Стабилизация биологически активных соединений методом включения их в структуру природных биоразлагаемых полимерных материалов

Одна из наиболее перспективных задач современной биотехнологии — создание биокатализаторов на основе иммобилизованных ферментов. Преимущество иммобилизованных ферментов перед растворимыми заключается в большей их стабильности, возможности регенерирования и отделения иммобилизованного фермента от продукта реакции. В качестве таких катализаторов могут использоваться ферменты, включенные в пленочные покрытия.

Современные тенденции при разработке композиционных материалов, как основы для иммобилизации, состоят в придании им ряда положительных свойств: способность подвергаться разложению в естественных условиях среды, низкий уровень неспецифических взаимодействий с примесями и биологически активными веществамимеханическая устойчивость, наличие функциональных групп, пригодных для селективной химической модификацииэкологическая чистота процесса получения (Новиченко А.Н., Новикова Т. П., Зеленко И. Н., Мазолевский Д. М., Бондаренко А. П., 2006).

Очевидно, что применение научных подходов, направленных на создание данных материалов с заранее заданными свойствами и функциями на основе иммобилизованных биологических лигандов (ферментов, микробных клеток, антител и нуклеотидов), может способствовать их использованию в медицине, биохимии, фармакологии.

Работы по биоразлагаемым материалам актуальны и востребованы, о чем свидетельствует проведение первой Международной конференции по биоразла-гающимся полимерам и соответствующим композитам (Дербишер В.Е., Герма-шев И.В., Дербишер Е. В., 2008; Заиков Г. Е., Арцис М. И., 2008; Савостова Т. Л., Бирюков А. Л., Саркисов П. Д., 2008; Ткачев А. Г., Михалева З. А., Рыбкин C.B., Долгова О. В., 2008).

Технологии создания композиционных материалов включают в себя ряд открытий последних лет в области химии и физики высокомолекулярных систем и структур (Володькин Д. В, 2005; Тулинов А. Б., Корнеев A.A.,.

Овчаренко Л.В., Гармаш И. И., 2007; Андрианова Г. П., 2010; Буниятзаде И. А., Мамедов Г. Г., Азизов A.A., Алосманов P.M., Магеррамов A.M., 2010; Межи-ковский С.М., 2010; Олтаржевская Н. Д., Коровина М. А., 2010).

Включение ферментов в структуру природных биоразлагаемых полимеров продиктовано необходимостью создания лекарственных повязок нового поколения с регулируемым сроком службы и высоким процентом сохранения активности биологической субстанции (Чернобаева М.В., Салим Хусам, Скат-ков С.А., Демина Н. Б., 2010). В отличие от обычных сорбционных перевязочных средств (марлевых, ватно-марлевых, нетканых материалов, полимерных губок), у которых устанавливается динамическое равновесие концентрации микрофлоры на границе «повязка-рана», биологически активные гелевые повязки обеспечивают пластифицирующее воздействие на ткани раны, размягчают некротические образования, диффундируют под них, облегчая механическое удаление нежизнеспособных тканей, и предотвращают развитие инфекции на поверхности раны под струпом (Юданова Т.Н., 2004).

В последние два десятилетия отмечается неуклонное увеличение доли острых гнойно-воспалительных заболеваний. Это связано в основном с неудовлетворительным состоянием экологии во многих регионах, низким социально-экономическим уровнем жизни значительной части населения, со снижением факторов неспецифической противомикробной резистентности, с развитием интегральных гормонально-метаболических нарушений в организме на фоне хронических соматических болезней (Легонькова О. А, 2007; Шавырин В. А., Квасенков О. И., 2008; Ухарцева И. Ю., 2009).

На сегодняшний день, параллельно с применением антибиотиков, возрастает число антибиотико-резистентных штаммов бактерий, частота и тяжесть инфекционных осложнений, попутно изменяющих свои клинические черты. Таким образом, очевидно, что, несмотря на все достижения современной медицины, инфекция не без основания остается «камнем преткновения» в лечении ч различных ран. Возникает необходимость в создании принципиально новых препаратов при их лечении.

Альтернативным решением данных проблем могут выступать препараты системной энзимотерапии, относящиеся к группе гидролаз и представленные высокоочищенными протеиназами животного и растительного происхождения, а также фиксированные на различных раневых покрытиях ферментные препараты для местного лечения ран (Ефименко Н.А., 2005).

Цель диссертационной работы: стабилизация биологически активных соединений посредством включения их в структуру природных биоразлагаемых полимерных материалов.

Основные задачи исследования:

1. Синтезировать биоразлагаемые пленочные материалы на основе высокомолекулярного природного полисахарида, белкового комплекса и пластификатора.

2. Исследовать свойства полученного пленочного материала (спектры поглощения в УФ — области, предел прочности, влагоёмкость).

3. Разработать метод иммобилизации фермента Р — гиалуронидазы и исследовать влияние различных факторов (рН среды, температуры) на его активность. Изучить кинетику ферментативной реакции, динамику потери удельной активности при хранении в различных температурных условиях.

4. Иммобилизовать фермент трипсин в пленочные материалы и исследовать влияние некоторых факторов на его активность (рН среды, температуры, количество субстрата), изучить влияние времени постановки реакции, динамику потери удельной активности при хранении в течение в различных температурных условиях.

5. Разработать метод иммобилизации лизоцима и исследовать влияние рН среды, температуры, времени постановки ферментативной реакции и длительности хранения в различных температурных условиях на его активность.

6. Провести апробацию биоразлагаемых материалов с иммобилизованным трипсином на экспериментальных животных.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

Впервые получены принципиально новые пленочные материалы, подвергающиеся самостоятельной деградации в естественных условиях. Подобран оптимальный состав для получения биоразлагаемых пленок, обладающих следующими преимуществами: прозрачность, пластичность, прочность структуры при разрывном напряжении.

Проведена иммобилизация ферментных препаратов в структуру биоразлагаемых пленочных материалов с высоким процентом сохранения удельной активности.

Проведены исследования, направленные на изучение факторов, влияющих на снижение удельной активности ферментов при их иммобилизации в структуру биоразлагаемых пленочных материалов.

Впервые получены пленочные покрытия с иммобилизованными ферментами р — гиалуронидазой, трипсином, лизоцимом, которые могут быть использованы в качестве раневых покрытий в медицине и косметологии.

Приоритетность выполненных исследований подтверждена 1 патентом РФ на изобретение.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

Получены биоразлагаемые пленочные материалы с иммобилизованными в их структуру ферментами, способствующими процессу ранозаживления.

Разработаны методические приёмы по определению активности ферментов р — гиалуронидазы и лизоцима по прототипу определения амилазной активности слюны. Упрощена методика определения активности лизоцима относительно ранее известной.

Разработаны технологические основы получения пленочных материалов, обладающих ферментативным действием.

Материалы диссертации используются в лекциях и практических занятиях на курсах «Высокомолекулярные соединения» (Лекция «Биоразлагаемые полимерные материалы как основа для иммобилизации фермента»), «Введение в на-нотехнологии» (Лекция «Структура и свойства наноматериалов») ФГБОУ ВПО.

СГУ. В лаборатории микробиотехнологии Научно-образовательного центра «Технологии живых систем и биологические материалы» проведены испытания биодеградируемых пленок (протокол от 28 марта 2008 г.).

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Научно-методические подходы к получению биоразлагаемых полимерных материалов.

2. Методы иммобилизации ферментов в структуру пленочных покрытий.

3. Свойства полученных биодеградируемых пленок и раневых покрытий на основе иммобилизованных ферментов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Основные результаты диссертационной работы были представлены на Московской международной конференции «Мир биотехнологии» (Москва,.

2008), XX симпозиуме «Современная химическая физика» (Туапсе, 2008), V съезде Общества биотехнологов России им. Ю. А. Овчинникова (Москва, 2008), Московской международной конференции «Мир биотехнологии» (Москва,.

2009), V ежегодной научной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр южного научного центра РАН (Ростов-на-Дону, 2009), 54-научно-практической конференции «Университетская наука — региону» (Ставрополь, 2009), 55-научно-практической конференции «Университетская наука — региону» (Ставрополь, 2010), IV Международной конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Ростов-на-Дону, 2011), 5 научно-практической конференции «Университетская наука — региону» (Ставрополь, 2011).

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА.

Диссертационная работа выполнена самостоятельно. Отдельные этапы работы были выполнены совместно с кандидатом биологических наук Воробьевой О. В., аспирантом Ивановой A.M. (ФГБОУ ВПО СГУ).

ПУБЛИКАЦИИ.

Основное содержание диссертации отражено в 14 опубликованных работах (в ведущих научных журналах, рекомендуемых ВАК — 3 статьи), имеется 1 патент РФ на изобретение.

СТРУКТУРА И ОБЪЁМ РАБОТЫ Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка использованной литературы и приложения. Работа изложена на 133 страницах, содержит 14 таблиц и 33 рисунка.

Список литературы

включает 148 отечественных и зарубежных литературных источников.

выводы.

1. В результате проведенных исследований получены биодеградируемые пленочные материалы на основе высокомолекулярного природного полисахарида метилцеллюлозы, белкового комплекса желатина и пластификатораглицерина.

2. Установлено, что при увеличении массовой доли пластификатора в составе пленочного материала увеличивается светопоглощение в УФ — области спектра. Прочность разработанных пленочных материалов, на разрыв по длине и ширине соответствует прочности полиэтилена при одинаковых условиях и составляет 15,20 и 15,26 Мпа соответственно.

Показано влияние на влагоёмкость пленочного материала пластификатораглицерина, введение которого в структуру пленочного материала в количестве 10,28 масс. %, повышает гидрофильность системы и увеличивает степень набухания на 32%.

3. Разработан метод иммобилизации фермента Р — гиалуронидазы и исследовано влияние факторов на его активность. Определены оптимальные параметры, при которых фермент Р — гиалуронидаза, иммобилизованный в пленки, проявлял наибольшую удельную активность 216 мэкв/г: рН среды — 6,9- температура — 37 °Свремя постановки ферментативной реакции — 40 минут. Установлено, что скорость ферментативной реакции для иммобилизованного фермента выше скорости реакции для растворимого фермента в три раза. Показана динамика потери удельной активности при хранении иммобилизованного препарата в течение четырех месяцев. Установлено, что при температуре 4 °C удельная активность фермента составила 66%, а при температуре 18−25 °С-10%.

4. Проведена иммобилизация трипсина в пленочные материалы и определен оптимум рН, температуры и времени постановки ферментативной реакции. Установлено, что трипсин, иммобилизованный в пленки, проявлял наибольшую удельную активность — 171,5 мэкв/г при рН среды — 8,15 и температуре -37 °С, время постановки ферментативной реакции — 20 минут. Определено, что оптимальное массовое соотношение компонентов в системе субстрат-фермент при постановке ферментативной реакции следующее: 1 мг казеина на 0,025 мг фермента (40:1). На основании результатов исследования установлено, что иммобилизованный трипсин, хранящийся при температуре 4 °C, к четвертому месяцу хранения имел стабильный процент сохранения биокаталитической активности, а хранящийся при температуре 20 °C, потерял свою активность на 80%.

5. Установлено влияние рН и температуры на активность растворимого и иммобилизованного лизоцима. Определено, что лизоцим, иммобилизованный в пленки, проявлял наибольшую удельную активность 290 мг крахмала/г фермента при рН среды — 6,9 и температуре — 37 °C, при этом время постановки ферментативной реакции составило 4 часа. Показано, что пленки с иммобилизованным лизоцимом, при температуре 4 °C к третьему месяцу хранения имели стабильный процент сохранения биокаталитической активности — 80%.

6. В ходе апробации полученных биоразлагаемых материалов с иммобилизованным трипсином на экспериментальных животных (крысах) в качестве ранозаживляющих покрытий, установлено, что скорость заживления была стабильно высокой с начала эксперимента с максимальным значением заживления в первые трое суток, что свидетельствует об эффективности разработанных материалов при лечении ран различной этиологии. Раневой процесс с пленкой с трипсином характеризовался достоверным уменьшением площади раны в абсолютных значениях и отмечался с третьих суток эксперимента по сравнению с контролем и пленкой без фермента.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Создание биоразлагаемых материалов с иммобилизованными в их структуру протеолитическими ферментами представляет большой интерес с точки зрения использования в медицине в качестве ранозаживляющих повязок.

Синтезированы пленочные материалы на основе природного полисахарида метилцеллюлозы с использованием глицерина как реагента-пластификатора и белкового комплекса желатина для модификации реологических характеристик с иммобилизованными в их структуру ферментами класса протеаз. В ходе выполнения исследований было доказано, что иммобилизованные ферменты имеют большую способность к деструкции субстрата, чем растворимые.

Структурные особенности пленочных материалов были подтверждены исследованием физико-химических свойств.

Данные сравнительного анализа спектров поглощения в УФ — области разработанных и традиционных пленочных материалов свидетельствуют о повышении барьера поглощения, что может быть связано с повышением плотности упаковки в аморфных областях МЦ за счет модификации структуры молекулами глицерина и желатина. Модификация МЦ молекулами желатина может осуществляться путем ковалентного связывания боковых аминокислотных остатков полипептидных цепей последнего с функциональными группами МЦ.

Прочностные характеристики материала-основы обеспечивают их практическое применение. Полученные данные по величинам прочности на разрыв по длине и ширине — 15,2 и 15,26 (МПа) соответственно обусловлены изменением потенциальной энергии межмолекулярного взаимодействия, преимущественно потенциальной энергии вращения вокруг ковалентных связей монозвеньев МЦ.

Влагопоглощение оценивали по степени набухания исследуемых образцов. Увеличение массы глицерина в структуре материала повышает гидро-фильность системы и тем самым увеличивает степень набухания на 32%.

Данное свойство может быть использовано для разработки раневых покрытий на основе биологически активных веществ для применения в медицинской практике.

Разработан и оптимизирован метод иммобилизации фермента Р — гиалу-ронидазы тестикулярного типа в биоразлагаемые пленки и метод определения активности растворимого и иммобилизованного фермента, где в качестве субстрата использовали крахмал. Удельная активность иммобилизованного фермента — 216 мэкв/г, что составляет 240% от удельной активности растворимого.

Анализ влияния рН среды на удельную активность растворимого и иммобилизованного фермента р — гиалуронидазы показал, что наибольшая удельная активность растворимого и иммобилизованного фермента Р — гиалуронидазы наблюдалась при рН = 6,9 и составила 90 мэкв/г и 216 мэкв/г соответственно.

С целью анализа влияния температуры на удельную активность фермента был поставлен ряд экспериментов, которые показали, что растворимый и иммобилизованный фермент р — гиалуронидаза имеют максимальную удельную активность 80,95 мэкв/г и 134 мэкв/г соответственно при температуре 37 °C.

Была изучена кинетика ферментативной реакции растворимого и иммобилизованного фермента Р — гиалуронидазы. При достаточно высоких концентрациях субстрата ферментативный процесс не может контролироваться диффузией субстрата, и, следовательно, реакция протекает в кинетической области. Этот факт подтверждается прямолинейной зависимостью Лайнуивера.

1 1.

Берка в координатах — +. Кроме того, характер температурной зависимости ферментативной реакции с использованием фермента Р — гиалуронидазы подтверждает выше изложенное высказывание, т.к. повышение температуры должно способствовать переводу реакции из кинетической области в диффузную и активность фермента растворимого и иммобилизованного не должна уменьшаться, чего на практике не происходит.

Полученные данные по константам Михаэлиса-Ментен свидетельствуют о том, что фермент, иммобилизованный в пленки увеличивает скорость ферментативной реакции в 1,3 раза, кроме того его активность выше растворимого в два раза. Увеличение активности связано со стерическим фактором, отвечающим за беспрепятственное перемещение молекул субстрата к активным центрам фермента.

Важным аспектом является вопрос сохранения активности фермента в процессе хранения. В результате хранения иммобилизованного препарата в течение четырех месяцев при температуре 4 °C удельная активность фермента составила 66%, а при температуре +18 °С — 10%. Следует отметить, что ферменты, являясь биологически активными субстанциями, способны терять активность в процессе хранения.

Для иммобилизации трипсина в структуру пленочного материала была разработана методика определения удельной активности растворимого и иммобилизованного ферментов.

Для образцов полученных пленочных материалов были проанализированы спектры поглощения в УФ области. Появление дополнительного пика поглощения при длине волны 280 нм связано с присутствием фермента трипсина в структуре пленки. Этот факт может быть использован для определения содержания фермента в структуре пленки.

Анализ влияния рН среды и температуры на удельную активность растворимого и иммобилизованного трипсина показал, что максимальное значение ферментативной активности наблюдалось при рН 8,15 и температуре 37 °C и составило 47,5 мэкв/г и 215 мэкв/г соответственно. Предполагается, что высокая удельная активность иммобилизованного фермента может сохраняться при повышении температуры. Установлено, что время постановки ферментативной реакции составляет 20 минут.

Определено, что оптимальное массовое соотношение компонентов в системе субстрат-фермент при постановке ферментативной реакции следующее: 1 мг казеина на 0,025 мг фермента (40:1).

Анализ полученных данных показал, что удельная активность иммобилизованного фермента выше растворимого в среднем в 4 раза, кроме того, иммобилизованный фермент проявляет высокую ферментативную активность в процессе длительного хранения.

Было изучено влияние сроков хранения и температурных условий на сохранение удельной активности фермента, иммобилизованного в пленки. Иммобилизованный трипсин, хранящийся при температуре 4 °C к четвертому месяцу хранения имел стабильный процент сохранения биокаталитической активности, а хранящийся при температуре 20 °C, потерял свою активность на 78%. При включении протеолитических фермента в пленочные покрытия можно добиться стабилизации их против автолиза за счет изменения микроокружения.

Пленки с иммобилизованным ферментом трипсином отличаются гидро-фильностью, эластичностью, прозрачностью и способностью к деградации путем гидролиза основных связей макромолекул основы при взаимодействии с физиологической средой. Это позволяет получить ферментный препарат пролонгированного действия, который может найти применение в медицине и косметологии.

При иммобилизации лизоцима (муколитического, протеолитического фермента), в структуру биоразлагаемых пленок была разработана методика определения удельной активности растворимого и иммобилизованного фермента, где в качестве субстрата использовали крахмал. Предлагаемый метод прост в использовании, экспрессен.

Доказано, что растворимый и иммобилизованный в пленки фермент ли-зоцим проявлял наибольшую удельную активность при рН 6,9 и температуре 37 °C, которая составила 83,4 мэкв/г и 290 мэкв/г соответственно.

Разработанные пленочные материалы с иммобилизованным в его основу ферментом трипсином прошли апробацию на животных, по результатам которых можно сделать следующие выводы.

Раневой процесс с использованием разработанных пленок характеризовался достоверным уменьшением площади раны в абсолютных значениях в сравнении с контролем с девятого дня исследования. Скорость заживления была стабильно высокой с начала эксперимента с максимальным значением первые три дня. Повышенная скорость сохранялась на различных этапах эксперимента до девятого дня в сравнении с контролем. Так же достоверно подтверждено, что пленка без фермента обладает слабой ранозаживляющей активностью проявляющейся к концу эксперимента.

Таким образом, включение в состав основы биоразлагаемых пленок биологически активных веществ, в том числе различных ферментов, обладающих определенным набором свойств, делает возможным расширить спектр представленных на рынке ранозаживляющих материалов.