОЕ биоптат), приводит к нарушению морфологических и культурально-биохимических свойств, снижает скорость роста и вирулентность при рекультивировании.

6. Показана перспективность применения минеральной сульфидной (концентрация H2S 25мг/мл) и озонированной (5 мкг озона/мл) воды в качестве альтернативного метода элиминации H. pylori либо включения в качестве дополнительного компонента в этиотропную терапию хеликобактериозов.

7. Разработан новый метод упрощенной идентификации Н. pylori, включающий применение эритрит-сывороточного агара с мочевиноймодифицированного уреазного теста с 1% раствором Люголя и фурацилина.

8. Предложен метод длительного сохранения изолятов бактерий (до 12 месяцев) при температуре -10 °С в модифицированной консервирующей смеси на основе сахарозо-желатиновой среды в буферно-физиологическом растворе.