Анализ иммунотронной активности полиоксидония и белковых препаратов крови в системе in vitro

Актуальность проблемы

Последние десятилетия характеризуются интенсивным поиском новых иммуномодулирующих средств, причем особый интерес исследователей вызывают химически синтезированные препараты.

В медицинской практике большое внимание уделяется новому химически синтезированному высокомолекулярному иммуномодулятору — полиоксидонию (ПО), который обладает широким спектром фармакологического действия (Петров Р.В., Кабанов В. А., 2002). ПО — оригинальный отечественный препарат, не имеющий аналогов в мире. Впервые синтезирован д.х.н. профессором А. В. Некрасовым и разработан в государственном научном центре Институте иммунологии МЗ РФ, Москва. ПО является одним из наиболее эффективных препаратов для стимуляции иммунной системы. Лечение многих хронических заболеваний становится более результативным при активации иммунитета больного с помощью ПО в комплексе с терапией основного заболевания. В настоящее время действие ПО in vivo является достаточно изученным, именно поэтому ПО широко применяется в клинической практике (Дьяконова В.А. и др., 2002; Дамбаева С. В. и др., 2000). Однако неисследованными остаются аспекты функционального взаимодействия ПО с белками крови, которые обладают специфической и параспецифической физиологической иммуномодулирующей активностью.

В связи с этим целью настоящей работы является изучение физиологического эффекта совместного воздействия иммуномодуляторов различного происхождения (химически синтезированного ПО и белковых препаратов крови человека) на клеточные реакции и факторы неспецифической резистентности в условиях in vitro.

В соответствии с целью определены следующие задачи:

1. Исследование действия синтетического иммуномодулятора ПО на иммунологические реакции и факторы неспецифической резистентности организма человека in vitro, а также определение границ физиологического и цитотоксического действия на выделенные клетки.

2. Изучение действия ПО на иммунологические показатели клеточных реакций и факторы неспецифической резистентности организма человека при ожоговой интоксикации.

3. Выяснение эффектов воздействия церулоплазмина (Ср), гамма-глобулина (IgG) и альбумина (Alb) на иммунологические реакции и показатели неспецифической резистентности in vitro.

4. Изучение совместного влияния препаратов различного происхождения (ПО и Ср, ПО и IgG, ПО и Alb) на функциональную активность лимфоцитов периферической крови человека и неспецифическую резистентность in vitro.

Новизна научных исследований

• Проведенные исследования позволили установить стимулирующее влияние ПО в системе in vitro на иммунокомпетентные клетки (ИКК), снижение уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), причем мелкодисперсных (повреждающих) — выявлена умеренная стимуляция системы комплементаустановлен дозозависимый антиоксидантный эффект ПО на процессы ПОЛ в сыворотке крови.

• Показано действие ПО in vitro на иммунологические реакции крови пациентов с термической травмой как модели воспалительной и интоксикационной патологии.

• Впервые получены данные о комплексном влиянии препаратов различного происхождения (эндогенных и химически чистых) на иммунологические реакции.

Практическая значимость выполненного исследования заключается в том, что получены дополнительные данные, обосновывающие применение ПО в качестве иммуномодулятора. Показана принципиальная возможность комплексного использования препаратов различного происхождения с целью повышения эффективности этиотропной терапии соответствующих заболеваний.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

• На выделенной из крови человека популяции лимфоцитов в экспериментах in vitro определены физиологически действующие, не повреждающие концентрации ПО и доказана его иммуномодулирующая активность.

• Выявлено иммуностимулирующее влияние ПО на кооперативное взаимодействие (ИКК), обеспечивающее реакции розеткообразования Т-лимфоцитов и адгезию мононуклеаров. Установлено активирующее влияние ПО на систему комплемента и снижение уровня мелкодисперсных ЦИК под действием ПО в условиях in vitro.

• Установлено, что стимулирующее воздействие ПО на иммунологические реакции и неспецифическую резистентность сохраняется при использовании с нативными иммуномодуляторами (Ср, IgG, Alb).

• В экспериментах in vitro доказана обоснованность применения ПО при ожоговой интоксикации в ряде случаев.

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ. Основные положения диссертации обсуждены на

• III сессии молодежной школы-семинара «Экологическая и промышленная безопасность» (Саров, 2003),

• 8-й Международной Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, 2004),

• Международной конференции молодых ученых «От фундаментальной науки — к новым технологиям.» (Тверь, 2002.),

• IX нижегородской сессии молодых ученых (Н. Новгород, 2004),

• XIII международной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005).

Структура и объем диссертации

.

Материалы диссертации изложены на 126 страницах машинописного текста, иллюстрированы 26 таблицами и 11 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 158 источников, из которых 30 на иностранных языках.

109 ВЫВОДЫ

1. В экспериментах in vitro на популяции лимфоцитов, выделенных из крови человека, установлено отсутствие повреждающего токсического эффекта ПОдоказана выраженная иммуномодулирующая активность ПО в изучаемой системе.

2. Выявлено стимулирующее влияние ПО на кооперативное взаимодействие иммунных клеток (в реакциях розеткообразования Т-лимфоцитов и адгезии мононуклеаров) и систему комплемента. Отмечено снижение уровня мелкодисперсных ЦИК под действием ПО.

3. В модельной системе in vitro на клетках крови пациентов с термической травмой показано стимулирующее действие ПО на клеточные реакции и неспецифическую резистентность. Выявлено дозозависимое влияние ПО на уровень циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке ожоговых больных.

4. Обнаружена зависимость влияния ПО на функциональную активность нейтрофилов в НСТ-тесте от используемой дозы препарата и тяжести состояния ожоговых больных. Фагоцитарно-бактерицидная способность нейтрофилов в отношении микробных клеток увеличивается независимо от используемой дозы ПО и площади ожога.

5. Обнаружено более эффективное совместное действие препаратов ПО с церулоплазмином, гамма-глобулином и альбумином на кооперативные свойства иммунокомпетентных клеток, чем действие отдельных препаратов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основной предпосылкой данной работы явилась недостаточная изученность клеточно-молекулярных механизмов действия ПО на функционирование клеточных и гуморальных факторов иммунитета. Анализ литературных данных свидетельствует о том, что действие ПО in vivo является достаточно исследованным, именно поэтому ПО широко применяется в клинической практике. Неизученным также остается эффект совместного воздействия ПО с другими препаратами на иммунологические реакции.

В связи с этим цель настоящей работы определена как изучение влияния препарата ПО на иммунологические реакции in vitro в норме и при патологии, а также исследование физиологического эффекта совместного воздействия иммуномодуляторов различного происхождения (химически синтезированного ПО и белковых препаратов) на клеточные реакции и факторы неспецифической резистентности в условиях in vitro.

Для достижения указанной цели было изучено действие препарата ПО отдельно и в комплексе с белками крови на некоторые показатели адаптивного иммунного ответа и факторы неспецифической резистентности.

Первым этапом настоящей работы явилось исследование влияния ПО на кооперативное взаимодействие иммунокомпетентных клеток крови человека, обеспечивающее реакции розеткообразования Т-лимфоцитов и адгезию мононуклеаров in vitro.

Изучение влияния ПО на экспрессию рецепторов контактного взаимодействия мононуклеарных клеток периферической крови человека in vitro был проведен нами с помощью теста спонтанного розеткообразования.

Используя тест спонтанного розеткообразования, мы провели исследование влияния ПО на количественное содержание как «активных», так и «общих» Е-розеткообразующих клеток (Е-РОК) доноров в условиях in vitro.

Изменение количества Е-розеткообразующих Т-лимфоцитов может служить показателем уменьшения либо увеличения уровня экспрессии CD2 антигена. Наряду с другими методами тест спонтанного розеткообразования может быть использован в качестве модели для оценки воздействия различных соединений на уровень экспрессии Т-лимфоцитами молекулы адгезии CD2 (Макарков А.И. и др., 1997). Показано, что во всех исследованных концентрациях ПО обладает эффективным стимулирующим действием на формирование как «активных», так и «общих» Е-РОК.

С целью выяснения механизмов нарастания розеткообразующей активности Т-лимфоцитов, были изучены адгезивные свойства иммунокомпетентных клеток. Данное исследование было проведено нами в условиях in vitro с помощью стандартизованной модельной системы, предусматривающей взаимодействие с синтетическим волокном популяции выделенных и отмытых от плазмы крови клеток. Синтетическое волокно применяли с целью моделирования физиологических процессов межклеточных взаимодействий во время иммунного ответа (Arnold L. et al., 1974).

Нами установлено стимулирующее действие ПО на адгезивную способность популяции мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови доноров во всех исследованных концентрациях препарата.

Сравнивая результаты, полученные с помощью тестов розеткообразования и адгезии, можно заключить, что изменения иммунологических показателей носили однонаправленный характер. То есть, по крайней мере, часть эффекта, состоящего в увеличении процента прилипающих к синтетическому волокну мононуклеарных клеток доноров под влиянием препарата ПО можно объяснить повышением экспрессии молекулы CD2, показателем которого служит увеличение количества Е-розеткообразующих лимфоцитов.

Следующим этапом работы явилось изучение влияния ПО на один из факторов неспецифической резистентности организма — систему комплемента. В диапазоне исследованных концентраций препарата не обнаружено дозозависимого эффектаактивность системы комплемента повысилась на 10−22% в сравнении с контролем, что, вероятно, может быть взаимосвязано со способностью заряженных групп макромолекулы ПО взаимодействовать с активным центром компонентов комплемента, стимулируя, таким образом, протекание следующих протеолитических процессов.

В дальнейшем было исследовано влияние ПО на реакции образования ЦИК. В результате экспериментов нами выявлено стабильное снижение уровня мелкодисперсных ЦИК под действием ПО во всех исследованных концентрациях. Возможно, это взаимосвязано со способностью полярных групп молекул ПО изменять комплексообразование ЦИК. Фактически это коррелирует с детоксицирующим эффектом ПО.

Наряду с иммуномодулирующим и детоксицирующим эффектом ПО в системе in vitro нами были исследованы антиоксидантные свойства с помощью метода оценки активности ПОЛ. В результате проведенных экспериментов установлено дозозависимое действие ПО на общую антиоксидантную активность и потенциальную способность системы к ПОЛ.

В то же время представляло интерес исследовать воздействие ПО на некоторые иммунологические реакции в условиях нарушенного иммунного статуса и эндоинтоксикации. Одним из ярких примеров патологии, сопровождающейся дисбалансом иммунных реакций, является ожоговая болезнь. Кроме того, при ожоговой болезни развивается ее характерный патогномичный синдром — эндоинтоксикация, отражающая тяжесть, остроту заболевания и определяющий различные висцеропатии

Турсунов Б.С. и др. 1992).

С помощью теста спонтанного розеткообразования нами было исследовано воздействие ПО на формирование «активных» и «общих» Е-РОК лимфоцитами периферической крови ожоговых больных, дающее возможность судить об изменении экспрессии молекулы адгезии CD2. Нами было выявлено стимулирующее действие ПО на розеткообразующие свойства Т-лимфоцитов крови пациентов с термической травмой, которое оказалось достоверно выше, чем у доноров.

Одним из этапов работы было исследовано влияние ПО на реакции образования ЦИК в сыворотке пациентов с термической травмой. Установлено дозозависимое действие ПО на уровень ЦИК в сыворотке ожоговых больных.

При исследовании влияния ПО на нейтрофилы периферической крови ожоговых больных обнаружено, что ПО не оказывает цитотоксического действия в изучаемой модельной системе. Установлено, что влияние ПО на функциональную активность нейтрофилов в НСТ-тесте зависит от используемой дозы препарата и тяжести состояния ожоговых больных. Функциональная активность нейтрофилов периферической крови пациентов с ожогом менее 30% поверхности тела под влиянием ПО в концентрации до 100 мкг/мл снижалась, а под действием концентрации 500 мкг/мл — повышалась. У пациентов с ожогом более 30% поверхности тела функциональная активность нейтрофилов периферической крови под действием всех исследуемых концентраций ПО достоверно повышалась. Показано, что под влиянием ПО фагоцитарно-бактерицидная способность нейтрофилов в отношении микробных клеток увеличивается независимо от используемой дозы препарата и площади ожога.

Одной из задач настоящего исследования явилось изучение эффектов совместного воздействия ПО с белками сыворотки крови на иммунологические реакции in vitro.

В результате проведённых экспериментов была обнаружена более выраженная стимуляция клеточных реакций (розеткообразования и адгезии) при совместном действии ПО и Ср по сравнению с отдельно взятыми препаратами.

Одним из этапов исследования ПО и Ср на иммунологические реакции было изучение их действия на мелкодисперсные и крупнодисперсные иммунные комплексы. Установлено, что отдельно взятые препараты ПО и Ср и при их совместном использовании однонаправлено влияют на уровень ИК: значительно снижают содержание мелкодисперсных ИК, уровень крупнодисперсных ЦИК снижается незначительно под действием всех исследованных концентраций. Это еще раз подчеркивает значение адаптационного эффекта действия исследованных препаратов, учитывая, что патофизиологическое влияние мелкои крупнодисперсных ЦИК различно.

Комплексное воздействие ПО с IgG и Alb на иммунные реакции характеризовалось суммирующим эффектом, учитывая, что ПО оказывает стимулирующего влияние на изучаемые реакции, a IgG и Alb, -сдерживающее. Мы предполагаем, что снижение стимулирующего эффекта ПО при совместном использовании с IgG происходит вследствие рецепторных взаимодействий молекул IgG с лимфоцитом, уменьшающих (стерически) свободную для контакта с молекулой ПО поверхность клетки. В случае с Alb, возможно, происходит адсорбирование ПО молекулами Alb, что приводит к снижению концентрации ПО, поскольку в условиях in vivo Alb обладает выраженной комплексирующей и адсорбционной функцией.

Обобщая результаты исследований, можно заключить, что в модельной системе in vitro получены новые данные по действию иммуномодулятора ПО на клетки иммунной системы и факторы неспецифической резистентности не только в норме, но и при патологии (ожоговая травма).

Принципиальное значение имеет исследование действия ПО совместно с белковыми препаратами сыворотки крови. Полученные данные раскрывают новые механизмы действия препаратов различного происхождения и имеют научно-практическое значение.