Молекулярно-генетические факторы риска тромбофилических состояний при ишемическом инсульте у пациентов молодого возраста

Заболеваемость инсультом в современном обществе остается одной из наиболее значимых медицинских и социальных проблем. В Российской Федерации она составляет 2,5−3 случая на 1 ООО населения в год. По данным НИИ неврологии РАМН [.Верещагин Н. В. и др., 2002], ежегодно инсульт поражает около 6 млн. человек, в России — более 400 тысяч.

Актуальность изучения ишемического инсульта определяется его значительными распространенностью, смертностью, составляющей 1 случаи на 1 ООО населения в год. Постинсультная инвалидизация занимает первое место среди всех причин инвалидизации — 3,2 на 10 ООО населения [Яхно Н.Н., Штульман Д. Р., 2001].

В течение первого месяца уходят из жизни до 40% больных. Одна треть заболевающих инсультом — люди трудоспособного возраста, но к труду возвращаются лишь 20% лиц, перенесших инсульт. В структуре инсульта основную часть случаев, как в нашей стране, так и в других развитых странах мира составляют ишемические инсульты, регистрирующиеся в 75−85% всех случаев острых нарушений мозгового кровообращения (ОНМК) [Верещагин Н.В., 2002]. Наблюдаются случаи ишемического инсульта у детей, родители которых ранее переносили инсульты [Троишн В.М. и др., 1995; Carvalho K.S., Gang В.Р., 2002]. Выявление лиц с повышенным риском заболевания инсультом — одна из наиболее важных социальных проблем современной медицины.

Ишемический инсульт является исходом различных по своему характеру патологических состояний системы кровообращения: сосудов, сердца, системы крови. При этом установлено многообразие механизмов его развития — концепция патогенетической гетерогенности ишемического инсульта [Верещагин Н.В., 1993]. Интенсивное развитие данной концепции привела к созданию клинических диагностических критериев основных подтипов ишемического инсульта, а также определению частоты их встречаемости [Adams Н.Р., 1993].

Согласно данным НИИ неврологии РАМН, среди ишемических ОНМК уточненного генеза атеротромботический инсульт составляет 34%, кардиоэмболический — 22%, гемодинамический инсульт — 15%, лакунарный инсульт — 22%, инсульт по типу гемореологической микроокклюзии — 7% [Суслана З.А. и др., 2005].

Однако даже в условиях современного высокоспециализированного неврологического стационара при комплексном клинико-инструментальном и лабораторном обследовании в 8−15% случаев не удается раскрыть основную причину возникновения инсульта, в некоторых клиниках эта цифра достигает 20−40% Щеев А. С., Захарушкина И. В., 1998; Верещагин Н. В. и др., 2002]. Чаще всего такие диагностические сложности возникают при обследовании пациентов с ишемическим НМК, развившимся в молодом возрасте. Именно в этой подгруппе пациентов есть основание исследовать генетические факторы, которые детерминируют особенности гемостаза, состояние эндотелиальной системы и некоторые другие ключевые параметры гемоцирку ляции.

В последние годы в связи с развитием молекулярной генетики интенсивно изучаются генетические факторы риска ишемического инсульта. В частности, в группе больных с ишемическим НМК проводился анализ генетических ассоциаций с генами ренин-ангиотензиновой системы, генами NO-синтаз, генами, кодирующими метаболизм липидов, генами программированной клеточной гибели [Моляка Ю.К. и др., 1998; Скворцова В. И. и др., 2003; Иллариошкин С. Н., 2005; Markus К, 2004; Rubattu S et al., 2004; Zhang J. et al., 2004; Morgan L., Humphies S.E., 2005]. Полученные результаты о вкладе различных аллельных вариантов данных генов в развитии ишемического инсульта остаются противоречивыми, и лишь немногие из выявленных ассоциаций были подтверждены на независимых популяциях.

В то же время существует еще одна перспективная группа геновкандидатов, которые потенциально могут быть связаны с формированием риска ишемического НМК — гены системы гемостаза и обмена гомоцистеина (ГЦ), сравнительное исследование которых в различных популяциях мира является весьма актуальной задачей ангионеврологии [.Madonna P. et al., 2002; Pezzini A. etal., 2003; HaywoodS. et al., 2005].

Важнейший фактор развития венозных и артериальных тромбозов в ангионеврологической, акушерской, хирургической практике и других областях клинической медицины — так называемых тромбофилических состояний — является нарушение активности ряда ключевых факторов системы гемостаза. Тромбофилическое состояние — это повышенная склонность организма к развитию тромбозов или внутрисосудистого свертывания крови, обусловленная нарушением регуляторных механизмов системы гемостаза или изменением свойств отдельных ее звеньев [Балуда В.П. и др., 1995; Суслина З. А. и др., 2005]. Тромбофилии могут носить приобретенный характер, связанный с действием ряда экзогенных факторов (длительная иммобилизация, послеоперационный и послеродовый периоды). Однако в большинстве случаев эти нарушения носят генетический характер. В качестве наиболее значимых факторов такого рода обсуждаются мутации G20210A в гене FII (протромбин), R506Q в гене FV (Leiden), а также генах антитромбина III и протеина С, протеина S, тромбомодулина, плазминогена, тканевого активатора плазминогена и других [Бокарев И.Н., 1991; Патрушев Л. И., 1998; Козловская Н. Л., 2003; Джафаров Т. А., 2003; Иллариошкин С. Н., 2005; De Stefano V. et al., 1996; Nagaraja D., Christopher R., 2002; Slooter A.J. et al., 2005; Lalouschek W. et al., 2005; Markus H.S., Alberts M.J., 2006].

Самостоятельное значение в формировании тромбофилических состояний имеют нарушения в системе метионин-гомоцистеинового обмена, приводящие к гипергомоцистеинемии, которая согласно данным литературы признана независимым фактором риска развития тромбозов и атеросклероза [Федин A.M. и др., 2002; Graham I.M. et al. 1997; Jacobsen D.W., 1998;

Eikelboom J.W., 1999; Madonna P. et ah, 2002]. Данное состояние возникает в результате нарушенного метаболизма гомоцистеина (ГЦ) — промежуточного продукта обмена метионина, и может иметь экзогенное происхождение (например, связанное с недостаточностью кофакторов — фолиевой кислоты, витаминов В12 и Вб). Однако основными причинами развития гипергомоцис-теинемии являются генетические дефекты, приводящие к неполноценности ферментов обмена ГЦ — метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), метионинсинтазы-редуктазы (MTR), цистатионин-синтазы и др. Welch G., Loscalzo J., 1998].

Избыток ГЦ оказывает системное повреждающее действие на эндотелиальные клетки стенки сосудов, стимулируя образование свободных радикалов и повышение в них концентрации липопротеинов низкой и очень низкой плотности (ЛПНП, ЛПОНП), снижение продукции релаксирующего фактора и сульфатированных глюкозаминогликанов. Одновременно происходит угнетение синтеза тромбомодулина, без которого тромбин не образует комплекса, активирующего естественные белковые антикоагулянты. Последние не оказывают прессорного действия на активность факторов Va и Villa. Таким образом, формируются сосудистый и коагуляционный компоненты тромбоваскулярной болезни [Федин А.И. и др., 2002; Наг pel Р. С. et al., 1996; Refsum Н. et ah, 1998].

Ряд мутаций описанных выше генов (Лейденская мутация R506Q в гене FV, мутация G20210A в гене FII протромбина и др.) являются мажорными, т. е. с высокой частотой встречаются в различных популяциях мира. Это делает технически возможным скрининг больных с тромбофилиями на носительство этих мутаций. При этом, в отличие от ишемической болезни сердца, периферических венозных тромбозов и некоторых других заболеваний системы кровообращения, в развитии которых роль тромбофилических мутаций твердо установлена, их значение в качестве факторов риска ишемических НМК нуждается в уточнении [.Harmon D.L. et al, 1990; Li Z. et al., 2003; Markus H., 2004]. Имеющиеся различия мнений по данному вопросу могут быть связаны не только с межпопуляционной генетической вариабельностью, но и с особенностями обследованных разными авторами выборок больных с ишемическими НМК. В частности, практически не изучена роль тромбофилических мутаций у пациентов с наиболее высокой вероятностью генетической предрасположенности к инсульту — у лиц с диагнозом ишемическое НМК, развившееся в молодом возрасте. Именно эти больные, не имеющие основных наиболее изученных популяционных факторов риска НМК, чаще всего попадают в группу «кргттогенного» инсульта.

Таким образом, установление соответствующего генетического профиля может носить прогностический характер и позволит выделять группу больных с генетическими факторами риска возникновения ишемического инсульта.

Цель и задачи исследования

.

Цель работы: анализ генетических факторов риска ишемического инсульта путем исследования мажорных мутаций в генах системы гемостаза и метионин-гомоцистеинового обмена у больных с «криптогенным» ишемическим инсультом молодого возраста.

В соответствии с поставленной целью определены следующие задачи:

1. Сформировать группу больных с «криптогенным» ишемическим инсультом молодого возраста, исключив основные факторы риска заболеваний системы кровообращения (артериальная гипертония, атеросклероз, кардиальная патология, сахарный диабет, дислипидемии и др.).

2. Провести анализ аллельных вариантов генов протромбина (FII), V фактора (FV), VII фактора свертывания крови (FVII) — метилентетра-гидрофолатредуктазы (MTHFR) и метионинсинтазы-редуктазы (MTR) у больных с «криптогенным» ишемическим инсультом молодого возраста.

3. Изучить взаимосвязь уровня ГЦ в плазме крови с носительством исследуемых мутаций метионин-гомоцистеинового обмена — в генах MTHFR и MTR.

4. Определить значение носительства выявленных мутаций в генах-кандидатах и сформулировать рекомендации по профилактике и лечению соответствующей категории больных и лиц из группы риска.

5. Получить первый опыт патогенетического лечения гипергомо-цистеинемии у носителей мутации в генах метионин-гомоцистеинового обмена, проанализировать результаты лечения в зависимости от генетического статуса пациентов.

Научная новизна работы.

• Впервые проанализирована роль мажорных мутаций в генах системы гемостаза (протромбина FII, V фактора FV, VII фактора свертывания крови FVII) и обмена ГЦ {MTHFR, MTR) в качестве независимых факторов риска у больных с «криптогенными» ишемическими НМК молодого возраста в славянской популяции европейской части России. Установлено, что у молодых больных с «криптогенным» ишемическим инсультом достоверно чаще по сравнению с контролем встречается носительство мутаций R506Q в гене FV, G20210A в гене FII (протромбин), Q353R в гене FVII, С677Т в гене MTHFR., P1173L в гене MTR, способствующих формированию тромбофилического состояния. Показано «аддитивное» действие комбинаций неблагоприятных генотипов (более ранний возраст манифестации ишемического инсульта, его сочетание с сосудистыми эпизодами другой локализации).

• Показана взаимосвязь уровня ГЦ в плазме крови с носительством мутаций в генах MTHFR и MTR: носители мутантных аллелей 677 Т (ген MTHFR), 1173L (ген MTR), а также комбинированного генотипа.

677Т+1298С (ген MTHFR) в гетерозиготном состоянии имеют достоверно более высокий средний уровень ГЦ в плазме крови. • Получен первый опыт патогенетического лечения гипергомоцистеин-емии, обусловленной мутациями в генах метионин-гомоцистеинового обмена у больных с ишемическим инсультом молодого возраста.

Практическая значимость исследования заключается в выявлении генетически обусловленных тромбофилических состояний у лиц с «криптогенным» ишемическим инсультом молодого возраста, что расширяет представления о патогенетической гетерогенности ишемических НМК. Диагностика мутаций в генах системы гемостаза и метионин-гомоцистеинового обмена позволяет формировать особую группу риска по ишемическому инсульту, ориентированную на проведение целенаправленной первичной и вторичной профилактики НМК. Полученные результаты успешной патогенетической коррекции повышенного уровня ГЦ при генетически обусловленной гипергомоцистеинемии позволяет рекомендовать разработанный комплекс мероприятий в терапии больных с заболеваниями системы кровообращения, ассоциированными с гипергомоцистеинемией.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Мажорные мутации в генах системы гемостаза (R506Q в гене V фактора свертывания крови, G20210 в гене протромбина, Q353R в гене VII фактора свертывания крови) и метионин-гомоцистеинового обмена (С677Т в гене MTHFR, P1173L в гене MTR) являются самостоятельными факторами риска ишемического инсульта у пациентов молодого возраста.

2. Сочетание неблагоприятных аллелей нескольких генов усиливает тромбофилический эффект такого комбинированного генотипа и сопровождается более ранними и множественными тромботическими эпизодами со стороны различных органов-мишеней — головного мозга, сердца, периферических вен.

3. Имеется патогенетическая взаимосвязь между конкретными генотипами, ассоциированными с мутациями в генах метионин-гомоцистеинового обмена, и уровнем ГЦ в плазме крови, что имеет определенное диагностическое и прогностическое значение.

4. При генетически обусловленной гипергомоцистеинемии уровень ГЦ плазмы крови может подвергаться коррекции при назначении соответствующей диеты и препаратов — кофакторов метионин-гомоцистеинового обменав работе получен первый опыт такой патогенетической коррекции у больных с «криптогенным» ишемическим инсультом молодого возраста.

Автор выражает искреннюю благодарность за помощь и поддержку в проведении настоящего исследования сотрудникам НИИ неврологии РАМН:

• ведущему научному сотруднику отделения острых нарушений мозгового кровообращения, кандидату медицинских наук Борису Алексеевичу Кистеневу;

• старшему научному сотруднику нейрогенетического отделения с ДНК-лабораторией, кандидату медицинских наук Сергею Анатольевичу Клюшникову;

• заведующей лаборатории гемореологии и гемостаза, доктору медицинских наук, профессору Виктории Григорьевне Ионовой, научному сотруднику лаборатории Елене Георгиевне Деминой;

• руководителю отделения медицинской информатики, доктору медицинских наук Ольге Юрьевне Ребровой.

Выражаю также благодарность заведующему лабораторией биохимии поликлиники № 68 ЦАО, доктору биологических наук, Владимиру Сергеевичу Ефимову за помощь в проведении части биохимических исследований.

выводы.

1. Генетически обусловленные тромбофилические состояния играют важную роль в развитии ишемического инсульта у лиц молодого возрастатак, хотя бы одна или несколько из изученных нами мажорных мутаций в 5 генах гемостаза и метионин-гомоцистеинового обмена выявлены у 72% больных с криптогенным ишемическим инсультом, развившимся до 45 лет.

2. У больных с «криптогенным» ишемическим инсультом молодого возраста достоверно чаще по сравнению с контролем встречается ряд нижеследующих генотипов и аллелей полиморфных вариантов генов системы гемостаза: генотип R/Q и аллель Q (Лейденская мутация) в полиморфном сайте R506Q гена V фактора свертывания крови (FV) — генотип G/A и аллель, А в полиморфном сайте G20210A гена протромбина (FIT) — генотип Q/R в полиморфном сайте Q353R гена VII фактора свертывания крови (FVII).

3. Больные с «криптогенным» ишемическим инсультом молодого возраста достоверно отличаются от контрольной группы по распределению генотипов полиморфных вариантов генов метионин-гомоцистеинового обмена: в группе больных достоверно повышена частота гетерои гомозиготного носительства аллеля Т в полиморфном сайте С677Т гена MTHFR (генотипы С/Т и Т/Т), гетерозиготного носительства аллеля L b полиморфном сайте P1173L (генотип P/L) гена MTR, а также общая частота указанных мутантных хромосом.

4. Установлена патогенетическая взаимосвязь между генотипами по исследованным мутациям метионин-гомоцистеинового обмена и уровнем ГЦ в плазме крови: у носителей генотипа С/С (сайт С677Т) гена MTHFR средний уровень ГЦ составил 25,6+15,1 мкмоль/л, тогда как при носительстве неблагоприятных генотипов С/Т и Т/Т отмечена нарастающая гипергомоцистеинемия — соответственно, 37,8+17,3 и 43,7+15,6 мкмоль/лкомбинация гетерозиготных генотипов С/Т (сайт С677Т) и А/С (сайт А1298С) в гене MTHFR сопровождается развитием выраженной гипергомоцистеинемии (41,2+12,5 мкмоль/л), сопоставимой по уровню ГЦ с наиболее неблагоприятным генотипом Т/Т в сайте С677Т.

5. Носительство нескольких «неблагоприятных» аллелей изученных тромбофилических генов характеризуется аддитивным эффектом и усиливает суммарный риск развития тромботических эпизодов в молодом возрасте со стороны различных «мишеней» — головного мозга, сердца, периферических вен.

6. При генетически обусловленной гипергомоцистеинемии уровень ГЦ плазмы крови может подвергаться коррекции (вплоть до нормализации) при назначении соответствующей патогенетической диеты и препаратов — кофакторов метионин-гомоцистеинового обмена.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Исследование мутаций в генах тромбофилических факторов должно включаться в общий алгоритм обследования больных с криптогенным ишемическим инсультом, развившимся в молодом возрастевыявление соответствующих генетических вариантов позволяет осуществлять медико-генетическое консультирование у лиц из группы риска в отягощенной семье, а также проводить специфическую первичную и вторичную профилактику НМК.

2. При генетически обусловленной гипергомоцистеинемии больным и клинически здоровым лицам может быть рекомендовано патогенетическое лечение, направленное на нормализацию уровня ГЦ в плазме крови.