Метилирование ДНК и ДНК-метилазы лимфоцитов крови больных хроническим лимфолейкозом коров

Актуальность темы

Лейкозы являются актуальной и сложной про-пемой современной биологии, медицины и ветиринарии. Однако моле-улярные основы этой болезни до сих пор не совсем ясны. Считают, го причина злокачественной трансформации может быть связана с на-^шением нормального функционирования генома (Marx, 1984; Santos b al., 1984).

В функционировании эукариотической клетки важную роль игра-г метилирование ДНК. Показано, что эта модификация генома может эинимать участие в регуляции транскрипции, клеточной дифференци-эвке и структурировании хроматина (Ванюшин, 1983; Cooper, 1983). литературе, посвященной изучению метилирования ДНК у животных, 1BHO высказывалось предположение, что одна из причин опухолевой эансформации клеток связана с изменением характера метилирования знома. И действительно, большинство изученных опухолей животных человека характеризуется аберрантным метилированием ДНК, а ис-гедование этой модификации стало новым, важным для медицины и зльского хозяйства направлением современной биологии. Недавно знаружена обратная корреляция между метилированием и экспрессивирусной ДНК в геноме трансформированных клеток (Cooper, 1983).

Избирательное метилирование определенных цитозиновых остат-)В в геноме осуществляется специфическими ферментами — ДНК-мети-1зами. Свойства этих ферментов в животных клетках до сих пор еще 1ло изучены, неясен вопрос о природе и множественности метилаз в) рмальных и опухолевых клетках. Вместе с тем, согласно гипотезе) река и Сринивасана (Borek, Srinivasan, 1966), именно ДНК-мети-1зы могут играть существенную роль в злокачественной трансформа-до клеток млекопитающих, вызванной онкогенными вирусами. Поэтому)авнительное исследование характера метилирования ДНК и свойств.

1К-метилаз в норме и при хроническом лимфолейкозе имеет принци-?альное значение как для выяснения молекулярных основ леикознои) ансформации, так и для понимания биологической значимости самой шиматической модификации ДНК у эукариот. Особую актуальность этоТ исследованию придает и то обстоятельство, что недавно доказана фусная природа лейкоза у крупного рогатого скота (Вигпу е* а1., 380).

Цель и задачи исследования

3^ Целью настоящей работы было ис-тедование характера метилирования палиндромных последовательнос-зй ДНК, а также изучение свойств ДНК-метилаз из лимфоцитов крови цоровых и больных хроническим лимфолейкозом коров. Для этого бы-д поставлены следующие задачи:

1. Выделить из ДНК лимфоцитов крови здоровых и больных хрони-зским лимфолейкозом коров палиндромные последовательности и опзделить в них содержание 5-метилцитозина.

2. Очистить ДНК-метилазы из лимфоцитов крови здоровых и боль-лх хроническим лимфолейкозом коров и изучить их физико-химические войства и специфичность действия.

Научная новизна полученных результатов. Впервые обнаружена втономность метилирования палиндромных структур ДНК при хрони-зском лимфолейкозе крупного рогатого скота: в то время как уро-знь метилирования обычных повторяющихся последовательностей па-ает, метилирование палиндромов, наоборот, значительно возрастает, бнаружена реакция неэнзиматического метилирования ДНК под дейст-ием Б-аденозилметионина. Впервые из лимфоцитов крови здоровых и ольных хроническим лимфолейкозом коров выделены препараты высоко-чищенных ДНК-метилаз и изучены их физико-химические свойства и пецифичность действия. Установлено, что в лимфоцитах крови боль.

В постановке задач исследования принимала участие к.б.н.Н. Н. Бурцева. шх хроническим лимфолейкозом коров присутствует дополнительная Щ-метилаза, отличающаяся по хроматографическим свойствам, оптимуму рН и сайт-специфичности от ДНК-метилазы нормальных лимфоцитов. Сем самым показано, что при хроническом лимфолейкозе коров происходит не только специфическое изменение уровня метилирования генома, зо и появление нового, дополнительного ДНК-метилирующего фермента.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты имеют существенное теоретическое значение, поскольку открывают принципиально новый перспективный подход к расшифровке молекулярных механизмов нарушения клеточной функции при лейкозах в эезультате искажения метилирования генома. Результаты данной работы важны также для понимания биологической роли энзиматической модификации ДНК у эукариот. Использованный в работе усовершенствованный автором метод определения ДНК-метилазной активности, а так-ке методы выделения и очистки ДНК-метилаз из нормальных и лейкоз-шх лимфоцитов могут быть применены для выделения ДНК-метилаз из разнообразных животных тканей. Методы и результаты работы используются в Межфакультетской проблемной НИЛ им. А. Н. Белозерского, МГУ.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались т Ш Всесоюзной межуниверситетской конференции «Физико-химическая 5иология» (Тбилиси, 1982), на У Всесоюзном симпозиуме «Молекуляр-ще механизмы генетических процессов?'(Москва, 1983), на УШ Все-зоюзном симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Пущино, [984), на совместном заседании отдела молекулярных основ онтогенеза Межфакультетской ПНИЛ им. А. Н. Белозерского и кафедры молекуляр-юй биологии Биологического факультета МГУ (Москва, 1984) и на за-зедании проблемной комиссии «Нормальное кроветворение» ЦНИИ ГПК ШН СССР (Москва, 1984).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано б печат-шх работ.

ГЛАВА 1У ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Основным результатом нашей работы является установление факта изменения специфичности метилирования генома и ДНК-метилирую-щих ферментов при хроническом лимфолейкозе коров.

Наиболее выраженные изменения в метилировании генома касаются палиндромов. Полученные нами результаты об увеличении уровня метилирования палиндромов и прилегающих к ним последовательностей по сравнению с остальной ДНК, как в норме (в 1,4 раза), так и особенно при хроническом лимфолейкозе (в 2,2−3,5 раза), хорошо согласуются с данными о высокой степени метилирования палиндромов в ДНК Р815 мастоцитами мыши (ВоеЬш, КгаЬоуэку, 1981), а также подтверждаются появившимися совсем недавно данными о том, что в ДНК трансформированных вирусом ЗУ40 мышиных фибробластов (клетки ЗТЗ) и трансформированных вирусом саркомы Рауса клетках почек крысы палиндромы метилируются более чем в 2 раза сильнее по сравнению с палиндромами из ДНК соответствующих нормальных клеток (Уо1ре, Егетепко, 1984). Между тем, существуют сведения о том, что палиндромы могут быть сайтами узнавания для специфических ре-гуляторных белков (Лим, Мазанов, 1976; Вое1ш, БгаЬоузку, 1981), а также принимать участие в регуляции транскрипции (воеЬт, Бга-Ьоузку, 1981), репликации ДНК (Борхсениус и др., 1981) и структурировании хромосомы (Лим, Мазанов, 1976). Высокий уровень метилирования палиндромов и примыкающих к ним последовательностей ДНК может быть также важным фактором при регуляции специфических белок-нуклеиновых взаимодействий. Во всяком случае, метилирование ЦНК, особенно ее регуляторных зон, существенно сказывается на характере транскрипции и клеточной дифференцировке (Ванюшин, 1983;

Razin, Riggs, 1980). Так, например, в клетках мастоцитомы мыши уровень метилирования палиндромов в транскрипционно активной ДНК заметно ниже, чем у неактивной в транскрипции ДНК (Boehm, Dra-hovsky, 1981).

При определении уровня метилирования суммарной ДНК нами было выявлено уменьшение содержания т^с в ДНК лимфоцитов крови больных ХЛЛ коров по сравнению с нормой, что согласуется с имеющимися в литературе данными (Бурцева и др., 1979). Полученные нами результаты о значительном увеличении уровня метилирования собственно палиндромов и особенно прилегающих к ним последовательностей ДНК, а также об уменьшении уровня метилирования повторяющихся последовательностей ДНК при хроническом лимфолейкозе коров указывают на разнонаправленный характер метилирования последовательностей ДНК, что может лежать в основе дифференциального инги-бирования одних, и одновременного индуцирования транскрипции других генов при трансформации клеток.

Одной из возможных причин обнаруженного нами специфического увеличения уровня метилирования палиндромов в ДНК лимфоцитов крови больных хроническим лимфолейкозом коров могло быть изменение существующих в клетке ДНК-метилаз или же появление некой новой, кодируемой вирусом ДНК-метилазы (Федоров и др., 1977; Бурцева и др., 1978; Cato, Burdon, 1977; Berneman et al., 1978; Willson et al., 1984). Использование усовершенствованного нами метода определения ДНК-метилазной активности позволило выделить из лимфоцитов крови больных ХЛЛ коров и частично очистить две ДНК-мети-дазные активности, различающиеся по сродству к голубой сефарозе, а одну ДНК-метилазную активность из лимфоцитов крови здоровых коров. Значит, в лимфоцитах крови больных ХЛЛ коров несомненно содержатся иные по набору и специфичности действия ДНК-метилазы, чем у здоровых животных. Заслуживает внимания видимое противоречие между обнаруженным ранее и подтвердившимся в нашей работе уменьшением уровня метилирования суммарной ДНК лимфоцитов крови при ХЛЛ коров и выявленным здесь повышением удельной активности ЦНК-метилазы из лимфоцитов крови больных хроническим лимфолейко-зом коров. На первый взгляд кажется несколько необычным и непонят-яым, как на фоне возросшей ДНК-метилазной активности в лейкозных лимфоцитах ДНК оказывается все же менее метилированной, чем в лимфоцитах крови здоровых коров.

Такое снижение уровня метилирования суммарной ДНК могло быть звязано с уменьшением количества донора метильных групп (sam) в эеакции метилирования ДНК in vivo. Однако некоторая противоречивость в сообщениях различных авторов относительно изменения содержания sam В опухолевых клетках (Baldessarini, Carbone, 1965; Hoff-nan et al., 1980; Walker, Becker, 1981) заставляет пока воздержаться от сколько-нибудь категоричных заключений на этот счет. 1аиболее вероятным объяснением гипометилирования суммарной ДНК 1ри лимфолейкозе коров, по-видимому, следует считать уменьшение доступности соответствующих акцепторных сайтов метилирования в) езультате взаимодействия ДНК с какими-то компонентами хроматина. 1ельзя исключить также и возможность существования в лимфолейкоз-шх клетках каких-то специфических ингибиторов ДНК-метилазной ре-шции. Так, показано, что в лейкоцитах крови людей больных ХЛЛ гвеличено содержание полиаминов (Блинов и др., 1983; Janne et al. -978), являющихся ингибиторами ДНК-метилаз (Сох, 1979).

Существование двух качественно различных ДНК-метилазных активностей в лейкозных клетках и только одной выявленной ДНК-мети-сазной активности в нормальных лимфоцитах подтверждается и резуль-!атом наших дальнейших экспериментов по исследованию основных физико-химических и каталитических свойств выделенных ДНК-метилаз. В частности, в лейкозных клетках помимо ДНК-метилазной активности, близкой по своим свойствам к ДНК-метилазной активности нормальных клеток, выявляется дополнительная ДНК-метилазная активность, четко отличающаяся по оптимуму pH и сайт-специфичности, что хорошо согласуется с данными других авторов о появлении в трансформированных клетках качественно новых ДНК-метилаз (Sneider et al., 1975; Browne et al., 1977; Berneman et al., 1978; Willis et al., 1984). Вместе с тем, попытка разделить две ДНК-метилазные активности лимфолейкозных клеток седиментацией в градиенте плотности глицерина не увенчалась успехом, что указывает на близость их молекулярных масс. Действительно, если одна из ДНК-метилазных активностей лейкозных клеток тождественна ДНК-метилазной активности нормальных клеток и, следовательно, является белком с молекулярной массой около 120 000 д, она вряд ли будет отделима в глицериновом градиенте от второй ДНК-метилазной активности, имеющей близкую молекулярную массу (около 130 000 д).

Выявленные различия по включению ферментом из лейкозных клеток (в одинаковых условиях) в ДНК-акцепторы большего количества метильных групп по сравнению с ферментом из нормальных клеток еще не означают, что выделенные ДНК-метилазы отличаются по субстратной специфичности. Эти различия могут быть следствием чисто количественной разницы в удельном содержании метилирующих ферментов в препаратах ДНК-метилаз из лейкозных и нормальных клеток. Действительно, активность этих ДНК-метилаз меняется очень сходным образом при использовании в качестве субстрата различных ДНК. Поэтому было необходимо провести прямое исследование сайт-специфичности действия полученных препаратов ДНК-метилаз. Для этого мы применили метод изоплитного анализа, с помощью которого ряду авторов удалось провести сравнительное исследование распределения минорных оснований в ДНК различного происхождения (Кирнос и др., 1981; Sneider, 1972; Simon et al., 1978). Оказалось, что и в этом случае ДНК-метилаза I из лейкозных и ДНК-метилаза из нормальных клеток ведут себя практически одинаково, то есть они метилируют сходные нуклеотидные последовательности. Это служит дополнительным подтверждением предположения об их тождественности. В то же время ДНК-метилаза П из лейкозных клеток заметно отличается от выше названных ферментов: она преимущественно метилирует остатки ци-тозина в монопиримидиновой последовательности Pu-C-Pu, чего не наблюдается у ДНК-метилазы I и ДНК-метилазы из лимфоцитов крови здоровых коров. Это указывает на то, что ДНК-метилаза П может узнавать более короткие нуклеотидные последовательности и поэтому может метилировать ДНК в большей степени, чем ДНК-метилаза I и ЩЖ-метилаза из нормальных клеток. Заметим, что это предположение объясняет и другое наше наблюдение — о более высокой акцепторной способности одной и той же ДНК при метилировании ДНК-метилазой из лейкозных клеток по сравнению с ДНК-метилазой из нормальных клеток (рис.12). Добавим, что ДНК-метилаза с измененной сайт-специфичностью была найдена ранее в клетках асцитной опухоли Кребса.

Browne et al., 1977).

Таким образом, при сравнительном исследовании ДНК-метилаз нормальных и лейкозных лимфоцитов крови коров разными независимыми методами (хроматография на голубой сефарозе, изучение pH зависимости, изоплитный анализ) у больных ХЛЛ животных выявляются по крайней мере две различные ферментативные активности, что позволяет считать весьма вероятным существование более, чем одной [[НК-метилазы в лимфоцитах крови больных хроническим лимфолейкозом iopoB. Найденные нами изменения в характере метилирования ДНК и обнаружение новой (дополнительной) ДНК-метилазной активности в лимфоцитах крови больных хроническим лимфолейкозом коров хорошо согласуются с гипотезой о возможной роли метилирования ДНК в трансформации клеток (Вогек, Згэ-пЗлгавап, 1966).