Исследование роли разобщающих белков (UCP) и других митохондриальных белков-переносчиков в терморегуляторном разобщении дыхания митохондрий печени и скелетных мышц сусликов (Spermophilus undulatus)

Установлено, что разобщение дыхания и синтеза АТР является одним из главных механизмов срочного образования тепла у теплокровных животных. В бурой жировой ткани (БЖТ), специализированной на продукции тепла, такое терморегуляторное разобщение опосредовано разобщающим белком — 1 (UCP1-), ранее именовавшимся термогенином (см., Skulachev, 1988; Nedergaard et al., 2001; Klingenberg, 2001). Долгие годы термогенин считался уникальным белком, присутствующим исключительно в БЖТ. Предполагалось, что в остальных тканях такое разобщение дыхания, приводящее к дополнительному поглощению кислорода и выделению тепла при низких температурах, помимо своей основной транспортной функции, могут осуществлять другие митохондриальные белки — анионные переносчики, такие как ATP/ADP антипортер (ANT) и аспатрат/глутаматный переносчик, для функционирования которых в этом случае, как и для UCP1, требуется присутствие свободных жирных кислот (Skulachev, 1998).

Однако в 1997 году были открыты еще два белка, гомологичные UCP1 по своей аминокислотной последовательности, — UCP 2, был обнаружен во всех тканях млекопитающих, кроме паренхимальных гепатоцитов (Fleury et al., 1997), и UCP3, который оказался специфичным для скелетных мышц (Boss et al., 1997). В экспериментах с белками, реконструированными в липосомы, было показано, что по своим транспортным свойствам, включая способность активироваться жирными кислотами и ингибироваться GDP, эти белки в целом аналогичны UCP-1 (Jaburek et al., 1999; Echtay et al., 2000). Широкое распространение получило представление о том, что именно UCP ответственны за несократительный термогенез и регуляцию основного обмена в тканях животных. Ранее обнаруженный факт участия ANT и других мембранных митохондриальных белков в разобщающем действии свободных жирных кислот стал представляться скорее экспериментальным артефактом.

В настоящее время спектр обнаруженных UGP стал еще шире, и соответствующие разобщающие белки были обнаружены даже у одноклеточных и растений. Хотя результаты различных исследований UCP противоречивы и свидетельствуют о возможности существования для этих белков других функций, отличных от функций термогенина бурой жировой ткани, большинство авторов по-прежнему сходятся в одном, что функция этих белков в клетке основана на их протонофорной активности, осуществляемой при участии жирных кислот, и связана с разобщением процессов дыхания и фосфорилирования в митохондриях. Это являлось отправной точкой и в наших исследованиях.

У животных способных к зимней спячке (гибернации), наиболее ярко проявляются все процессы, связанные с терморегуляцией. Ранее в нашей лаборатории была изучена роль ANT в терморегуляторном разобщении дыхания и фосфорилирования в препаратах митохондрий печени и скелетной мускулатуры выходящих из состояния гибернации сусликов. Было продемонстрировано резкое увеличение ресопрягающего действия специфического ингибитора ANT — карбоксиатрактилата (cAtr), на препараты митохондрий печени и скелетных мышц сусликов, выходящих из состояния гибернации (Брустовецкий др., 1991; Amerkhanov et al., 1996). Однако участие аспартат/глутаматного переносчика и UCP в терморегуляторном разобщении дыхания и фосфорилирования в препаратах митохондрий печени и скелетной мускулатуры у гибернирующих животных не исследовалось.

Цель работы: изучить вклад UCP и других белков — анионных переносчиков внутренней мембраны митохондрий в механизм разобщающего действия жирных кислот и реализацию терморегуляторного разобщения в митохондриях печени и скелетных мышц гибернирующих животных в различных физиологических состояниях.

В соответствии с целью были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Изучить механизм ресопрягающего действия GDP на митохондрии печени и скелетных мышц сусликов Spermophilas imdulatus и дифференцировать предполагаемые функциональные проявления UCP от проявлений активности ANT и аспартат/глутаматного переносчика с помощью соответствующих ингибиторов.

2. Используя описанную в литературе способность UCP-2 и UCP-3 активироваться супероксидом, исследовать ресопрягающее действие GDP в условиях вызванного супероксидом разобщения.

3. С помощью ингибиторов аспартат/глутаматного переносчика, ANT и разобщающих белков (UCP) выявить вклад каждого из них в терморегуляторное разобщение в митохондриях печени и скелетных мышц выходящих из состояния гибернации сусликов.

4. Опираясь на описанные в литературе свойства белков UCP, обнаружить их присутствие и функциональную активность в тканях печени и скелетных мышц гибернирующих сусликов.

Научная новизна работы. Впервые в эксперименте, направленном на выявление активности UCP, для исключения вклада других митохондриальных белков, способных участвовать в транспорте анионов жирных кислот, использованы последовательные добавки специфических ингибиторов. Впервые показано, что ресопрягающий эффект GDP не может служить объективным тестом для выявления функционирования UCP, и представлены доказательства конкурентного взаимодействия GDP с ANT. Впервые в экспериментах на интактных митохондриях печени и мышц показано отсутствие в них проводимости для ионов хлора, характерной для митохондрий БЖТ, содержащих UCP1. Установлено, что cAtr не способен ингибировать UCP1 из БЖТ. На основании этих результатов сделано заключение, что гомологи UCP в печени и скелетных мышцах не участвуют в терморегуляторном разобщении дыхания при пробуждении животных из состояния гибернации, а также в разобщении, активируемом супероксидом. Также нами проведены измерения уровня экспрессии мРНК UCP2 в печени и UCP3 мышцах якутского суслика в различных сезонных состояниях.

выводы.

GDP' в условиях ингибирования ANT не оказывает заметного ресопрягающего действия на. разобщенное в присутствиижирных кислот дыхание митохондрий печени и скелетных мышц сусликов Spermophilus undulatus в различных физиологических состояниях, и в условиях воздействия на. митохондрии супероксида, которое могло бы, быть интерпретировано как функциональное проявление UCP2 и UCP3. Обнаружено, что аспартат/глутаматный переносчик, так же, как и" ANT, участвует в терморегуляторном разобщении в митохондриях печени просыпающихся сусликов.

Ресопрягающее действие GDP на митохондрии печени и мышц сусликов связано с конкурентным ингибированием ANT, как переносчика анионов жирных кислот, а не с присутствием в митохондриях печени и мышц белков UCP2 и UCP3.

В митохондриях печени и скелетных мышц сусликов отсутствует заметная проницаемость для ионов хлора, характерная для содержащих UCP1 митохондрий бурого жира, что свидетельствует о низком содержании либо полном отсутствии в этих тканях функционально-активных белков UCP2 и UCP3.

Обнаружено, что, cAtr в концентрации до 250 мкМ не влияет на проводимость для ионов хлора, обусловленную присутствием UCP1 в митохондриях БЖТ, что опровергает возможность ингибирования других разобщающих белков в присутствии сAtr.

Сорбционная хроматография на гидроксилапатите, в условиях, оптимизированных для выделения UCP1 из БЖТ,. и в условиях, когда UCP1 совыделяется с другими белками — анионными переносчиками внутренней мембраны митохондрийне позволяет обнаружить, UGP2 и — UCP3 в митохондриях печени и скелетных мышц суслика, чтосвидетельствует об их относительно низком содержании в митохондриях этих тканей. У якутских сусликов Spermophilus undulatus в период гибернации экспрессия мРНК UCP3 в мышцах увеличивается в три раза-по сравнению с летним периодом, а экспрессия мРНК UCP2 в мышечной ткани достоверно не изменяется и вероятно связана с присутствием в мышечной ткани примеси клеток иммунной системы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Несмотря на то, что более 10 лет прошло с момента открытия гомологов UCP, до сих пор нет единого мнения среди исследователей о функциях этих белков, более того, предметом споров является даже тот факт, что эти белки обладают физиологически значимой разобщающей активностью. Они изначально были описаны как разобщающие белки, поэтому в ранних исследованиях не уделяли внимания поиску альтернативных функций гомологов UCP1. Некоторые проводимые сейчас исследования выявляют недостатки и артефакты проводимых ранее экспериментов, например, на реконструированных системах (Azzu et al., 2008; Harper et al., 2002; Stuart et al., 2001), в работах, выполненных с использованием антител (см. Nedergaard, Cannon, 2003).

В представленной работе показано, что все свойства белков UCP2 и UCP3, описанные в литературе (ресопрягающее действие пуриновых нуклеотидов и активация супероксидом), исходя из которых обычно делаются выводы об их функциональной активности в препаратах митохондрий, могут быть полностью объяснены участием ANT в разобщении под действием жирных кислот. Полученные результаты позволяют заключить, что распространенные к настоящему моменту представления о механизмах функционирования UCP в клетке и их значении в организме животных, в частности, в процессах хладоадаптации, термогенеза, на примере зимней спячки млекопитающих, не подтверждаются, и могут быть ошибочными.

Для объяснения противоречия между разобщающей функцией, следующей из гомологии белков семейства UCP, и отсутствием достоверных данных о выявлении соответствующей активности в экспериментах на препаратах митохондрий может быть выдвинуто несколько предположений, не исключающих друг друга, которые частично уже нашли-" отражение в литературе. Возможно, эти белки выполняют иную, не связанную непосредственно с разобщением функцию. Например, участвуют в транспорте жирных кислот, или пирувата (Pecqueur et al., 2009).