Антиген-индуцированные реакции иммунной системы при формировании памяти в норме и при иммунопатологических состояниях

Известно, что иммунный ответ обычно развивается с преобладанием либо клеточных, либо гуморальных реакций [Parish С. R., 1996; Kalia V. et al 2009]. Считается, что соотношение между выраженностью клеточного и гуморального звена иммунного ответа базируется на преимущественной активации Т-хелперных клеток 1-го или 2-го типов [Cher DJ. et Mosmann T.R., 1987; Allen J.E. et Maizels R.M., 1997; Gor D. et al., 2003]. Развитие ответа на конкретный антиген, тип иммунного реагирования, его динамика и выраженность определяется как «географией» антигена [Zinkernagel R. M et al., 1997], то есть путем поступления, дозой, продолжительностью персистирования и локализацией антигена в организме, так и особенностями самого организма, включая его текущее состояние [Gonzalez S.F. et al 2010; Pereira J.P.et al, 2010].

Развитие иммунного ответа не заканчивается образованием Т-эффекторов или синтезом антител, но и вызывает формирование иммунной памяти [Vitetta.

E.S. et al, 1991; Batista F.D.et al, 2009; Obar J.J.et Lefrancois L., 2010; Marelli-Berg.

F.M. 2010], характер которой зачастую трудно связать с особенностями иммунного ответа на первое введение антигена. Ещё меньше известно о взаимосвязи клеточных и гуморальных реакций при вторичной встрече с антигеном [Gusev E.Yu. et al, 1994]. Наблюдаемые при вторичном ответе реакции, как правило, не удается предсказать, исходя из предполагаемых в соответствии с известными закономерностями событий. Так, например, установлено [Swain S.L. et al., 2006], что выраженный гуморальный вторичный ответ часто наблюдается при первичной иммунизации низкими дозами антигена, а увеличение дозы приводит к парадоксальному снижению анамнестической реакции. Несмотря на огромные успехи в понимании тонких молекулярно-генетических механизмов регуляции синтеза антител и переключения классов и подклассов иммуноглобулинов в процессе развития гуморального ответа [Ada G.L. et Blanden R.V.1994; Dooms H. et Abbas A., 2006; Fearon D. T et al, 2006], выделении и характеристике многочисленных отдельных субпопуляций клеток памяти среди основных участников специфического иммунного ответа (Т-лимфоцитов: CD8±, CD4± и Влимфоцитов) [Ада Г., Рамсей А. 2002; Lefrancois L., 2006; Caiame К., 2006, Jameson S.C. et Masopust D., 2009], их роль и закономерности регуляции, а также взаимоотношения первичного и вторичного гуморального иммунного ответа и баланс клеточного и гуморального звеньев при вторичном ответе на уровне целостного организма в настоящее время ещё далеки от разрешения [Ahmed R. et Rouse В.Т., 2006, Blanchard-Rohner G. et al, 2009].

Представляется вероятным, что формирование иммунной памяти при различных иммунопатологических состояниях отличается от этих процессов в норме. Известно, что индукция хронической РТПХ приводит к развитию аутоиммунной патологии, которая по клиническим и патоморфологическим признакам аналогична СКВ человека [Via С. S. et al. 1988, Kuzmina Z. et al, 2011]. Поэтому в данной работе в качестве модели аутоиммунной патологии была использована модель развития иммунокомплексного гломерулонефрита при индукции хронической реакции трансплантат против хозяина (РТПХ). Обнаруженная при этом супрессия первичного гуморального ответа [Козлов В.А. и др., 2002], делает актуальным выявление особенностей формирования иммунной памяти при указанной патологии.

Понимание механизмов формирования иммунной памяти необходимо для успешной вакцинопрофилактики [Plotkin S.А., 2010], особенно учитывая случаи неудачной вакцинации отдельных индивидуумов, небольшую эффективность вакцин для создания клеточного анамнестического ответа, а также возникновение в последнее время новых, не встречаемых ранее инфекционных заболеваний. Кроме того, заболевания, в патогенезе которых лежат нарушения нормального функционирования иммунной системы (болезни с аутоиммунным компонентом, аллергии), по-видимому, развиваются по законам анамнестического иммунного ответа.

Целью данной работы является изучение клеточных и гуморальных реакций при антиген-индуцированных воздействиях и выявление регуляторных механизмов иммунных реакций, участвующих в процессе формирования иммунной памяти в норме и при патологии.

В работе планируется решение следующих задач:

1. Изучить сопряжённую динамику первичного и вторичного клеточного и гуморального иммунного ответа у мышей на разные дозы антигена.

2. Изучить влияние повторного введения антигена в ранние сроки формирования первичного иммунного ответа на выраженность первичного и вторичного ответа.

3. Исследовать связь пролиферативной активности антителопродуцентов с интенсивностью вторичного иммунного ответа.

4. Изучить формирование иммунной памяти при хронической РТПХ как модели преимущественно ТЫили ТЬ2-зависимых иммунопатологических состояний.

5. Оценить уровень ТЫИ-а и^Е в процессе формирования иммунной памяти в норме и при иммунопатологических состояниях, индуцированных хронической РТПХ.

6. Изучить возможную роль Т№-связывающего белка, препаратов регулирующих синтез N0 в организме и рекомбинантного И-1Р в регуляции гуморального ответа и формирования иммунной памяти.

Научная новизна:

Получены новые данные о закономерностях формирования иммунной памяти в норме и при иммунопатологических состояниях.

Показано снижение вторичного иммунного ответа, вызванное предшествующей гиперстимуляцией первичного^Ми ^в-ответа на фоне повторного введения антигена в позднюю лог-фазу первичного^{М-гуморального} ответа. Этот эффект дозозависим и наблюдается только при первичной иммунизации субоптимальной дозой этого же антигена.

Выявлено, что введение ингибитора синтеза ДНК ослабляет подъём количества^{М-антителопродуцентов,} но не влияет на выраженность первичного и вторичного ^С-ответа.

Получены данные об участии Т№а в регуляции физиологического баланса процессов дифференцировки В-лимфоцитов в антителопродуценты и клетки памяти, проявляющемся в основном в момент активного образования ^М-антителопродуцентов.

Обнаружена сопряженность между уровнем И-113 и выраженностью гуморального ответа: повышенное содержание этой формы цитокина в момент иммунизации (Осутки), достоверно снижает первичный и стимулирует вторичный^{С-гуморальный} ответ, что свидетельствует об участии 11−1 в регуляции В-клеточной дифференцировки в индуктивную фазу гуморального ответа.

Установлено, несмотря на глубокую депрессию первичного ответа при аутоиммунных процессах, индуцированных хронической РТПХ, вторичный ответ у таких мышей более сохранен: причем /ирш'-реципиенты способны к формированию иммунной памяти, тогда как поп1ирш-реципиенты отвечают на повторное введение антигена сдвигом в сторону клеточно-опосредованных реакций.

Теоретическая и практическая значимость: Полученные данные позволяют направленно изменять высоту иммунного ответа и баланс между клеточными и гуморальными реакциями при формировании иммунной памяти. Выявленные закономерности первичного и вторичного ответа расширяют имеющиеся представления о регуляции иммунного ответа. Экспериментально подтвержденный стимулирующий эффект дополнительного введения антигена обосновывает создание новых схем вакцинаций: выбор оптимальных доз и способов введения антигенов. К тому же станет возможным, учитывая результаты исследования, внести существенные положительные коррективы в технологический процесс получения специфических антител. Полученные результаты можно учитывать при разработке новых подходов к регуляции иммунных реакций при некоторых формах аутоиммунных заболеваний и аллергических состояний.

Положения, выносимые на защиту:

1. Антиген является фактором, модулирующим иммунный ответ: при его дополнительном введении отмечается усиление первичного и подавление вторичного ответа.

2. Формирование иммунной памяти к чужеродному антигену протекает независимо от аутоиммунных процессов, индуцированных хронической РТПХ.

3. Уровень первичной реакции на антиген не является предопределяющим для формирования иммунной памяти благодаря существованию дискордантных взаимоотношений между развитием первичного и вторичного иммунного ответа.

Личный вклад автора в проведении исследования. Все представленные результаты экспериментальных исследований получены лично автором, либо при его непосредственном участии.

Апробация работы: Результаты диссертационной работы были представлены на Международной конференции «Фундаментальная наука — медицине» (г. Новосибирск, 2007 г.) и на конференции «Дни иммунологии в Сибири-2007» (г. Омск), а также доложены на Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и патологии» (г.Новосибирск, 2010 г.), на международной конференции «Дни иммунологии в Сибири-2011» (г.Абакан) и на 8-й отчетной конференции НИИ КИ СО РАМН (г. Новосибирск, 2011).

Публикации: По теме диссертационной работы опубликовано 20 работ, в том числе 7 статей в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура работы: Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования в 5 главах, их обсуждения и выводов. Материалы диссертации изложены на 121 страницах машинописного текста, результаты собственных исследований содержат 27 рисунков и 6 таблиц.

Список литературы

включает 197 источников, из них 18 на русском языке.

ВЫВОДЫ:

1. Повторное введение антигена в позднюю лог-фазу первичного ответа приводит к резкому увеличению количества как^М-, так и антителопродуцентов на пике первичного ответа и в тоже время снижает уровень вторичного^{О-ответа,} что свидетельствует о модулирующем действии антигена. Эффект на первичный ответ дозозависим и наблюдается только при субоптимальной иммунизации мышей.

2. При введении антигена в позднюю лог-фазу первичного ответа как подкожно (под апоневроз), так и при внутривенном введении наблюдается подавление анамнестического ответа. Это указывает на то, что фактором, супресси-рующим формирование иммунной памяти, являются системные реакции, вызванные дополнительным введением антигена, а не локально развивающееся воспаление в месте его поступления в организм.

3.

Введение

гидроксимочевины — ингибитора синтеза ДНК — одновременно с дополнительным введением антигена во время лог-фазы первичного^{М-ответа} снижает подъём^М-АОК, но не отменяет стимуляцию образования количества первичных и вторичных^в-АОК, что указывает на важную роль в стимуляции^{М-ответа,} вызванной повторным введением антигена, пролиферативных процессов.

4. При стимуляции ответа наблюдается подъём уровня ТЫРа, пик которого приходится на период активного образования^{М-антителопродуцентов.} Связывание ТКРа, введением ТМР-связывающего белка вируса натуральной оспы в момент дополнительного поступления антигена, подавляет стимуляцию первичного и отменяет подавление вторичного ответа, что позволяет говорить о важной роли ТМРа в дифференцировке В-лимфоцитов в антителопродуценты и клетки памяти.

5.

Введение

11−1(3 в момент иммунизации, но не в позднюю лог-фазу развивающегося^{М-ответа,} достоверно снижает первичный и стимулирует вторичный^{в-гуморальный} ответ, что свидетельствует об участии II-1 (3 в регуляции гуморальных иммунных реакций в индуктивную фазу первичного ответа на антиген.

6. Глубокая депрессия первичного ответа в экспериментальных моделях, индуцированных хронической РТПХ, не сопровождается подавлением в такой же степени анамнестической реакции. Эффект проявляется более выражено у /и/шя-реципиентов при первичной иммунизации оптимальной дозой антигена. Это свидетельствует о более жёстко закреплённых процессах формирования иммунной памяти, устойчивых к действию факторов, регулирующих высоту первичного ответа, у мышей при развитии аутоиммунных патологических состояний.

7. Дискордантные изменения первичного гуморального ответа на Т-зависимый антиген и последующей анамнестической реакции, наблюдаемые при физиологических и иммунопатологических состояниях, в частности, при дополнительном поступлении этого же антигена в организм или действии других регулирующих факторов, таких как ТИБа и 11−1(3, свидетельствуют о том, что уровень первичной реакции на антиген не является предопределяющим для формирования иммунной памяти.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

I.

Подводя итог проделанной работы, можно говорить о том, что дополнительное введение антигена в конце лог-фазы первичного^{М-ответа} дает эффект гиперстимуляции как на^М-, так и на первичный^{в-гуморальный} ответ, и приводит к последующей супрессии анамнестической реакции у мышей разного генотипа. Торможение процессов пролиферации на фоне стимуляции первичного ответа (введение гидроксимочевины одновременно с введением антигена во время лог-фазы первичного ^М-ответа) снижает подъём^М-АОК, но не отменяет стимуляцию образования^в-АОК, что предполагает участие в последнем случае клеток, не входящих в пул активно пролифери-рующих в этот период антителопродуцентов. Элиминация пролиферирующей активности гидроксимочевиной не оказывает влияния на вторичный гуморальный ответ, что вероятно говорит о значимой, но не определяющей роли активноделящихся в конце лог-фазы В-клеток на формирование иммунной памяти. Скорее всего, стимуляция пролиферативных процессов В-лимфоцитов, дифференцирующихся в антителопродуценты существенно сокращает пул клеток памяти и, как следствие, супрессирует вторичный иммунный ответ.

Резкая стимуляция образования антителопродуцентов дополнительным поступлением антигена в конце лог-фазы первичного^{М-ответа} может вызывать дополнительную секрецию цитокинов, которые играют ключевую роль в регуляции иммунного ответа.

Полученные результаты свидетельствуют об участии ТЫРа в регуляции физиологического баланса процессов дифференцировки В-лимфоцитов в антителопродуценты и клетки памяти, проявляющемся в основном в момент активного образования^{М-антителопродуцентов.} Видимо, резкая гиперстимуляция ответа обусловлена взаимосвязанными процессами активации В-клеток и продукции ими Т№а, которые начинают поддерживать друг друга по принципу положительной обратной связи, что может приводить к избыточному образованию антителопродуцентов при первичном ответе в ущерб формированию клеток памяти и, как следствие, к снижению выраженности анамнестической реакции.

Одним из цитокинов, сдвигающих баланс Thl/Th2 в сторону Th2, а это в свою очередь вызывает и поддерживает активную пролиферацию В-клеток и продукцию антител и таким образом способствует защитному гуморальному иммунному ответу, является 11−1. В нашей работе, подтверждено его влияние, но только при его введении в момент иммунизации, а не в позднюю лог-фазу IgM-ответа, что согласуется с литературными данными действия 11−1 на В-клетки в первые двое суток. Причем эти, казалось бы, однонаправленные ци-токины, проявляют в наших экспериментах различный эффект: введение 11−1(3 стимулирует, a TNFa подавляет анамнестический ответ. Возможно, это связано с временными рамками действия цитокинов и изменением пролифератив-ных процессов в разные фазы ответа: один изменяет выраженность IgG-ответа, другой — силу IgM-ответа.

Сопоставление величины специфического IgMи IgG-ответа с уровнем общего IgE в наших опытах не обнаруживает тесной корреляции между этими параметрами. Перенося закономерности изменения содержания IgE на продукцию 11−4, можно высказать предположение, что хотя 11−4 и необходим для осуществления гуморального иммунного ответа, видимо его влияние не является критичным как при первичном ответе, так и при формировании иммунной памяти. По-видимому, его количество в норме находится на достаточно высоком уровне и не лимитирует активацию и пролиферацию антигенспеци-фических В-лимфоцитов.

Несмотря на важную сигнальную роль оксида азота в позитивной и негативной регуляции иммунного ответа и воспалении, в наших экспериментах in vivo не было выявлено четкой закономерности изменения первичного и вторичного ответа при добавлении препаратов регулирующих синтез N0 в организме.

Мыши при патологических состояниях показывает другие закономерности ответа на Т-зависимый антиген. Так у мышей с хронической РТПХ на фоне угнетенного первичного^{С-ответа,} вторичный ответ демонстрирует большую сохранность. Угнетение гуморального ответа может быть вызвано текущей гиперактивацией В-лимфоцитов, которая коррелирует с развитием аутоиммунной патологии, тогда как в наших опытах иммунодепрессия была существенней у яоп/ири.у-реципиентов. Повидимому, в данном случае играет роль также баланс ТЬ1/ТЬ2-клеток, который смещён у пои/ирия-реципиентов в сторону ТЫ-клеток, что не способствует образованию антителопродуцентов, а направляет развитие ответа в сторону клеточно-опосредованных реакций. Глубокая депрессия первичного ответа не сопровождается подавлением в такой же степени вторичного иммунного ответа у /и/?и?-реципиентов. Возможно, это свидетельствует о более жёстко закреплённых процессах формирования иммунной памяти, устойчивых к действию факторов, регулирующих высоту первичного ответа. Выяснение причин дискорданса между уровнем первичного и вторичного ответа при хронической РТПХ требует дальнейшего исследования.

Несмотря на то, что характер формирования иммунной памяти трудно связать с особенностями иммунного ответа на первое введение антигена, в данном исследовании показана обратная зависимость между уровнями первичного и вторичного ответа на антиген, которая демонстрирует закономерности, благодаря которым можно прогнозировать интенсивность анамнестической реакции, зная величину первичного^М и^{в-ответа,} а это в свою очередь способствует разработке схем введения антигена и созданию наиболее эффективных вакцин.