Участие фитохромов A и B в регуляции устьичных движений у Pisum sativum L

В связи с принципиальной важностью работы устьичного аппарата для обеспечения циркуляции воды по растению, оптимизации газообмена и поддержания высокого уровня фотосинтеза, замыкающие клетки устьиц представляют собой сложно регулируемую высокодифференцированную полуавтономную структуру. Движения замыкающих клеток устьиц контролируются множеством внешних факторов, несущих информацию об окружающей растение среде: интенсивности, длительности и спектральном составе света, водном потенциале воздуха и почвы, температуре, концентрации углекислого газа. Внутренние сигналы, информирующие о состоянии и потребностях растительного организма, также воспринимаются замыкающими клетками: это гормональные и другие сигнальные соединения, изменения концентрации Сахаров, углекислого газа и минеральных солей в апопласте, гидравлические сигналы, свидетельствующие об оводнённости окружающих тканей. Кроме того, работа устьичного аппарата контролируется молекулярными биологическими часами.

В регуляции устьичных движений участвует большинство известных фоторецепторов. Освещение фотосинтетически активной радиацией вызывает открывание устьиц, запуская фотосинтез как в замыкающих клетках, так и в прилежащих клетках мезофилла. Активация процесса фотосинтетической ассимиляции в мезофилле приводит к снижению концентрации углекислого газа в межклетниках листа, и устьица открываются в ответ на этот сигнал (Vavasseur, Raghavendra, 2005). В результате активации процесса фотосинтеза в самих замыкающих клетках в них образуются растворимые сахара и запасается энергия, необходимая для устьичных движений (Scarth, 1932; Schwartz, Zeiger, 1984). Импортируемые из мезофилла углеводы также могут принимать участие в повышении осмотического давления в замыкающих клетках, приводящего к открыванию устьиц в ответ на освещение (Ritte et al., 1999; Stadler et al., 2003). Кроме того, в регуляции работы устьичного аппарата показано участие дополнительных рецепторов синего света: фототропинов (Kinoshita et al., 2001) и криптохромов (Мао et al., 2005), обсуждается возможная роль зеаксантина (Talbott et al., 2003) и родопсин-подобных рецепторов (Paolicchi et al., 2005). Устьичные ответы на свет УФ-Б диапазона обеспечиваются специфическим рецептором УФ-Б, молекулярная природа которого пока неизвестна (Nogues et al., 1999; Eisinger et al., 2000).

При фототропин-зависимом открывании устьиц на синем свету происходит временное повышение концентрации Са2+ в цитозоле, задействуется ряд других посредников передачи сигнала, что приводит к активации Н±АТФаз плазмалеммы. В результате гиперполяризации плазмалеммы открываются вносящие К+|п-каналы, в замыкающие клетки входят ионы калия и вслед за ними по С17Н±антипортерам поступают ионы хлорида. Одновременно происходит деградация крахмала в хлоропластах замыкающих клеток с образованием малата или сахарозы. Накопление ионов калия, хлорида, малата и/или сахарозы приводят к осмотическому набуханию, изменению формы замыкающих клеток и открыванию устьица (Kinoshita et al., 2003; Shimazaki et al., 2007).

Вопрос об участии в регуляции устьичных движений дополнительных рецепторов красного света (КС) — фитохромов — до сих пор оставался достаточно спорным, несмотря на полученные рядом авторов косвенные свидетельства (Habermann, 1973; Roth-Bejerano, Itai, 1981; Eckert, Kaldenhoff, 2000; Talbott et al., 2003; Baroli et al., 2008). Ранее в нашей лаборатории при исследовании ответов на КС у бесхлорофильного мутанта гороха XL-18 было показано наличие К/ДК-обратимых транспирационных ответов низкоэнергетического (LFR) типа — что является прямым классическим доказательством участия фитохромов в исследуемом процессе (Sokolskaya et al., 2003). Обратимые ответы низкоэнергетического типа, как правило, обеспечиваются фитохромом В, однако в результате наших дальнейших исследований выяснилось, что фитохромный ответ замыкающих клеток имеет сложную природу и состоит, очевидно, более чем из одного компонента. Представленная работа посвящена исследованию участия комплексной фитохромной системы и роли её компонентов в регуляции устьичных движений.

Цель работы — исследование участия компонентов фитохромной системы в регуляции устьичных движений Pisum sativum L.: разделение ответов, вызываемых фитохромами, А и В, а также выяснение их роли в быстром ответе замыкающих клеток на свет и в формировании ритма устьичных движений.

Для её достижения были поставлены следующие задачи:

1. определить, какие типы фитохром-зависимых реакций (сверхнизкоэнергетический (VLFR), низкоэнергетический (LFR), высокоэнергетический (HIR)) имеются в замыкающих клетках устьиц;

2. разделить вклады фитохромов, А и В в регуляции устьичных движений, основываясь на выявленных типах фитохром-зависимых реакций и используя мутантов по фитохромам, А и В;

3. построить и проанализировать спектры действия устьичных движений на КС и ДКС с использованием бесхлорофильного мутанта гороха XL-18;

4. выявить роли обоих фитохромов в формировании ритма устьичных движений;

5. выявить возможные пути реализации фитохромного сигнала в замыкающих клетках устьиц.

выводы.

1. Показано, что в регуляции устьичных движений у гороха принимают участие оба имеющихся у него компонента фитохромной системы: фитохромы, А и В. Фитохром В вызывает открывание устьиц на красном свету и закрывание на дальнем красном (К/ДК-обратимый LFR тип ответа) — фитохром, А вызывает открывание устьиц в ответ как на красный, так и на дальний красный свет (ответ HIR типа).

2. Зависимые от фотолабильного фитохрома, А устьичные ответы усиливаются при увеличении длительности темновой адаптации, во время которой происходит ресинтез и накопление данного фоторецептора.

3. Получены спектры действия устьичных движений: открывания на КС — с характерным для фитохромных ответов максимумом 660−670 нми закрывания на ДКС — с характерным максимумом около 730 нм. При получении спектра действия закрывания, вероятно, не удалось полностью избавиться от вклада фитохрома, А и вызываемого им параллельного открывания устьиц.

4. Обнаружено, что при формировании ритма устьичных движений на естественном фотопериоде главным фоторецептором является фитохром А, фитохром В также необходим, но его роль более второстепенна.

5. Показано, что одним из механизмов реализации фитохромного сигнала при открывании устьиц на красном свету является гидролиз крахмала в пластидах замыкающих клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Исследование регуляции работы устьичного аппарата одним из важнейших сигналов окружающей среды — светом — насчитывает более 150 лет. Обнаруженный эффект открывания устьиц в ответ на белый свет интерпретировался сначала как результат процесса фотосинтеза. Первые спектры действия открывания устьиц с максимумами в синей и красной областях подтверждали эти предположения. Но затем более детальные исследования выявили участие в регуляции устьичных движений дополнительных рецепторов синего света — фототропинов и криптохромов. Наиболее спорный вопрос о роли рецепторов красного света — фитохромов — в данном процессе получает в последнее время всё больше подтверждений. Однако при этом, как правило, исследуется лишь наличие классического, К/ДК обратимого ответа низкоэнергетического (LFR) типа, вызываемого в большинстве случаев фитохромом В. В данной работе впервые представлены данные, свидетельствующие об участии в регуляции устьичных движений наряду с фотостабильным фитохромом В также и фотолабильного фитохрома А. Об участии фитохрома, А в этом процессе свидетельствует обнаруженный нами ответ на дальний красный свет (высокоэнергетический, FR-HIR), свойственный только фитохрому А, а также наличие ответа на красный свет у мутанта по фитохрому В.

Использование мутантов Pisum sativum L., дефицитных по хлорофиллу, фитохромам, А и В, а также отсутствие у гороха минорных фитохромов, как правило имеющихся у других видов растений, позволило разделить вклады этих трёх составляющих в комплексном устьичном ответе на свет красного и дальнего красного диапазонов. Из-за отсутствия мутантов, дефицитных одновременно по хлорофиллу и одному из фитохромов, фотосинтетическая составляющая у зелёных растений исключалась благодаря использованию длинноволнового или низкоинтенсивного света, неэффективного для фотосинтеза, но действующего для фитохромных ответов. Фотосинтетическая составляющая вызывает открывание устьиц в ответ на любой свет, поглощаемый хлорофиллом, обеспечивая замыкающие клетки необходимой для этого энергией и осмотиками. Суммирование данных о роли фитохромной системы позволяет сказать, что фитохром, А обеспечивает открывание устьиц на КС и на ДКС, а фитохром В — К/ДК обратимые ответы: открывание на КС и закрывание на ДКС. При этом зависимые от фотолабильного фитохрома, А устьичные ответы усиливаются при увеличении длительности темновой адаптации, во время которой происходит накопление белка данного фоторецептора.

Таким образом, в красной области спектра устьичные ответы, обусловленные обоими фитохромами, сонаправлены. Полученный спектр действия устьичных движений на КС у бесхлорофильного мутанта гороха XL-18 имеет характерный для фитохромных ответов низкоэнергетического типа максимум 660−670 нм. Ответы на ДКС, обусловленные фитохромами, А и В, направлены противоположно, причём соотношение вкладов двух фоторецепторов зависит от длины волны и интенсивности действующего света, а также от длительности темновой адаптации, что даёт сложные дозовые зависимости устьичных ответов, наблюдаемые при действии ДКС.

Преобразование фитохромного сигнала в осмотический механизм устьичных движений нуждается в подробном изучении. Из приведённых данных следует, что одним из механизмов реализации фитохромного сигнала является процесс гидролиза крахмала в пластидах замыкающих клеток. Образующиеся при этом растворимые сахара и/или малат могут использоваться в качестве осмотиков и/или субстратов для активизирующегося дыхания при открывании устьиц. Этот механизм не требует наличия фотосинтетического аппарата в замыкающих клетках, так как наблюдается как у растений гороха дикого типа, так и у бесхлорофильного мутанта XL-18.

С помощью фитохромных мутантов выявлены роли обоих фитохромов гороха в регуляции ритма устьичных движений в течение светового дня. Показано, что при формировании ритма устьичных движений на естественном фотопериоде главную роль играет фитохром А, обеспечивая основные компоненты ритма: утреннее и вечернее открывания и дневное призакрывание. Фитохром В играет более минорную роль — из всех компонентов ритма обеспечивает только вечернее закрывание.

При микроскопических исследованиях эпидермальных срывов обнаружены значительные аномалии в развитии этой ткани у мутанта phyb-5. Увеличенные размеры и искажённые, раздутые формы покровных клеток, а также нарушения нормального развития замыкающих клеток: их формы, размеров и расположения на листе, — по крайней мере отчасти связаны с известной повышенной продукцией этилена у этого мутанта. Подобные нарушения роста клеток характерны для действия этилена, но наблюдались ранее в основном в тканях стебля. Таким образом, нами показана важная роль фитохрома В в контроле развития эпидермальной ткани листа: как основных эпидермальных, так и замыкающих клеток. Фитохром В в данном процессе, вероятнее всего, действует через регуляцию гормонального баланса, однако для выявления точного механизма его участия необходимы дальнейшие исследования. •.

Таким образом, в работе доказана двухкомпонентная природа фитохромной регуляции устьичных движений, выявлены и разделены роли обоих имеющихся у гороха фитохромов как в быстром ответе на свет, так и в формировании ритма движений замыкающих клеток в течение светового периода.