Генетические и антигенные варианты ротавируса человека, циркулирующие на Европейской территории России

Актуальность проблемы. Дегидратирующие диарейные заболевания детей младшего возраста, этиологически обусловленные рота-вирусами, являются важной проблемой здравоохранения во всем мире. Широкая распространенность, значительный удельный вес в структуре небактериальных гастроэнтеритов, высокий процент случаев, требующих госпитализации, возможность летальных исходов и вариабельность сегментированного генома возбудителя определили сформулированную Всемирной Организацией Здравоохранения приоритетность развития исследований, направленных на всестороннее изучение генетического и антигенного разнообразия ротавирусов и особенностей их циркуляции в различных географических регионах мира, конечной целью которых является разработка эффективной вакцины против ротавирусных гастроэнтеритов [73,364,424].

На территории Российской Федерации заболеваемость ротави-русным гастроэнтеритом среди детей сопоставима с заболеваемостью сальмонеллезом и дизентерией, занимает до 9,2% структуры ОКИ и определяет 30% и более случаев ОКИНЭ [13,40,76,77]. Всесторонне и детально изучены клинические проявления ротави-русного гастроэнтерита и эпидемиологические особенности ротави-русной инфекции [13,20,21,40,52,58,52]. Однако, исследования, направленные на изучение молекулярной природы циркулирующих на территории нашей страны природных штаммов ротавируса носят эпизодический характер. С использованием электрофоретипирования РНК охарактеризованы изоляты ротавируса группы А, собранные в Москве, Санкт-Петербурге, Кемеровской области [13,15,17,98]. Сведения о распространенности ротавирусов антигенной группы С отсутствуют. Остается открытым вопрос о существовании связи между клиническими проявлениями инфекции и генетическими или антигенными характеристиками вируса. Наблюдения за особенностями многолетней циркуляции штаммов ротавируса и смены их доминирования носят единичный характер не только в России, но и в мире, и не раскрывают закономерностей циркуляции ротавирусов разных антигенных типов [17,122,130,139].

Определение доминирующих антигенных вариантов ротавируса и изучение их распространенности и относительного распределения на территориях различных стран показало существование как общих, повсеместно циркулирующих типов вируса, так и характерных для отдельных регионов земного шара [115,122,130,139,151,152]. Недостаточная изученность этого вопроса в нашей стране и отсутствие коммерческих тест-систем для определения антигенной специфичности ротавирусов выдвигает задачу унификации и разработки альтернативных молекулярно-генетических методов их дифференциации и делает актуальным проведение исследований по характеристике природных штаммов ротавируса человека, циркулирующих на территориях Российской Федерации.

Цель работы: Совершенствование методов РНК-дифференциации ротавирусов и комплексная молекулярно-генетическая и медико-биологическая характеристика природных штаммов ротавируса человека, распространенных на европейской территории Российской Федерации .

Задачи исследования:

1. Оптимизировать метод электрофретипирования РНК ротавирусов .

2. Изучить многообразие электрофоретипов РНК ротавирусов человека, определить доминирующие на территории европейской части России генетические варианты.

3. Синтезировать кДНК генов УР6 и УР7 эпидемически значимых генетических вариантов ротавируса и на основе анализа полных нуклеотидных последовательностей определить их подгрупповую и серотиповую принадлежность.

4. Сконструировать ДНК-зонды для выявления и дифференциации антигенных вариантов ротавируса группы, А методом молекулярной гибридизации.

5. Провести дифференциацию природных штаммов ротавируса с использованием подгрупповых и серотиповых ДНК-зондов, изучить взаимосвязь электрофоретипа и гибридизационных свойств РНК, определить доминирующие антигенные типы вируса и оценить их относительное распределение.

6. Изучить особенности смены доминирования генетических и антигенных вариантов ротавируса на основе анализа их многолетней циркуляции.

7. Охарактеризовать клинические проявления гастроэнтерита, вызванного различными генетическими и антигенными вариантами ротавируса.

8. Изучить распространенность на европейской территории России ротавирусов антигенной группы С и дать характеристику вызываемого ими гастроэнтерита.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Предложен упрощенный способ выделения и очистки РНК ротавирусов непосредственно из копроматериала больных РВГЭ (Авт. свид. СССР N 1 448 448, приоритет от 24.02.1987 г.), используемый при диагностике РВГЭ методом электрофореза РНК и для очистки.

РНК ротавирусов с целью ее последующего клонирования.

Впервые, по результатам широких исследований, разработана классификационная схема электрофоретипов РНК ротавируса человека, отражающая многообразие генетических вариантов, циркулирующих на территории европейской части Российской Федерации.

Впервые в России сконструированы: 1. Универсальный ДНК-зонд для выявления ротавирусов группы, А с различными электрофорети-пами РНК (Авт.свид. СССР N 174 411, приоритет от 26.12.1989 г.) — 2. ДНК-зонды для специфического выявления ротавирусов группы, А Sil и SI подгрупп (Патент РФ N 2 031 949, приоритет от 11.12.1991 г. и патент РФ N 2 064 502, приоритет от 01.09 92 г., соответственно) — 3. ДНК-зонды для выявления последовательностей, определяющих Gl, G3 и G4 серотипы ротавируса. Создание ДНК-зондов для выявления и дифференциации РНК ротавирусов может способствовать расширению методической базы эпиднадзора за ро-тавирусной инфекцией и проведению более углубленных научных исследований в области молекулярной эпидемиологии РВГЭ.

Впервые, на основе молекулярно-генетического изучения, охарактеризованы циркулирующие на 14-ти европейских территориях России генетические варианты ротавируса. Показана принципиальная возможность формирования эпидемически значимого, общего для европейской территории России, генетического варианта ротавируса, характеризующегося генетической стабильностью, широкой распространенностью, длительной циркуляцией, определяющего более интенсивный симптомокомплекс РВГЭ и наиболее часто вызывающего тяжелое течение заболевания.

По материалам выявления аллелей генов, кодирующих подгрупповые и серотиповые антигены, впервые охарактеризованы доминирующие на европейской территории России антигенные варианты ротавируса, относительное распределение которых, свидетельствующее о предоминировании 311С1, второй значимости 31С2 и третьей доле 31 104 антигенных типов, соответствует установленному для ряда территорий западной Европы.

Обнаружен вариант ротавируса группы А, выделенный от новорожденного с бессимптомной формой инфекции, имеющий уникальную последовательность гена МР7, отличающуюся от описанных в литературе 14-ти С-серотипов ротавируса и генетически родственный ротавирусу свиней.

Впервые в Российской Федерации проведено тринадцатилетнее наблюдение за циркуляцией ротавирусов группы, А с различными электрофоретипами РНК в условиях крупного промышленного города (Н.Новгород). Установлено существование внутрисезонной смены доминирования электрофоретипа РНК ротавируса, связанной с биологическими свойствами конкретного генетического варианта возбудителя, отражающими степень его вирулентности. Показано, что межсезонная смена доминирующего антигенного варианта ротавируса, происходящая раз в 4−5 эпидемических лет, сопровождается ростом заболеваемости РВГЭ. Определены удельный вес, продолжительность периодов и длительность циклов доминирования ротавирусов С1−4 серотипов, что имеет важное значение для практической медицины в плане качественного прогнозирования тенденций роста заболеваемости РВГЭ и разработки стратегии вакцинопрофи-лактики ротавирусной инфекции.

При анализе случаев «чистых» РВГЭ, вызванных 10-ю доминирующими генетическими вариантами ротавируса четырех С-серотипов, получены новые данные о взаимосвязи выраженности основных клинических симптомов, тяжести течения заболевания и синдромов ее определяющих, и генетическими и антигенными характеристиками ротавируса.

Впервые показаны особенности циркуляции на территорииях городов европейской части России атипичных ротавирусов группы С. На фоне низкой выявляемости природных штаммов этой антигенной группы вируса установлен регион их более интенсивной циркуляции — Архангельская область, что имеет принципиальное значение для выбора адекватных средств диагностики РВГЭ в этом регионе.

Внедрение результатов исследования в практику.

Разработаны, утверждены на региональном и республиканском уровнях, опубликованы и внедрены в практику здравоохранения следующие информационно-методические материалы:

1. Информационное письмо «Электрофоретипы РНК ротавирусов человека и их классификационная схема «. Горький, 1990 г. (Утверждено 15.05.90 г. Главным эпидемиологом Управления здравоохранения Горьковской обл. Т.М.Казанской). Используется в качестве методического пособия в работе научно-практического семинара «Новые подходы к диагностике инфекционных заболеваний и способы типирования их возбудителей», включенного в план работы ГК СЭН РФ. Проведено обучение методу электрофоретипирования ротавирусов 26-ти представителей 9-ти центров ГСЭН РФ.

2. Методические рекомендации «Детекция ротавирусов человека с использованием электрофоретического анализа нуклеиновых кислот (ЭФАНК)». Н. Новгород, 1994. (Утверждены 30.12.94 г. Заместителем председателя Госкомсанэпидназора России Г. Г.Они-щенко).

3. Методические рекомендации «Выявление и дифференциация ротавирусов человека с использованием ДНК-зондов», Н. Новгород, 1994 г. (Утверждены 30.12.94 г. Заместителем председателя Гос-комсанэпидназора России Г. Г.Онищенко).

Разработки, защищенные авторскими свидетельствами использовались при проведении НИР, при выявлении ротавирусов в пробах стула больных ОКИНЭ с целью лабораторного подтверждения клинического диагноза РВГЭ и определения стратегии лечения больного. В процессе работы расшифрована этиологическая природа 29,0% случаев ОКИНЭ, охарактеризован этиологический агент ряда вспышек ротавирусной инфекции. Результаты выявления ротавирусов у больных ОКИНЭ сообщались в центры СЭН Российской Федерации, где использовались для определения квоты ротавирусных гастроэнтеритов в структуре инфекционной заболеваемости.

Научные положения, следующие из работы, и методические приемы дифференциации ротавирусов используются в учебном процессе студентов кафедры молекулярной биологии биологического факультета Нижегородского государственного университета им. Н. И. Лобачевского .

Использование результатов работы в научных исследованиях, эпидемиологической, клинической и учебной практиках подтверждены актами внедрения РИАЦ ГК СЭН РФ, Нижегородского НИИЭМ МЗ РФ, НИИЭМ им. Габричевского МЗ РФ, Нижегородского областного ГЦ СЭН, Нижегородского городского ГЦ СЭН, детской инфекционной больницы N 8 г. Н.Новгорода, детской инфекционной больницы N 23 г. Н.Новгорода, детской инфекционной больницы N 11 г. Дзержинска и Нижегородского государственного университета им. Н. И. Лобачевского.

Положения, выносимые на защиту:

1.Создана методическая база для выявления и РНК-дифференциации ротавирусов, включающая унифицированный метод электрофоре-типирования штаммов и метод молекулярной гибридизации с использованием сконструированных ДНК-зондов.

2.На фоне многообразия электрофоретипов РНК природных штаммов ротавируса человека формируются доминирующие генетически стабильные эпидемические варианты, характеризующиеся широкой распространенностью, длительной циркуляцией и относительно высокой вирулентностью.

3.Территория европейской части Российской Федерации характеризуется преимущественной циркуляцией разнообразных гентичес-ких вариантов ротавируса группы, А с предоминированием 311С1 антигенного типа, и низкой частотой выявления параротавирусов.

4.Особенностями многолетней циркуляции природных штаммов ротавируса С1−4 серотипов являются её форма, доля вариантов, длительность периодов и продолжительность циклов доминирования, существование внутрисезонной смены превалирующего генетического варианта и периодической межсезонной смены доминирующего антигенного типа вируса.

5.Выраженность основных клинических симптомов РВГЭ, частота возникновения тяжелой формы заболевания и интенсивность реакции со стороны респираторного тракта могут быть связаны с генетическими и антигенными характеристиками вируса, вызвавшего заболевание .

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены: на научно-практической конференции по эпидемиологии, диагностике и профилактике вирусных инфекций (Свердловск, 1985) — V Всероссийском съезде микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Краснодар,.

1985) — научной конференции «Биология возбудителей инфекционных заболеваний и их экспресс-диагностика (Горький, 1986) — научно-практической конференции по актуальным вопросам эпидемиологии, диагностики и профилактики вирусных инфекций совместно с рабочим совещанием научно-производственного совета по республиканской программе «Вирусология и вирусные заболевания (Свердловск, 1987) — XVII съезде Всесоюзного общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И. И. Мечникова (Алма-Ата, 1989) — международном симпозиуме «Синтетические олигонуклеоти-ды: проблемы и границы практического применения (Москва, 1991) — научной конференции, посвященной памяти М. П. Чумакова (Москва, 1994) — проблемной комиссии по микробиологии Госкомсанэпид-надзора России и научного совета по микробиологии РАМН «Современные проблемы таксономии и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний» (Нижний Новгород, 1996). Материалы диссертации неоднократно обсуждались на заседаниях Ученого Совета Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ РФ, проблемных научно-практических семинарах института, заседаниях Нижегородских отделений Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов и Всероссийского биохимического общества.

По теме диссертации опубликована 31 печатная работа.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Ротавирусный гастроэнтерит.

Ротавирусы, названные так за особенности структурной организации вириона (rota — колесо) и первоначально обозначаемые в разных исследованиях как орбивирусы, дуовирусы, ротавирусы, реовирус-подобные агенты или вирусы детского гастроэнтерита, в отдельный род Rotavirus были выделены на IV Международном конгрессе вирусологов в 1978 г. и отнесены к семейству Reoviridae [198,394].

Систематическое изучение ротавирусов человека началось с 1973 г., когда австралийская исследовательница Bishop R.F. с соавторами сообщила об обнаружении вирусных частиц, сходных с вирусом эпизоотической диареи мышат (EDIM), в ультратонких срезах биоптатов двенадцатиперстной кишки б-ти из 9-ти детей с острым гастроэнтеритом в Мельбурне (Австралия) [128]. Вскоре сходный вирус был идентифицирован и в копрофильтратах больных гастроэнтеритом детей методом ЭМ при негативном контрастировании [197]. Последовавшие за этим сообщения о выделении аналогичных вирусов от больных острыми гастроэнтеритами убедительно показали этиологическую роль ротавирусов в возникновении небактериальных диарей у детей раннего возраста и взрослых. В развитых странах на долю ротавирусной инфекции в группе детей 6−24 мес. приходится 40−60% случаев, требующих госпитализации. С помощью эффективной вакцины можно было бы ежегодно предотвращать от 500 тыс. до 1 млн. смертных случаев в этой возрастной группе в мире [73, 364].

В нашей стране концепция о небактериальном гастроэнтерите, как самостоятельной нозологической форме инфекционного заболевания вирусной природы, была разработана в результате клини-ко-эпидемиологических исследований В. И. Покровского и В.П.Маши-лова [72,62]. Первые сообщения о ротавирусах, как этиологическом агенте острых гастроэнтеритов, были сделаны в 1978;79 гг. [65,77,181]. Наибольшее развитие изучение проблемы РВГЭ получило в группе исследователей под руководством С. Г. Дроздова [40, 41,42,43,84,89,94,95,96,97,98].

Изучение РВГЭ началось с применения традиционного метода диагностики — электронной микроскопии [3,41,43,94,95,96] и работ по культивированию вируса [42]. Ротавирусы человека плохо адаптируются к росту на культуре клеток. Долгое время многочисленные попытки размножения их на первичных или перевиваемых культурах с использованием обычных методов культивирования оставались безуспешными. Проблема была решена в результате введения стадии предварительной обработки ротавирионов трипсином, применения низкоскоростного центрифугирования клеток после заражения, роллерных условий культивирования и подбора наиболее чувствительной линии клеток [42,78,93,193,334,427,521,528].

В настоящее время для диагностики ротавирусного гастроэнтерита в мире применяется весь спектр современных иммунологических и генетических методов исследования и тест-систем на их основе — различные варианты ИФА на основе МКА и латекс-агглютинации, электрофорез РНК, ДНК-зондирование, полимеразная цепная реакция [90,178,199,339,402,430,505,525]. В отечественной медицинской науке и практике для выявления ротавирусов и АТ к ним на разных этапах изучения РВИ использовали реакцию коагглютина-ции на основе латексов и стафилококков [34,59,87,100], реакцию пассивной гемагглютинации [32,84], а также различные варианты иммуноферментного анализа [14,34,50,68]. Нашли свое применение и молекулярно-генетические методы исследования — электрофорез РНК и молекулярная гибридизация [1,12,29,30,31,56,94,98].

Применение обширного арсенала методов индикации ротавирусов позволило установить, что на территории Российской Федерации РВИ распространена повсеместно и значимость инфекции в структуре ОКИ сопоставима с заболеваемостью дизентерией и сальмонеле-зом [75]. В Ростовской, Ивановской, Саратовской, Тюменской областях и Ставропольском крае выявляемость РВ антигена среди детей и взрослых с ОКИ составила 1,1 — 15,7% [76], в центральных регионах России доля РВГЭ в структуре ОКИНЭ колеблется в пределах 25−33% [19,20,22,51,58], а в Хабаровском крае — 33,0 -92,9% [74]. РВГЭ включены в Государственную статистическую отчетность по формам N 1 и N 2, утвержденных постановлением Госкомстата России N 59 от 06.06.94 г. По данным Российского республиканского информационно-аналитического центра ГК СЭН в 1995 г. РВ вызвали 5356 случаев ОКИ среди детей до 14 лет, показатель заболеваемости на 100 тыс. составил 13,5, в 1996 г. наблюдался рост заболеваемости по сравнению с 1995 г. на 23% [70,71]. В то же время, сведения о летальности при РВ инфекции в России практически отсутствуют.

К настоящему времени достаточно полно и детально изучены эпидемиологические и клинические особенности РВГЭ, что отражено в монографиях, обзорах и оригинальных исследованиях отечественных и зарубежных авторов [13,40,192,336,403]. Ротавирусы поражают как людей, так и различные виды диких и домашних животных и птиц. Однако, достоверные сведения о животных, как источниках заражения людей в естественных условиях отсутствуют. В общепринятом понимании РВГЭ является антропонозной инфекцией, основным источником которой служит инфицированный человек, больной манифестной или бессимптомной формами инфекции. При этом, бессимптомное вирусоносительство может наблюдаться как среди здоровых детей (2,85%), так и среди взрослых (8%). Среди общавшихся в очаге инфекции выделение РВ здоровыми наблюдается значительно чаще (41,6%). Эпидемическому распространению инфекции способствуют рекордно высокое содержание вируса в фекалиях ин^ фицированных, что определяет обсемененность вирусом окружения больного, устойчивость РВ к воздействию факторов внешней среды и высокая восприимчивость человека к РВ инфекции [13].

Ротавирусная инфекция характеризуется фекально-оральным механизмом передачи возбудителя, реализуемым через множественные факторы контактно-бытовым путем. Факторами передачи РВ инфекции могут быть пищевые продукты. Однако, наиболее важным и первичным фактором является вода, что определяет эпидемиологическую значимость вирусологического исследования загрязненности сточными неочищенными водами открытых водоемов и воды центральных водопроводов [79,80,81]. В научной литературе представлены результаты исследований по выбору оптимальных методов концентрирования вирусов из водных источников — с использованием естественных алюмосиликатов, бентонита и макропористого стекла, помещенного в пакеты из водопроницаемого материала [9,28,33,53]. Обнаружение вируса может быть проведено на культуре клеток, с использованием ИФА, либо молекулярной гибридизации.

29,30,31,53]. По всей вероятности, совершенствование методов выявления ротавирусов в водных концентратах может быть перепективным направлением научных исследований.

Обнаружение в назо-фаренгиальных смывах РНК ротавирусов, находки РВ антигена иммунологическими методами, обнаружение целых вирусных частиц под электронным микроскопом и изолирование инфекционного ротавируса на культуре клеток МА104 послужило основанием для обсуждения возможности передачи РВ в рамках воздушно-капельного механизма, который может быть реализован в стационарах и других учреждениях закрытого типа [206,335,533].

Представляют определенный интерес результаты изучения особенностей распространения РВ инфекции среди новорожденных. Показано, что инфицирование новорожденных от матерей, преимущественно связанное с горизонтальной передачей инфекции, может происходить и вертикальным путем за счет передачи вируса от матери плоду [7]. Кроме того, обнаружение у новорожденных элиминации ротавируса с мочой позволяет рассматривать ее как возможный фактор передачи возбудителя [57].

Ротавирусы поражают людей разного возраста, однако преимущественно они выявляются у детей б мес.- 2 года и пожилых старше 60 лет [17,18,44,48]. Инфекция ротавирусной этиологии регистрируется в виде спорадических случаев, групповых заболеваний и вспышек [13,19,24,40].

Ротавирусные гастроэнтериты чаще наблюдаются в холодное время года («зимние гастроэнтериты»). Сезонные различия наименее выражены в тропиках и отсутствуют в районах, локализованных в пределах 10° широты к югу или северу от экватора [172]. В странах северных широт с умеренным климатом РВИ характеризуется выраженной сезонностью — осенней, зимней или весенней, что исследователи связывают с влиянием снижения температуры окружающей среды и суммарной солнечной радиации, скученностью населения в осенне-зимне-весеннее время и снижением общей резистентности организма [13,20,371,447,476]. При этом установлено, что в разных возрастных группах сезонность РВ инфекции имеет свои особенности [19,20].

Клиника ротавирусных гастроэнтеритов детально охарактеризована у детей и взрослых и мало отличается от проявлений ОКИ иной этиологии. Инкубационный период в среднем составляет 1−2 дня. Начало, как правило, острое, все симптомы заболевания развиваются в течение первых суток. Ведущими в клинической картине заболевания являются синдромы гастроэнтерита (диарея, рвота) и интоксикации (лихорадка, адинамия, слабость, судороги). Часто наблюдаются симптомы острого респираторного заболевания. РВГЭ может протекать в легкой, средне-тяжелой, реже тяжелой формах, возможны летальные исходы [8,13,26,40,44,46,58]. Клиническая картина РВГЭ может различаться у детей разных возрастных групп. Новорожденные преимущественно переносят РВГЭ в бессимптомной или легкой формах [336,481]. Среди детей раннего возраста чаще болеют дети с отягощенным преморбидным фоном, находящиеся на искусственном вскармливании [21,26]. Наиболее тяжело и длительно РВГЭ протекает в сочетании с патогенной и условнопа-тогенной микрофлорой [21,52]. У детей с нарушениями иммунологического статуса РВИ нередко приобретает хроническое течение, сопровождающееся длительным выделением вируса [336].

В монографиях отечественных авторов суммированы результаты различных исследований, касающиеся патогенеза РВ инфекции. Изменения, вызываемые РВ в желудочно-кишечном тракте обозначают как гастроэнтерит. Однако, в литературе до настоящего времени имеются лишь единичные сообщения, описыващие поражение желудка, изменения в двенадцатиперстной кишке носят лишь очаговый характер, а данные по состоянию толстой кишки противоречивы. Патологические изменения при РВГЭ наблюдаются главным образом в тонкой кишке, что выражается в укорочении, расширении и отеке ворсинок слизистой оболочки. Дистрофические и некротические изменения энтероцитов приводят к уменьшению синтеза дисахаридаз и нарушению процессов всасывания, что является причиной дегидратации тканей и развития диареи при РВГЭ. Представлены результаты, свидетельствующие о возможности развития в отдельных случаях внекишечных форм РВ инфекции. Так, РВ обнаружены в смывах трахеи у детей с пневмонией, в экспериментальных исследованиях показана возможность локализации РВ в селезенке и в ткани печени, сопровождавшейся ее абсцессом, сообщено о необычных поражениях кожи при РВГЭ, что выражалось в виде макулопапулезной эк-затемы [13,40].

Все вышесказанное позволяет полагать, что несмотря на всестороннее и детальное изучение ротавирусных гастроэнтеритов, в проблеме существует еще немало вопросов, которые требуют своего разрешения. Развитие исследований в области молекулярной биологии ротавирусов способствовало становлению качественно нового направления в изучении ротавирусных диарей — молекулярной эпидемиологии РВИ [115,157,195,470,471], достижения которой основаны на постоянном получении новых знаний о молекулярной организации и генетическом и антигенном разнообразии ротавирусов.

Структурная организация ротавириона.

Ротавирион — двукапсидная, не содержащая липопротеиновой оболочки вирусная частица, размером 70−75 нм, организованная согласно принципам икосаэдральной симметрии с триангуляционным числом (Т), равным 13. Под электронным микроскопом ротавирион напоминает колесо с короткими спицами и хорошо различимым ободом. В препаратах ротавируса, выделенных от больных животных и человека, под электронным микроскопом при негативном контрастировании можно наблюдать три типа частиц — гладкие двукапсидные (70−75 нм), шероховатые однокапсидные (65−70 нм) и сердцевины (45−50 нм), что отражает существование трех структурных элементов вириона — наружного и внутреннего капсидов и сердцевины [11,13,78,191,444].

Наружный капсид ротавириона представляет собой сотоподоб-ную решетку толщиной около 10 нм, на поверхности которой расположены 60 выступов длиной 4,0 нм с утолщенным дистальным концом. Поверхность пронизана 132 каналами трех типов (I, II, III), различающихся размерами и расположением, которые проникают сквозь оба капсида, достигая сердцевины [191,444].

Внутренний капсид ротавириона, имеющий толщину 15−20 нм, построен по принципу скошенного икосадельтаэдра с Т=13 и левой формой икосаэдральной решетки. Он состоит из 780 структурных единиц, организованных в тримеры. Каждый тример принимает участие в формировании трех соседних капсомеров — 12 пентамеров, расположенных на вершинах икосаэдра, и 120 гексамеров, находящихся на его гранях. Центром координации пентамеров, являются каналы 1-го типа (диаметр на поверхности вириона равен 4 нм). Каналы 11-го типа являются центром гексамеров, окружающих пен-тамеры, а III-го типа — гексамеров следующего ряда (диаметр на поверхности вириона равен 5,5 нм) [95,338,444].

Сердцевина ротавирусной частицы (кор) имеет гексагональную форму, характеризующуюся осями симметрии 2-го, 3-го и 5-го в порядков. Оболочка кора, имеющая толщину 15 А, пронизана маленькими порами вдоль 5-ти и 3-х кратных осей симметрии. Поры вдоль 3-х кратных осей не соотносятся с каналами типа III в оболочке внутреннего капсида, но соединены с ними. Внутреннее содержимое кора представлено геномной рибонуклеиновой кислотой [461].

Геном ротавируса.

Геном ротавириона состоит из 11-ти сегментов двунитевой РНК размером от 667 п.н. (11-й сегмент) до 3302 п.н. (1-й сегмент) [191,422]. На один виток спирали в структуре днРНК ротавируса приходится 11 пар нуклеотидов [503].

Секвенирование генома ротавирусов выявило особенности структурной организации каждого из 11-ти сегментов. Определены 5/- и 3/-концевые последовательности, которые оказались общими для всех сегментов. За кэпированным 5/-концом идут последовательности, специфичные для данного сегмента и идентичные независимо от происхождения вируса, которые являются частью некоди-рующей области. Затем следует открытая рамка считывания и, после стоп-кодона, некодирующая область, содержащая консервативные 3/-последовательности: 57 — m7GpppGp (m)GpCp ————————UGUGACC.

— З7 — Ср CpGp ————————ACACUGG.

Наличие на 5/-конце Сар-структуры, состоящей из метил-гуаниди-на, свидетельствует, что «+» -нить РНК может выполнять роль информационной РНК для синтеза вирусных белков, однако 3/-конец таких РНК не содержит поли-А последовательностей, характерных для информационной РНК эукариотических клеток [349,435].

Десять сегментов ротавирусного генома являются моноцистрон-ными матрицами для синтеза одного белка. В то же время, ген УР7 является бицистронным и кодирует 2 гликопротеида, синтезирующихся с первого и второго инициирующих кодонов в одной рамке считывания [482].

К настоящему времени закончено определение полной нуклео-тидной последовательности всех сегментов генома ротавирусов группы, А различного происхождения, установлены функции каждого гена и идентифицированы их продукты [191].

Структура и функции белков ротавируса группы А.

Наружный капсид.

УР4 — белковый продукт геномного сегмента 4 (2362 п.н.), димеры которого образуют 60 выступов наружного капсида ротави-риона [443]. Белок характеризуется полифункциональностью, определяемой особенностями первичной и вторичной структуры его полипептидной цепи [191].

На рис. 1 представлена схема структурной и антигенной организации Л?4, из которой видно, что белок состоит из 776 а.о., (у ротавирусов человека может быть 775 а.о.), и содержит один высоковариабельный участок и две консервативные области.

Центральный консервативный регион полипептидной цепи /Р4 имеет сайт протеолитической активации ротавириона трипсином, места связывания которого находятся в позициях Агд24 1 — Агд247 [382]. Обработка ротавириона трипсином приводит к активации его инфекционности, способствуя проникновению вируса в клетку и раздеванию вириона, необходимого для инициации транскрипции РНК [194] .

VP4 несет на поверхности сеть отрицательных зарядов при рН 7,0 и вторичную структуру до сайта расщепления трипсином, представленную множеством беспорядочных клубков и петель, что предполагает глобулярное строение этого участка. Структура белка стабилизирована двумя дисульфидными мостиками, обеспечивающими доступность сайта протеолитической активации для действия трипсина. При обработке трипсином VP4 нарезается на два пептида — VP5 (60 kDa) и VP8 (28 kDa), в результате чего происходит выщепление б а.о. и образование свободного NH2-конца на полипептиде VP5, что, как предполагается, активирует ранний этап репликации ротавириона на уровне его взаимодействия с мембраной чувствительной клетки. Вновь образованный NH2-конец VP5 ротави-руса отличается по первичной структуре от протеолитически активированных N-концов белка наружного капсида вирусов гриппа и парамиксовирусов, несущего функцию белка слияния. У ротавирусов N-конец VP5 содержит не гидрофобные, а полярные аминокислоты, что предполагает иной механизм взаимодействия с клеткой, нежели у вирусов гриппа [191,382,384],.

Регион VP4 384−401 а.о. является гидрофобным и высококонсервативным у разных штаммов ротавируса. Предположительно он идентифицирован как необходимый для кооперации с другими гидрофобными участками, что может иметь значение как при слиянии с клеточной мембраной для проникновения вируса в клетку, так и при созревании ротавириона, которое включает в себя перемещение вируса по ЭПР клетки [191].

Открытие того факта, что VP4 индуцирует продукцию МКА, спо.

УР4.

Р8 | УР5.

I I.

1 II 776.

I-1−1-1−1—п—I-1−1-1— -1 т2 -1 I, а | | ь | | | | ь | | н | | - соон.

IIIII111IIII.

71 204 224 236 257 271 385 404 1.

УР6.

I-1−1—I-1−1—Г.

Ш2-| |с, 1| |II | |1| IIIIIII.

1-г.

1III J.

1−1-1.

11| I — СООН JII.

45 75 83 92 114 120.

312 319 341 352.

1 Н1 Н 2 УР7.

I—I—I—I—1−1-1−1 Г ин2-| | | | | |А| | В |.

11 111 I II1.

1-Г.

I С |.

J1.

— СООН.

6 23 48 87 99 145 150 208 221 275 295.

Рис. 1. Схема структурной и антигенной организации основных белков ротавириона [191,369,370] :

Л?4: а — регион высокой вариабельностиЬ — регион протеолитического расщепленияН — гидрофобный консервативный регион. УР6: С — группои 1,11 — подгруппо-специфичные регионы. УР7: Н1, Н2 — гидрофобные регионыА, В, С — серотипспецифичные регионы. Арабскими цифрами обозначены позиции аминокислотных остатков. собствовало расширению исследований по изучению роли этого белка в определении серотиповой специфичности штамма ротавируса и в общем иммунном ответе на инфекцию [332]. VP4 индуцирует образование нескольких типов МКА — штаммоспецифических, серотипспе-цифических и перекрестнореагирующих [365,492]. Штаммоспецифи-ческие МКА связываются с VP4 в зоне наибольшей вариабельности аминокислотной последовательности (71−204 а.о.) пептида VP8, который наиболее экспонирован на поверхности вириона и его вариабельность легко может быть объяснена явлением иммуноселек-ции. До недавнего времени считалось, что на этом вариабельном домене не существует функциональных или нейтрализующих эпито-пов. Однако, в 1995 г. Padilla-Noriega L. с соавт. сообщили о выявлении независимого нейтрализующего домена, расположенного на VP8 РВ человека шт. БТЗ [433]. Перекрестно-реагирующие эпито-пы, картируемые на VP5, находятся в относительно ограниченной области — около аминокислотных остатков 306, 388, 393, 434 и 440. Критическими для проявления нейтрализации являются позиции 385−392 и 428−433 а.о. [191,368].

Сравнительное изучение нуклеотидной последовательности гена и аминокислотной последовательности VP4 вирулентных штаммов РВ человека (iiit.RV5, Wa, Р, Va7 0) и штаммов, полученных от детей с бессимптомной инфекцией (шт.М37, ST3), выявило существование как минимум трех типов последовательности VP4 [227]. Эти данные, наряду с доказательствами о наличии у ротавирусов перекрестно-реагирующих антигенных детерминант и установлением выраженных антигенных отличий VP4 в пределах одного серотипа и между серотипами 1−4 свидетельствовали о том, что VP4 обладает серотиповой специфичностью и определяет существование целого ряда серотипов ротавируса [365,492].

VP4 отвечает за тканевой тропизм ротавируса и его вирулентность для определенного хозяина [144,425]. Предполагается, что детерминанта вирулентности локализована между аминокислотами в позициях 307−407 [348]. Расположение детерминанты вирулентности в высококонсервативном гидрофобном домене VP4 подтвердилось при серийном пассировании РВ свиньи шт-PRV 4 °F на поросятах гнотоби-онтах. Авторы наблюдали изменение патогенности штамма в процессе пассирования ротавируса, коррелирующее с мутацией, приведшей к замене Leu на Glu в позиции 469 гидрофобного домена VP4 [156].

VP4 — вирусный гемагглютинин. Однако, это свойство не является общим для РВ различного происхождения [357]. Для проявления гемагглютинирующей активности РВ животных достаточно области между 93 и 208 а.о. VP4 [207].

VP7 — основной белок наружного капсида, является продуктом геномных сегментов 7,8,9 (1062 п.н.) у РВ разного происхождения [134,135]. В инфицированной клетке одновременно синтезируются два белка VP7(1) и VP7(2) с м.м. 33,919 и 37,368 кДа и размером 297−326 а.о., соответственно, которые претерпевают посттрансляционную модификацию с образованием зрелой формы VP7 [160,482]. Продукты первичной трансляции гена VP7 в NH2-концевой части аминокислотной последовательности содержат, соответственно, две или одну консервативные гидрофобные области (Рис.1), имеющие характеристики сигнального пептида, которые, как предполагается, выполняют якорную функцию и ответственны за удержание белка на мембране ЭПР [138]. Процессинг VP7 удаляет оба гидрофобных домена за счет расщепления полипептида в позиции А1а50, N-концевым а.о. зрелого VP7 остается Gln51, присутствующий в виде пироглутаминовой кислоты [482]. Удаление 14-ти N-концевых остатков зрелого VP7 приводит к транспортировке белка в аппарат Гольджи и его секреции из клетки. По мнению авторов, особо важную роль в удержании зрелого VP7 в ЭПР играют остатки от Leu7 до Ser^ 2 [385].

VP7 — гликопротеид. Гликозилирование не сопряжено с трансляцией белка и является результатом его процессинга. VP7 рота-вируса разного происхождения имеет от 1 до 4 потенциальных сайтов гликозилирования олигосахаридами маннозного типа [135,191]. Гликозилирование VP7 не имеет значения для адсорбции ротавирио-на на клеточной поверхности и инфекционности вируса, а является важным модификатором его антигенности [159,375].

VP7 — основной типоспецифический антиген, определяющий существование разных серотипов вируса. Сравнительный анализ полных нуклеотидной и аминокислотной последовательностей VP7 разных серологических типов PB выявил существование 6-ти дискретных областей, высоконсервативных внутри каждого серотипа и вариабельных у разных серотипов вируса [229,329]. Три из этих вариабельных участков — А (а.о. 87−101), В (а.о. 143−152) и С (а.о. 208−221) — являются основными сайтами, участвующими в серотипспецифической нейтрализации (Рис.1), причем районы, А и С образуют единый конформационный эпитоп [185,191,342]. Наличие в аминокислотной последовательности VP7 серотипспецифических участков определило возможность определения серотипа PB на основе сравнительного анализа их первичной структуры [328,330].

VP7 — основной нейтрализующий антиген, определяющий формирование протективного иммунитета [191,403].

Внутренний капсид.

VPб — единственный белок внутреннего капсида ротавириона с м.м. 44,873 кДа, состоящий из 397 а.о., является продуктом б-го геномного сегмента (1356 п.н.) [137,502].

В составе вирусной частицы VP6 присутствует в качестве три-меров, объединенных нековалентными связями. В молекуле VP6 имеются три остатка цистеина, принимающие участие в образовании межмолекулярных дисульфидных связей между парами тримеров в гексагональных единицах внутреннего капсида, но не между VPб внутри тримеров [231]. VP6 состоит из трех доменов — головки, стебля и хвоста. В образовании тримеров участвуют домены головки [461]. Наиболее важное значение для тримеризации VP6 имеют а.о. в позиции 159−165 [370]. Кроме того, замена Pro30g на Glu также приводит к дестабилизации тримеров при низких значениях рН [473].

Биохимическое и иммунологическое изучение роли VP6 показало его специфическую биологическую функцию в вирусной репликации. При удалении VP6 путем обработки вируса хлоридом кальция исчезала РНК-полимеразная активность вируса. По всей вероятности, VP6, являясь структурным компонентом вириона, обусловливает кон-формационные изменения вирусной РНК-полимеразы, необходимые для проявления транскриптазной активности [126].

VP6 — один из основных антигенов вируса. На его поверхности находятся антигенные детерминанты, определяющие групповую специфичность ротавируса. Группоспецифические МКА узнают пептиды, соответствующие а.о. 48−64, 53−67 и 60−75 [369,370].

VP6 определяет подгрупповую специфичность штамма ротавируса. Идентифицированы 5 областей аминокислотной последовательности, дающие вклад в подгрупповые эпитопы (Рис.1), которые, по всей вероятности, формируются а.о. разных молекул тримера VP6, так как МКА, специфичные в отношении подгруппы, взаимодействуют только с тримерной формой белка [231].

VP6 высокоиммуногенен, однако его роль в формировании про-тективного иммунитета до настоящего времени находится в стадии изучения [191,403].

Сердцевина (кор).

VP1 — кодируется геномным сегментом 1, имеющим размер 3302 п.н. и одну открытую рамку считывания [171]. VP1 — относительно гидрофобный, щелочной белок с м.м. 124,847 кДа, состоящий из 1088 а.о., составляет 2% массы ротавириона. По предсказанной аминокислотной последовательности VP1 похож на РНК-зависимые РНК-полимеразы РНК-содержащих вирусов. Местом связывания VP1 в полимеразном комплексе является остаток цистеина в позиции 630−632 а. о. VP1 иммуногенен — полученная с его использованием гипериммунная антисыворотка иммунопреципитирует VP1, но не нейтрализует ротавирус [171,191].

VP2 — является основным структурным белком сердцевины, имеет м.м. 102,431 кДа, состоит из 880 а.о., кодируется генным сегментом 2 (2687 п.н.) [191].

VP2 содержит остаток меристиновой кислоты, которая связывается с N-концевым глицином в молекуле VP6 [166]. Экспрессиро-ванный в бакуловирусе, белок образует пустые сферические частицы (d= 520+20 А), имеющие икосаэдрическую симметрию. Реконструированные частицы реагируют с очищенным VP6, образуя пустые двуслойные структуры, что свидетельствует о его роли в сборке ротавирионов [534]. VP2 не только структурный белок, также он участвует и в процессе связывания нуклеиновых кислот, что показано для днРНК, онРНК и днДНК. Предпочтительнее VP2 связывает онРНК, независимо от последовательности. Однако, биологический смысл такого связывания пока непонятен, так как присутствие VP2 необязательно для инициации репликации РНК [140,209].

VP3 — минорный белок кора с м.м. 98,120 кДа, состоящий из 835 а.о., кодируется генным сегментом 3 (1356 п.н.) [191,379]. Предполагается, что VP3 необходим в качестве компонента репли-казной системы, но не для сборки субвирусных частиц [519].

Неструктурные белки.

NS53 — продукт 5-го гена (1581 п.н.) с м.м. 58,654 кДа, состоящий из 491 а.о. [142]. Слабощелочной металлопротеин, имеющий консервативные места связывания Zn2+ в позициях 54−66 и 314−327 а.о. [191,400].

NS53 имеет сродство ко всем 11-ти сегментам РНК ротавируса и узнает в них элемент, расположенный около 5/-конца. Домен связывания РНК содержится в пределах 81 а.о. N-концевой высококонсервативной области, богатой остатками цистеина. В зараженных ротавирусом клетках большая часть NS53 располагается в цитоплазме, где он ассоциирован с цитоскелетным матриксом. За внутриклеточную локализацию отвечает домен 84−176 а.о. Оба домена — связывания РНК и внутриклеточной локализации — расположены перед С-концевой областью, состоящей из 233 а.о. и несущественной для репликации РНК in vitro [345,346].

NS35 — слабокислый белок с м.м. 36,63 3 кДа, состоящий из 315 а.о., кодируется 7,8 или 9 сегментом (1059 п.н.) у ротавирусов различного происхождения [191].

Белок NS35 неспецифически связывается с РНК, накапливается в вироплазмах и необходим для репликации ротавирусного генома. NS35 образует мультимеры с константой седиментации 10S, которые не содержат РНК и взаимодействуют с РНК-полимеразой VP1. Предполагается, что комплексы, образующиеся из VP1, мультимеров NS35 и РНК могут координировать упаковку РНК и сборку сердцевин вирионов ротавируса [362].

NS34 — белок с м.м. 34,600 кДа, состоящий из 315 а.о. У ротавируса обезьян шт. SAH кодируется 7-м сегментом РНК (1104 п.н.). In vitro образует комплекс с NS53, из инфицированных клеток выделяется в составе репликазной частицы и, подобно NS53, играет принципиальную роль в процессе репликации [191].

NS28 — трансмембранный гликопротеид с м.м. 20,290 кДа, состоящий из 175 а.о., является продуктом геномного сегмента 10 (751 п.н.), способен связывать Са2+ [136,191,506,507].

NS28 в присутствии ионов кальция и магния взаимодействует с VP6, находящимся в составе однокапсидной вирусной частицы [397]. Связывание этих двух белков происходит на цитоплазмати-ческой стороне мембраны ЭПР, где NS28 выступает в качестве ЭПР-рецептора. Домен связывания расположен на С-конце полипептидной цепи, содержащей метионин [504].

NS26 — неструктурный фосфопротеид с м.м. 21,560 — 26 кДа, состоящий из 198 а.о., является продуктом 11-го гена (667 п.н.). Полипептидная цепь NS26 содержит регионы высокой и относительно высокой вариабельности между 112−140 а.о. Антитела к NS26, экспрессированному в бакуловирусе, обладают перекрестной реактивностью к вирусам всех серотипов, находящихся в дискретном состоянии в цитоплазме инфицированных клеток, что свидетельствует о его роли в вирусной репликации [191,523].

Репродукция ротавируса. в чувствительной клетке.

Информация о структуре и функциях белков, кодируемых рота-вирусным геномом, помогла понять молекулярные механизмы репродукции ротавируса в инфицированной клетке. Однако, следует отметить, что многие моменты репродуктивного цикла все еще остаются неясными.

Ротавирусная инфекция начинается прикреплением вируса к специфическому клеточному рецептору, находящемуся на клетках цилиндрического эпителия, покрывающего вершины ворсинок слизистой оболочки тонкого кишечника. Изучение природы клеточных рецепторов РВ животных в реакции гемагглютинации и при их взаимодействии с фракцией энтероцитов показало участие в связывании нейраминовой кислоты [113,459]. В то же время, для РВ человека таких убедительных данных не получено. Существует мнение, что РВ человека могут иметь и отличные от РВ животных эпитопы связывания [208].

Долгое время открытым оставался вопрос о прикрепительном белке ротавириона. Первоначально считалось, что таким белком является VP7, поскольку только он был связан с клетками однослойных культур при нанесении экстракта зараженных клеток, содержащих радиоактивные ротавирусные белки. Разрушение дисуль-фидных связей в VP7 препятствовало узнаванию клеточных рецепторов [13,465]. Однако, в процессе определения вирусного белка, адгезирующегося in vivo с клетками мишенями при ротавирусной инфекции установлено, что с клетками МА-104 и эритроцитами мыши связывается белок NS35, а не VP7, как считалось ранее. О возможности функционирования NS35 как белка прикрепления свидетельствовал факт его выделения в небольших количествах совместно с вирионами с двойным капсидом [112]. Кроме того, существует мнение, что в процесс прикрепления ротавириона к клетке может быть вовлечена двулопастная структура вирионных выступов, образованных димерами VP4. С помощью крио-электронной микроскопии зафиксировано связывание двух Fab-фрагментов нейтрализующих МКА с дистальным концом каждого из 60-ти выступов ротавириона. Такое связывание приводит к нарушению адсорбции вируса на клетке-мишени [443]. Эти результаты подтверждаются тем, что способность ротавирионов агглютинировать эритроциты человека группы О, морской свинки, кур и т. д. ингибируется МКА к VP5 и VP8 [357].

После адсорбции вируса на клеточной поверхности, происходит его проникновение в клетку. На протяжении всего времени изучения патогенеза ротавирусной инфекции обсуждаются два возможных механизма проникновения ротавириона в чувствительную клетку — с использованием рецепторного эндоцитоза и путем прямой пенетра-ции через клеточную мембрану, либо с использованием обоих механизмов. Suzuki Н. с соавт. (1985 г.) сравнивали проникновение в клетки МА-104 ротавируса человека, активированного и неактивированного трипсином. Инфекционный вирус внедрялся в цитоплазму, пересекая плазматическую мембрану и сочетая проникновение с «раздеванием». В цитоплазме уже через 5 минут после заражения обнаруживались вирусные однокапсидные частицы. Напротив, необработанные трипсином ротавирионы попадали в клетку путем эндоцитоза и через 20 минут обнаруживались в лизосомах [484]. Позднее, в 1988 г., эти результаты были подтверждены Kaljot К.Т. с соавт. [360]. В то же время, при изучении репликации в клетках МА-104 трипсин-активированного ротавируса свиней наблюдалось вхождение вируса в клетку путем эндоцитоза. Вирус обнаруживался внутри вторичных лизосом, но не раздевался [384]. По всей вероятности, имеют место оба механизма проникновения вируса в клетку, однако для запуска инфекционного процесса необходимо сочетание проникновения вириона с его «раздеванием», которое наблюдается лишь при прямой пенетрации инфекционного вируса через клеточную мембрану [372].

Протеолитическая активация путем нарезания VP4 является определяющим условием «раздевания» вириона, которое может включаться с помощью одного или обеих вновь образованных концевых зон VP5 и VP8 или при помощи возможных конформационных изменений нарезанного VP4 [191,372]. Существенным моментом в эффективном «раздевании» ротавириона является также низкая концентрация Са2+ во внутриклеточной среде [384].

Потеря ротавирионом наружного капсида приводит к активации РНК-зависимой РНК-полимеразы (VP1), транскрипционная функция которой направлена на синтез «+» -нитей РНК, являющихся как информационными РНК для синтеза вирусспецифических белков, так и матрицей для синтеза «-» нитей при сборке ротавирионов [478]. Для проявления транскриптазной активности РНК-полимеразе необходимо присутствие VP6, вследствие чего наработка «+» -нитей идет только в составе однокапсидной вирусной частицы [126]. Эти ранние исследования подтвердились угнетением транскрипции ротавируса при его взаимодействии с МКА к VP6 с однои двукапсид-ными ротавирионами [222]. Стимуляция транскриптазной активности однокапсидных ротавирионов добавлением S-аденозил-метионина позволила предположить, что однокапсидные частицы обладают гуа-нилтрансферазной и метилтранферазной активностями [477]. Транскрипция РНК ротавируса регулируется количественно и качественно. Качественный контроль был обнаружен в условиях блокирования синтеза белка циклогексимидом: транскрипция генов 5,6,7 и 8 не зависела от синтеза белка. Количественная регуляция выражалась в том, что мРНК одних генов (2 и 7) накапливалась гораздо в большем количестве, чем других (4 и 6), однако, окончательный уровень мРНК, присутствовавших в клетке, не зависел от относительного содержания продуцируемых белков. VP6 и NS28 нарабатывались в крайне большем количестве, нежели оставшиеся 9 белков [354] .

Большинство структурных и неструктурных белков ротавируса синтезируется на свободных рибосомах цитоплазмы, при этом VP1, VP2, VP3, NS53, NS34, NS35 и NS26 локализуются в электронноп-лотной вироплазме, VP4 и VP6 идентифицируются в пространстве между периферией вироплазмы и наружной стороной ЭПР. В противоположность этому VP7 и NS28 синтезируются на рибосомах, ассоциированных с мембраной ЭПР [355,453].

Основываясь на результатах своих исследований, Gallegos С.О. и Patton J.T. предложили модель морфогенеза однокапсидной вирусной частицы [209,436]. В инфицированных ротавирусом SA11 клетках МА-104 ими определено три типа субвирусных частиц, обладающих репликазной активностью — прекор (45 нм), кор (65 нм) и однокапсидный вирион (75 нм), различия в полипептидном составе которых могут отражать последовательность сборки рота-вириона. Прекор образуется в вироплазме как результат геномного группирования 11-ти «+» -нитей РНК и белков VP1, VP3, NS26, NS53, NS34, NS35. После ассоциации этих компонентов вирусная репликаза (VP1) инициирует синтез «-» нитей РНК на матрице «+» нитей мРНК. Когда «-» нить подвергается удлинению, прекор конкурентно подвергается морфогенезу в кор путем добавления VP2. В основе образования коровой частицы лежит явление самосборки, что подтверждается способностью VP2 в условиях in vitro образовывать сферические, вытянутые и спиралевидные структуры [534]. Для проявления репликазной активности присутствие в реп-ликазном комплексе белка VP6 необязательно [388].

Двигаясь к периферии вироплазмы, коровая частица приобретает VP6. Известно, что VP6 способен образовывать, как в клетке, так и в условиях in vitro, гексагональные решетки и тубулярные структуры, что свидетельствует о роли белок-белковых взаимодействий и явления самосборки и в процессе формирования внутреннего капсида ротавириона [450]. Домен VP6, необходимый для сборки однокапсидной частицы, локализован на карбокси-конце VP6 между аминокислотными остатками 205 и 328 [165].

Субвирусная репликазная частица, состоящая из структурных белков, входящих в состав однокапсидного вириона и неструктурных белков, необходимых для репликации генома, имеет размер 100 нм. В составе такой частицы продолжается удлинение «-» цепи РНК, при этом «+» нить РНК, выступающая из репликазной частицы, затягивается внутрь. Снижение количества выступающих из репли-казных частиц «+» нитей коррелирует по времени с уменьшением размера частиц, которое, по мнению авторов, может быть связано как с окончанием образования полноразмерных сегментов генома и их упаковкой внутри частицы, так и с потерей неструктурных бел.

КОВ, выполнивших свои функции [436].

Следующим этапом в морфогенезе ротавируса является почкование однокапсидной вирусной частицы через мембрану ЭПР, в процессе которого субвирусная частица приобретает временную псевдооболочку. Этот процесс является уникальной особенностью морфогенеза ротавирусов, отличающей их от других членов семейства Reoviridae [55,467]. Рецептором однокапсидного ротавириона на цитоплазматической стороне ЭПР является С-конец полипептидной цепи трансмембранного гликопротеида NS28, который присутствует в ЭПР в форме тетрамера [109,386,504]. Процесс ассоциации VP6 и NS28 кальций зависим, что определяется Са2±связывающими свойствами NS28, который, за счет образования катионного канала, усиления утечки кальция через рецептор инозит-1,4,5-трифосфата и действия на фосфолипиды, увеличивает проницаемость мембраны ЭПР и определяет возрастание концентрации цитозольного кальция в инфицированной клетке [397,398,472,506,507].

После транслокации однокапсидной частицы в просвет каналов ЭПР она теряет псевдооболочку, быстро замещающуюся белками наружного капсида. VP4 и VP7 появляются в зрелой двукапсидной частице в течение 10−15 минут после почкования [355]. Механизм транслокации VP4, локализованного на цитоплазматической стороне ЭПР, в каналы ретикулюма остается неясным. Продемонстрировано, что NS28 может образовывать олигомеры с VP4 и VP7, однако такое взаимодействие, по-всей вероятности, может иметь отношение к сборке внешнего капсида ротавириона, но не к транслокации VP4 [386]. Процесс связывания VP6 и VP7 при сборке наружного капсида носит спонтанный характер, о чем свидетельствует способность этих белков ассоциировать в условиях in vitro в присутствии.

Са2+ [451]. Для сборки наружного капсида необходимо определенное конформационное состояние VP7, определяемое дисульфидными связями белка [485].

Инфекционный цикл заканчивается освобождением полных дву-капсидных вирусных частиц, происходящим в результате клеточного лизиса уже через шесть часов после инфицирования клетки и достигающим максимума через 15−24 часа. При этом, собственно процесс сборки ротавириона занимает по времени менее часа [191,478]. Гибель клеток является следствием накопления вирусных продуктов, но не связана с образованием инфекционных вирусных частиц [398]. При освобождении из клеток слизистой кишечника происходит протеолитическое расщепление VP4, и ротавирионы, попадающие в окружающую среду, не имеет целого VP4 [384].

Классификации ротавирусов.

Дифференциация штаммов на основе анализа геномной РНК.

При электрофорезе в ПААГ одиннадцать сегментов ротавирусно-го генома распределяются с образованием характерного профиля, состоящего из четырех классов генов, который является стабильным признаком штамма ротавируса и определяет его ЭФ-тип (Рис.2) [358,373,454]. На ранних этапах изучения РВГЭ и ротавирусов в нескольких лабораториях были предприняты попытки использования ЭФ-типа РНК в качестве классификационного признака. Так, Rodger S.M. и Holmes I.H. (1979 г.) предложили систему, подобную используемой для вирусов гриппа, где каждому вновь выделенному ЭФ-типу присваивается очередная буква алфавита [456]. Lourenco М.Н. с соавт.(1981 г.) присваивали буквенные обозначения не ЭФ-типу в целом, а вариантам распределения сегментов в каждом из 4-х классов, а ЭФ-тип РНК штамма выражали их комбинацией [383]. Такую классификацию ЭФ-типов несколько изменили и дополнили Димитров Д. с соавт. (1984 г.), проводившие совместный электрофорез РНК исследуемых изолятов ротавируса [37,38]. Мооэа1 И.В. с соавт. (1984 г.) предложили для регистрации ро-тавирусных штаммов так называемый «ротакод», в котором вариантам распределения сегментов в классах присвоены условные обозначения, учитывающие видимое количество полос [405]. Однако, следует отметить, что эти схемы не нашли широкого применения, так как многообразие вариантов распределения сегментов РНК выходит за рамки предлагаемых обозначений и в каждом исследовании, как правило, применяется своя нумерация выявляемых ЭФ-типов РНК. Несмотря на это очевидно, что использование классификационных схем ЭФ-типов РНК, полученных в стандартных условиях проведения электрофореза при наличии общего элемента сравнения и включающих полный профиль РНК позволило бы сравнивать штаммы, выделенные в разных лабораториях и получать полезную информацию о их распространенности.

Накопленные к настоящему времени данные о пределах вариабельности ротавирусного генома позволили выявить существование групп ротавируса, принципиально различающихся по картине распределения сегментов на классы (Рис.2). Для типичных ротавиру-сов характерно распределение 4−2-3−2, при котором 1-й класс генов включает 1,2,3,4-й сегменты, 11-й класс — 5,6-й, Ш-й класс — 7,8,9-й, а 1У-Й — 10−11-й сегменты РНК. В то же время, определены «атипичные» картины — с распределением 4−2-2−3, при которых 9-й сегмент тяготеет к IV классу генов, и 4−3-2−2, когда триплет сегментов наблюдается во 11-м классе генов, встреча.

В С И классы сегментов 1.

2, 3 4.

1, 2 3.

4, 5 6 5.

I I 6.

7, III 9.

1 О.

IV 11.

— 7 = 9,10.

1 1.

— 9 дл к ск.

Рис. 2. Схематическое изображение ЭФ-типов РНК рота-вируса человека, в сравнении с реовирусами (И). Атипичные профили РНК: дл -" длинные", к -" короткий", ск -" сверхкороткий" - В, Сатипичные профили РНК [36,113,139,456] ющиеся среди ротавирусов человека, и другие, выявляемые у рота-вирусов животных [36,113,139,158,456].

Среди типичных профилей миграции сегментов РНК определены 4 принципиальных картины их распределения, отличительным признаком которых является относительная электрофоретическая подвижность 10−11-го сегментов (Рис.2). Первыми были описаны так называемые «длинные» и «короткие» профили, различающиеся тем, что сегменты IV класса «коротких» РНК мигрируют выше «длинных» (соответственно 11-й сегмент мигрирует на уровне 10-го). [189,359,373]. У «сверхкоротких» РНК 11-й сегмент имеет аномально низкую электрофоретическую подвижность [103,393]. Среди «длинных» ЭФ-типов РНК обсуждаются профили, характеризуются относительно широким разбегом сегментов 11-го и 1/-го классов [366,412].

Изучение генома штаммов ротавируса в реакции молекулярной гибридизации с использованием РНК-транскриптов и кДНК-зондов показало, что изоляты ротавируса с типичными и атипичными картинами распределения сегментов не имеют генетических взаимосвязей, что свидетельствует об отсутствии единых родовых истоков этих вирусов [187,441].

РНК различных ЭФ-типов типичных РВ также была изучена в реакции РНК-РНК гибридизации. РНК «длинных» ЭФ-типов гибридизуют-ся между собой и с прототипным штаммом ВДа по большинству сегментов генома и не гибридизуются с РНК «короткого» типа, которые перекрестно взаимодействуют между собой и с прототипным штаммом 0Б-1. На основании этих данных ротавирусы с «длинными» и «короткими» ЭФ-типами РНК отнесены к различным геногруппам ротавируса и названы соответственно прототипным штаммам — ЭДа и.

03−1 геногруппы [202,203]. Тестирование в реакции молекулярной гибридизации РНК «сверхкороткого» ЭФ-типа штамма 69 М показало наличие среднего уровня гомологии с РНК «короткого» ЭФ-типа (шт.0Б-1) и отсутствие гомологии с РНК «длинных» типов (шт.ДОа, Аи-1). Кроме того, РНК шт.69М проявляла средний уровень гомологии с РНК ротавируса телят Небраски [423]. Генетический анализ изолятов РВ с «длинным» профилем РНК, характеризующимся широким разбегом сегментов 11-го и 1У-го классов (шт, Аи-1, Аи-228, Аи-125), показал, что эти штаммы не родственны ротавирусам человека геногрупп ЭДа и 0Б-1 и позволил авторам говорить о новой Аи-1 геногруппе ротавируса человека [409]. Штамм Аи-228, выделенный от мальчика, контактировавшего с кошкой, проявлял высокую степень гомологии с кошачьим РВ шт. Р1?У-1. Для объяснения этого факта авторы предложили три гипотезы: 1. Изоляция такого штамма является следствием прямой трансмиссии кошачьего РВ к человеку- 2. Такие РВ появляются в результате адаптации кошачьих РВ к другому хозяину — человекуЗ. Эта группа РВ человека имеет общее (родовое) происхождение с РВ кошек. Первые два предположения свидетельствуют о том, что РВ животных могут быть патогенны для человека, третья позволяет предположить, что РВ человека могут эволюционировать через генетические взаимодействия с РВ животных [409,416]. Следует отметить, что среди ротавирусов животных выделены еще две геногруппы, одна из которых включает ротавирусы телят, а другаяротавирусы собак [417].

Антигенная классификация ротавирусов.

До 1980 г. считалось, что все ротавирусы имеют общие антигены, определяемые с помощью иммунофлуоресценции, фиксации комплемента, либо иммуноферментного анализа и разделяются на ряд видоспецифических серотипов [198]. Однако, последующие исследования множества изолятов ротавируса, выделенных от человека и животных, с использованием ЭМ и иммунологических методов исследования, показали, что по наличию группоспецифического антигена ротавирусы могут быть подразделены на 7 иммунологических групп (A-G), не имеющих антигенных связей. Ротавирусы групп D-G обнаружены только у животных и птиц, а групп А, В и С — как у животных, так и у человека [36,107,143,161,179,403,420]. Ротавирусы разных антигенных групп, имея общую морфологию и структуру генома, характеризуются специфическими картинами миграции сегментов генома при электрофорезе — ротавирусы группы, А имеют варианты типичного распределения генов, ротавирусы групп В и С (параротавирусы) — атипичные варианты В и С, соответственно, показанные на рис. 2. К настоящему времени разработаны различные иммунологические и генетические методы дифференциальной индикации ротавирусов различных антигенных групп и определения уровня антител к ним [111,116,121,179,324,419,530,531], но, несмотря на это, специфические картины распределения сегментов РНК на классы служат надежным критерием первичной характеристики штаммов ротавируса и оценки их групповой принадлежности [36,118,139].

Ротавирусы антигенных групп А, Ви С (РВ-А, РВ-В, РВ-С, соответственно) характеризуются различной значимостью в инфекционной патологии человека. Известно, что РВ-В широко распространены среди домашних животных и крыс [146,327,520]. Исследования, проведенные в Балтиморе (США), показали наличие антител к ротавирусподобному агенту, выделенному от крыс (uit.BESV), у 88% обследованных людей. Исходя из этого авторы полагали, что РВ-В широко распространены и среди людей, но они редко выявляются из-за сложности их детекции. Целенаправленное выявление AT к РВ-В показало их низкий уровень в человеческой популяции. Так, при изучении сывороток, собранных в Великобритании анти-РВ-В AT выявлены лишь у 10% доноров крови и 4% ветеринаров [146,188]. Использование метода ELISA, разработанного на основе iiit. ADRV, выделенного от больного РВ-В диареей взрослого, установило наличие анти-РВ-В AT в 1 случае из 10-ти в Кении, из 20-ти в Тайланде, из 15-ти в Канаде, из 155-ти в США [419]. В популяциях жителей США AT к РВ-В щенка (шт.IDIR) присутствовали в 3-х случаях из 129 [188]. В то же время, в Китае уровень распространенности AT к РВ-В оказался очень высок — 41%, где атипичные ротавирусы группы В были причиной обширных эпидемий тяжелой диареи у взрослых, при которых заболевало от 12 до 2 0 тыс. человек, новорожденных детей и детей младшего возраста [161,532]. Характер вспышек, а также низкий уровень антител к РВ-В у ветеринаров, представляющих собой «группу риска», свидетельствовали, что резервуаром инфекции в Китае являются не домашние животные, а грызуны [146]. По всей вероятности, циркуляция ротавирусов группы В среди людей носит ограниченный характер во многих странах мира и эндемичные, эпидемические штаммы РВ-В играют ведущую роль в возникновении РВГЭ лишь в Китае [146,161,532].

Ротавирусы группы С, широко распространенные среди свиней и овец [36,143], от человека впервые были выделены в Австралии в 1982 г. [455]. В дальнейшем РВ-С были обнаружены у больных с диареей в разных странах мира — США, Японии, Франции, Италии, Венгрии, Болгарии, ГДР, Финляндии, Таиланде, Непале, Англии. Однако, частота их выявления была гораздо ниже, чем типичных ротавирусов группы А, и составила 0,25−4,0% среди больных ро-тавирусными диареями. Так, в Мельбурне РВ-С были выявлены в 1 случае из 400, в Финляндии — в 6-ти из 600, во Франции — в 3-х из 1028, в Болгарии — в 5-ти из 691, в Венгриив 2-х из 105, в Тбилиси — в 1 случае из 2 39 положительных на ротавирусы проб [47,107,133,145,179,420,489]. В то же время, в работе Bothing В с соавт. (1989 г.) описано выявление большого числа РВ-С у детей в ГДР — 21 из 141 больного ребенка [139]. Сведения о распространенности параротавирусов на территории Российской Федерации в литературе отсутствуют.

Ротавирусы группы С вызывают как спорадические случаи заболевания, так и вспышки. Описаны вспышки диареи среди школьников, связанные с РВ-С — в Англии [147] и Японии [392], и семейная вспышка в Бристоле, в которую были вовлечены трое взрослых и трое детей, один из которых в возрасте 4 мес. умер [158]. Это первое описание фатального гастроэнтерита, вызванного ротавиру-сами группы С, которые обычно вызывают у своих хозяев диарею средней тяжести, для которой характерно сочетание с поражением дыхательной системы [88].

Как видно из вышеизложенного, основную массу ротавирусных гастроэнтеритов на территориях разных стран вызывают ротавирусы группы А.

С использованием реакции связывания комплемента, иммуноадгезивной гемагглютинации, реакции нейтрализации, а позднее с применением МКА и анализа первичной структуры гена VP6, по наличию подгруппоспецифического антигена ротавирусы группы, А разделены на 4 серологические подгруппы, обозначаемые — SI, Sil, SI/SII, ни SI/SII [228,363,381,495]. Подгрупповая специфичность штаммов ротавируса определяется детерминантами, расположенными на белке внутреннего капсида VP6 (Рис.1). В то же время, для ротавируса свиней показано наличие антигенных детерминант, определяющих специфичность Sil, на белке VP2 [487]. Ротавирусы животных, за исключением некоторых штаммов РВ свиней, кролика и лошади, относятся к SI подгруппе. Идентифицированы РВ жеребенка шт. Н2 и свиней шт. СС117, имеющие антигенные детерминанты, специфичные для двух подгрупп (SI/II), а также iiit. Fi14 и шт.993/83, выделенные от жеребенка и теленка, соответственно, не имеющие таких эпитопов (ни SI ни Sil) [228,352,381,341].

Типичные РВ человека разделяются на две основные серологические подгруппы вируса — SI и Sil [331,363,495]. Однако, расширение исследований по дифференциации штаммов РВ выявило существование среди ротавирусов человека, циркулирующих в США, Швеции и Индии, изолятов, не реагирующих с МКА, специфичных в отношении SI и Sil подгрупп [221,479,486,508,512] и ряда штаммов AU-1 геногруппы, имеющих детерминанты двух подгрупп — SI и Sil [512].

При параллельном определении антигенной подгруппы клинических изолятов ротавируса и его ЭФ-типа РНК было установлено, что штаммы SI обладают «коротким» профилем миграции сегментов, а Sil — «длинным» [359,373,415]. Впоследствии наличие такой корреляции, свойственной только ротавирусам человека, было подтверждено во многих исследованиях по молекулярной эпидемиологии РВИ, вызванной доминирующими типами вируса [196, 344, 432, 475, 488]. В то же время, появились сообщения об исключениях из этого правила. Первое сообщение, не подтверждающее наличие строгой корреляции между ЭФ-типом РНК и подгрупповой принадлежностью штамма РВ, сделано Ыакадош1 Т. с соавт. в 1985 г., когда был изолирован шт. Аи-1 и ему подобные штаммы, относящиеся к 31 подгруппе, но имеющие по первому определению авторов «длинный» ЭФ-тип РНК. Однако, более пристальный анализ картин распределения сегментов РНК показал их отличие от «длинных» профилей (Рис.2), заключающееся в широком разбеге сегментов 5−6 и 10−11 [366,408,409,412.].

Описаны как единичные находки штаммов подгруппы с «длинным» ЭФ-типом РНК, не относящихся к АИ-1 геногруппе вируса [216,220,479], так и вспышки заболевания. При анализе вспышки РВГЭ в Маниле (Филлипины) выделено 20 таких необычных штаммов, четыре из которых (шт.Ь4, Ь26, Ь27, Ь34) адаптированы к клеткам МА 104 [367]. Среди 55 ротавирусположительных образцов, полученных из штата Манипур (Индия), выявлено 39 изолятов РВ подгруппы с «длинным» ЭФ-типом РНК, 5−6-й сегменты которых располагались на большом расстоянии, что характерно для РВ животных [220,221]. Комплексный анализ 1000 изолятов РВ-А в Италии также позволил обнаружить штаммы с «длинным» профилем РНК — адаптированы к росту на культуре клеток шт. мг85, РА710, РСР5 [215]. Многие такие штаммы ротавируса составили предмет детального изучения. Авторы полагали, что РВ человека подгруппы с «длинным» ЭФ-типом РНК не являются результатом прямой трансмиссии РВ животных к человеку, а возникли как продукты реассортации генов вирусов животных и человека. Возможность возникновения реассортантов, как результата перегруппировки сегментов РНК, показана как в условиях in vivo — при одновременном инфицировании мышей двумя штаммами РВ обезъян [225], так и в условиях in vitro при заражении культуры клеток двумя различными штаммами ротавируса [162,448].

Реассортанты между РВ человека, возникшие в результате перегруппировки сегментов штаммов SI и Sil подгрупп, соответственно с «короткими» и «длинными» ЭФ-типами РНК, встречаются в природе крайне редко и не находят широко распространения. Обнаружено два изолята РВ человека (шт.Аи-84, AU-67) DS-1 геногруп-пы, приобредших ген VP7 из геногруппы Wa [411], и один изолят РВ с «коротким» ЭФ-типом РНК, имеющий специфичность Sil подгруппы [210]. С целью выяснения этого феномена было проведено изучение генотипов ротавируса при коинфицировании клеток МА-104 штаммами DS-1 (SI) и Wa или Р (Sil). Установлено, что реассортанты составляют 14% бляшкообразующего потомства, однако многократное пассирование этих коинфицированных культур приводило к полной потере сегментов штамма донора. По мнению авторов эти результаты могут объяснить, почему реассортанты между ротавируса-ми человека SI и Sil подгрупп так редко выделяются от человека [521] .

Внутри антигенных подгрупп ротавирусы группы, А классифицированы на серотипы. Специфические серотиповые детерминанты, определяющие образование нейтрализующих антител, локализованы на белках наружного капсида VP7 и VP4 [191,342,391], гены которых подвергаются независимой сегрегации [343,498]. Наличие двух белков, определяющих серотиповую специфичность РВ, послужило основанием для введения двух терминов их обозначения. На VII интернациональном конгрессе вирусологов в Эдмонте (1987 г.) серотип ротавируса, определяемый белком VP7, был обозначен как G-серотип (G — гликопротеид), а белком VP4 — как Р-серотип (протеазочувствительный) [191,347]. На основании криптограмм, изначально предложенных Rodger и Holmes (1979 г.), разработана простая и эффективная классификация штаммов ротавируса, которая включает следующую информацию: группа / вид происхождения / место происхождения / обозначение штамма / год / субтип антигена. Пример этой схемы, примененный для хорошо изученного ротавируса обезьян шт. SAH, выглядит следующим образом: А / Si / S. Africa / SA11/ 58 / G3 Р2 SI или, в сокращенном виде — А / SA11 / G3 Р2 SI [191].

Изначально G-серотипы ротавируса определяли с помощью метода обратной нейтрализации на культуре клеток, ELISA и твердофазной ИЭМ с применением гипериммунных антисывороток к отдельным серотипам вируса [119,213,214,527,535]. Более поздние разработки привели к созданию иммуноферментных тест-систем, основанных на МКА к специфическим эпитопам VP7, которые успешно применяются для типирования РВ непосредственно в пробах стула больных и до настоящего времени [127,173,399,496]. Развитие исследований в области молекулярной генетики ротавирусов и детальное изучение гена VP7 штаммов разных серотипов позволили разработать подходы к определению серотипа вируса на основе сравнительного анализа предсказанных аминокислотных последовательностей VP7, создать специфичные в отношении серотипа ДНК-зонды, а впоследствии предложить олигонуклеотидные праймеры для типирования штаммов в процессе полимеразной цепной реакции.

131,200,204,325,328,3 30,413,500] .

Среди ротавирусов группы, А человека и животных к настоящему времени охарактеризовано 14 G-серотипов вируса (Табл.1). Из них пять определены только у ротавирусов животных и птицG5 (РВ свиней iiit. OSU), G7 (РВ цыплят шт. СЬ2, РВ телят шт.993/83), G11 (РВ свиней iht. YM), G13 и G14 (РВ лошадей iht. L338 и шт. П23, соответственно). В человеческих популяциях обнаружены 9 G-серотипов ротавируса, 6 из которых (Gl-4, G8, G9) утверждены Международным комитетом по таксономии вирусов [132,148,149,352,464].

Р-серотипы РВ плохо различаются с использованием гипериммунных сывороток, так как VP4 дает низкий иммунный ответ, по-видимому из-за своего минорного содержания в вирионе. Разработка панелей МКА к VP4 и определение перекрестно реагирующих эпитопов на VP5 и VP8 облегчило задачу Р-типирования штаммов ротавируса, однако такая дифференциация не нашла широкого распространения из-за низкой продукции МКА [191]. При классификации Р-серотипов наибольшее применение нашли молекулярно-генетичес-кие методы исследования: сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена VP4, идентификация Р-серотипов с помощью реассортантов РВ человека и животных, молекулярная гибридизация с использованием ДНК-зондов, цепная полимеразная реакция, что позволило говорить о Р-генотипах вируса, коррелирующих с Р-се-ротиповой принадлежностью штамма [211,434,459,474,499,526].

К настоящему времени среди РВ человека и животных определено не менее 18 аллелей гена VP4, которые обозначались порядковыми номерами по мере их выявления. Такая классификация, впервые предложенная Estes и Choen (1989 г.), является общей для РВ.

Таблица 1.

Характеристика референтных штаммов ротавируса человека.

1 1 1 Штамм 1 Страна год Серотипы 1 ПодЭФ-тип 1 Авторы 1 выде- 1 1 Р/ группа РНК ления С 1 Р Б №а 1 США 1980 1 1 8 1 II Дл 529 |.

1 М37 | Венесуэла 1982 1 1 6 3 II ДЛ 343,493|.

1 К8 | Япония 1977 1 1 9 4 II ДЛ 493,498| 031 | США 1976 2 1 4 2 I кор 528,529| НЫ126 | Венесуэла 1981 2 1 4 2 I кор 329 | 378/37 | Бразилия 1987 2 1 8 1 II дл 389 |.

1 Р 1 США 1974 3 1 8 1 II дл 529 |.

1 УО 1 Япония 1977 3 1 8 1 II ДЛ 514 | ди-1 1 Япония 1982 3 1 9 4 I дл 408,366| РА710 | Италия 1987 3 1 9 4 I дл 215 | мг85 | Италия 1987 3 1 9 4 I Дл 215 | РСР5 | Италия 1984 3 1 9 4 I ДЛ 215 | БТЗ | Англия 1975 4А 1 6 3 II ДЛ 529 | VA70 | Италия 1981 4 В 1 8 1 II Дл 213,214| РА151 | Италия 1987 6 1 9 4 II ДЛ 218,407| РА169 | Италия 1987 6 | - нов II ДЛ 218,219| 69 М | Индонезия 1979 8 | 10 5 I с/кор 337,445| В37, В38| Индонезия 1978 8 | 10 5 I с/кор 103,509| НАЫ166 | Финляндия 1986 8 | - нов I дл 216,219| РА171 | Италия 1987 8 | - нов' II дл 216 | ¦№ 161 | США 1983 9 1 8 1 II дл 169 | Е45 | Япония 1986 9 1 8 1 II ДЛ 328 | Аи-32 Япония 1986 9 1 8 1 II дл 418 | 1321 | Индия 1992 10 I 11 6 I ДЛ 176,183| 116Е | Индия 1992 10 | 11 6 I ДЛ 183,212| Ь26, Ь27| 1 1 Филиппины 1987 12 1 4 1 2 I | 1 ДЛ 367,497| 1.

Р — серотипы, общие с РВ животныхР/- генотипы РВ человека. человека и животных и включает следующие референтные штаммы: Р1.

— NCDV (РВ КРС) — Р2 — SAI1 (РВ обезьян) — РЗ — RRV (РВ обезьян) — Р4 — RV5 (РВ человека): Р5 — UK (РВ КРС) — Рб — Gott-frid (РВ свиней) — Р7 — OSU (РВ свиней) — Р8 — KU (РВ человека) — Р9 — К8 (РВ человека) — PIO — 69 М (РВ человека) — Р11.

— В223 (РВ КРС) — Р12 — Н2 (РВ жеребят) — Р13 — MDR13 (РВ свиней) — Р14 — Lpl4 (РВ овец) — Р15 — К9 (РВ лошадей) — Р16−993/83 (РВ КРС) — Р17 — EB-Sb (РВ мышей) — Р18 — ЕНР (РВ мышей) [182]. Обнаружен изолят ротавируса лошадей шт. L338, характеризующийся уникальной последовательностью гена VP4 [350].

Впервые существование разных серотипов РВ человека группы, А было показано в 1980 г. [119]. С использованием реакции перекрестной нейтрализации с гипериммунными сыворотками Wyatt R. с соавт. идентифицировали 1,2,3 и 4 серотипы РВ человека, которые реально соотносятся со специфическими типами VP7, так как преимущественной реактивностью гипериммунной сыворотки является гликопротеид VP7 [191]. Впоследствии их специфичность была подтверждена с помощью МКА к серотиповым эпитопам VP7 и установлено существование среди VP7 серотипов 1,2 и 4 монотипов вируса, а и b [130,175,496,529]. Одними из наиболее изученных в иммунологическом и генетическом плане являются референтные штаммы РВ человека — Wa (G1 Р8 Sil), Р (G3 Р8 Sil), ST3 (G4 Р6 SII), имеющие «длинный» ЭФ-тип РНК и относящиеся к Wa-геногруппе, и DS-1 (G2 Р4 SI), характеризующийся «коротким» типом миграции сегментов и относящийся к DS-1-геногруппе вируса (Табл.1).

РВ G1−4 серотипов распространены повсеместно и являются основными антигенными вариантами РВ, вызывающими РВГЭ в мире. Результаты ретроспективного изучения распределения серотипов в популяциях РВ в странах Европы, Северной и Южной Америки, Африки и Азии в 1983;88 гг. показали, что чаще всего обнаруживается G1 серотип (53,8%), далее по частоте располагаются G2 (17,8%), G3 (12,1%), G4 (11,1%). Необычные штаммы составляют 5,1% [117]. К настоящему времени отсутствуют сведения о распределении антигенных типов ротавируса, циркулирующего на территории Российской Федерации.

Кроме широко циркулирующих на земном шаре РВ человека, относящихся к Waи DSгеногруппам вируса [409], охарактеризованы ряд штаммов, которые не нашли широкого распространения в популяциях людей и являются или другими серотипами вируса или природными реассортантами РВ человека и животных разных серотипов .

Среди РВ G1 серотипа описан бессимптомный шт. М3 7, являющийся прямым реассортантом РВЧ 1-го и 4-го серотипов. Антисыворотка против РВ М37 нейтрализовала РВЧ nit. Wa и hit. ST3. Анализ ре-ассортантов, полученных in vivo, показал, что шт. М37 имеет VP7 от nit. Wa и VP4 от шт. ST3 — РВ, выделенного от ребенка с бессимптомной формой инфекции [343]. Необычным реассортантным РВ G1 серотипа является и шт. К8, имеющий 97,8% гомологии с УР4-геном РВ кошки nit. Cat2 [493,499]. Генетическое родство РВ человека и РВ кошек было установлено и между РВ человека iiit. AU-l, AU-228 и РВ кошек iht. FRV-1 (99% гомологии аминокислотной последовательности), а также целой серии AU-1 подобных штаммов РА151, РСР5 и MZ58 [351,407]. Следует отметить, что полученные результаты интересны не только в плане выяснения таксономических взаимоотношений между ротавирусами человека и кошек, но и в связи с эпидемиологическими проблемами, связанными с переносом РВ кошек к человеку и обратно и возможностью возникновения эпидемических реассортантных вариантов.

Природные реассортанты обнаружены и для РВ G2 серотипа. При проведении эпидемиологических исследований в Северной Бразилии были изолированы 9 штаммов РВ G2 серотипа, 5 из которых имели «длинный» ЭФ-тип РНК и в ELISA с МКА имели Sil специфичность. Методом гибридизации с 32Р-мРНК uit. Wa (Gl, Sil) и iiit. S2 (G2SI) показано, что необычные штаммы возникли путем реассор-тации, в которой РВ с «длинным» типом РНК заменил свой серо-типспецифический ген и ген 10 на эквивалентные гены G2 РВ с «коротким» ЭФ-типом РНК [389].

Ротавирусы G3 серотипа, встречающиеся в человеческой популяции, могут относиться к Wa-геногруппе (шт.Р, YO — Sil подгруппа), AU-1-геногруппе (шт-AU-l, AU-228, AU-125 — SI подгруппа, имеющие гомологию только с геном VP7 шт. Р), или являться натуральными реассортантами РВ различных антигенных свойств (1iit.MZ58, РСР5, РА710) [215,408,409,416].

Штаммовых вариаций РВЧ G4 серотипа, связанных с подгруппо-вой специфичностью, до настоящего времени не обнаружено. Однако, представляет большой интерес идентификация среди РВ G4 серотипа двух иммунологических подтипов вируса. К росту на культуре клеток адаптированы два наиболее известных штамма G4 серотипа — ST3 (Томас 3) и VA70 [213,529]. В 1985 г. с использованием твердофазной иммуноэлектронной микроскопии было показано, что эти два штамма различаются иммунологически и представляют собой два подтипа — 4А и 4 В, соответственно [214]. Получены гибридомы, продуцирующие нейтрализующие МКА к 4А и 4 В подтипам G4 серотипа вируса. Применение ELISA с использованием таких МКА позволило изучить распространенность природных штаммов G4 серотипа в центральной Европе, Северной и Южной Америке и Австралии. Установлено, что подтип G4A преимущественно циркулировал на всех трех континентах, G4B коциркулировал с G4A только в Италии. Корреляции между ЭФ-типом РНК и принадлежностью штамма к тому или иному подтипу не выявлено. Отмечается, что инфекция, вызванная РВ G4A серотипа может протекать тяжело с явлениями значительной дегидратации [180,217].

В Сицилии (Италия) в сезон 1987;88 гг. от двух детей с гастроэнтеритом выделены два новых штамма РВ (шт.РА 151, РА 152), которые адаптированы к росту на культуре клеток МА104. Реакция перекрестной нейтрализации с типоспецифическими антисыворотками серотипов G1−10 и РНК-РНК гибридизация показали родство этих штаммов с РВ G6 серотипа КРС (шт.ик и NCDV). Генетическое родство с РВ КРС установлено для всех генов, кроме гена VP4, который оказался гомологичным 4-му сегменту РНК изолята AU-228, близкородственному РВ кошек [218,407]. Другой штамм РВ человека G6 серотипа (шт. РА169) также был выделен в Италии, однако он отличался уникальной последовательностью гена VP4 [218,219]. При изучении распространенности AT к РВ изолятов РА151 и РА169 у детей в Эквадоре, сывороточные нейтрализующие AT к РА151 определены в 13% случаев, к РА169 — у 8%. В то же время, ни один из 170 детей с РВГЭ, госпитализированных в Германии, не дал РА151 или РА169 -специфического антительного ответа [152].

Среди изолятов РВ, собранных на территории Индонезии в 1979;81 гг. были выявлены два штамма РВ, характеризующиеся необычным «суперкоротким» ЭФ-типом РНК — шт.69М и шт.57М [337]. Несколько позже австралийские ученые сообщили об обнаружении еще двух подобных изолятов РВ — шт. В37 и В38, которые также были идентифицированы в пробах больных диареей, собранных в Индонезии [103]. Выделенные штаммы, культивированные на клетках МА-104, в серологических реакциях отличались от серотипов G1−4 [103,393]. Изучение генетических взаимоотношений шт.69М и панели РВ человека и РВ животных показало, что шт. б9М имеет средний уровень гомологии с РВ SIG2 антигенного типа с «короткими» ЭФ-типами РНК и со штаммом РВ телят Небраски и не имеет сходства с другими исследованными РВ человека, включая AU-1 геног-руппу вируса [423]. Интересным представляется факт, что структура гена VP7 шт. В37 в регионе-С (208−221 п.н.) гомологична соответствующему региону G3 серотипа вируса, регионы, А и В характеризовались специфической последовательностью нуклеотидов [347]. Полученные результаты свидетельствуют о том, что некоторые эпитопы VP7 могут быть общими у РВ разных серотипов, что может обусловливать перекресты в иммунологической защите при инфекции разными серотипами вируса. На VII интернациональном конгрессе вирусологов в Эдмонте (Канада, 1987 г.) штаммы М69, В37 и В38 были классифицированы как серотип G8. Кроме того, данные штаммы характеризовались уникальной последовательностью гена VP4, которая определяет Р10 серотип ротавируса [445]. Для идентификации штаммов G8 серотипа создана панель нейтрализующих МКА [509]. Ее применение при изучении РВ человека, собранных в Финляндии и Италии выявило 6 (шт.серии HAL) и 1 (шт.РА171), соответственно, изолятов G8 серотипа. При этом, шт. НАЫ166 имел уникальную последовательность гена VP4, гомологичную шт. РА169 и отличающуюся от аллелей Р1−11. Авторы обозначили этот серотип как Р12 [219]. Все 7 европейских штаммов С8 серо-типа имели «длинный» ЭФ-тип РНК, а один (шт.РА171) обладал специфичностью БЫ подгруппы [216]. По всей вероятности, «суперкороткий» ЭФ-тип РНК не является отличительным признаком РВ С8 серотипа, что подтверждается обнаружением такого геномного профиля и у РВ свиней С5 серотипа, произошедшего от своего стандартного двойника в результате геномной реаранжировки 11-го сегмента, сохранившего способность кодировать нормальный белковый продукт [395]. Реаранжировка происходит путем конкатаме-ризации «голова к хвосту» двух копий сегмента с усеченными 3/-и 5/-концами [226,468]. Изучение распространенности АТ к РВ серотипа показало, что в Германии только 2 из 171 (3%) больных и 8 из 147 (5%) лиц контрольной группы имели такие АТ. В отличие от этого, АТ к С8 серотипу РВ обнаружены в крови 232 из 870 (27%) обследованных детей в Эквадоре, что указывает на значительную распространенность данного серотипа РВ в Южной Америке [153].

В Филадельфии (США) из пробы стула 18 мес. ребенка с гастроэнтеритом, выделен штамм РВ человека, отличавшийся в перекрестной реакции нейтрализации от известных к тому времени серотипов вируса и названный № 161. Штамм имел специфичность БП подгруппы и «длинный» ЭФ-тип РНК. На VII интернациональном конгрессе вирусологов в 1987 г. данному штамму присвоен классификационный номер С9. [169]. Получено 9 гибридом, продуцирующих МКА к УР7 № 161, одно из которых специфически реагировало только с белком С9 и было использовано для создания ИФА тест-системы для выявления РВ С9 серотипа [399]. Ротавирусы С9 серотипа выявлены и в Японии. Сообщено о выделении на культуре клеток ШТ. Р45 [328] и шт. Аи-32 [414]. В РНК-РНК гибридизации шт. Аи-32 проявлял высокую степень гомологии со шт.№ 161, Р45 и другими прототипными штаммами, принадлежащими к ДОа-геногруппе, но не к Б5−1 или Аи-1 геногруппам [418]. При изучении распространенности нейтрализующих антител к РВ С9 серотипа среди детей в Южной Африке и Центральной Европе, нейтрализующие сывороточные АТ С9 серотипа выявлены у 41% из 870 детей Эквадора и 26% из 140 немецких детей. Интересным представляется факт, что у 13 детей в Германии, имевших сероконверсию к РВ С9, также наблюдалось четырехкратное повышение титра АТ по крайней мере к одному из С1−4 серотипов ротавируса [151].

Первое сообщение о выделении РВ СЮ серотипа от хронически инфицированного ребенка с иммунодефицитом было сделано в 1992 г. [120]. К настоящему времени охарактеризован ряд таких штаммов — например шт. ИбЕ и 1321, выделенные от новорожденных с бессимптомной формой инфекции в Индии, и шт. Мс35 — в Японии. Все эти штаммы проявляли высокую степень гомологии с РНК РВ быка шт. В223, в том числе и по гену /Р4, что позволило отнести их к Р11 серотипу вируса [176,183,212,513].

При изучении причин диареи у детей на Филиппинах в г. Маниле в период 1987;88 гг. были собраны 20 необычных изолятов РВ группы, А подгруппы с «длинным» ЭФ-типом РНК, четыре из которых адаптированы к росту на клетках МА104 (шт.Ь4, Ь26, Ь27, Ь34). Серологически штаммы отличались от известных серотипов РВ человека и С5, С6 серотипов РВ животных [517]. Анализ аминокислотной последовательности Л?7 шт. 11,26 и Ь27 позволил сделать вывод о новом С12 серотипе РВ человека [497].

Многообразие Р-серологических типов РВ, распространенных среди людей и животных послужило основанием составления для ро-тавирусов человека своей классификации Р-типов вируса. Первые три варианта VP4 установлены при сравнительном анализе первичной структуры гена VP4 референтных штаммов РВ человека, выделенных от больных с манифестной формой РВГЭ (niT.Wa, DS1, Р, Va70) и от детей с бессимптомной формой инфекции (шт.М37, 1076, McN13, ST3). Определены два типа VP4 среди вирулентных и один тип, характерный для авирулентных штаммов ротавируса [227,230]. Эти результаты впоследствии позволили говорить о Wa-подобных (Р1), DS1-подобных (Р2) и М37-подобных (РЗ) аллелях гена VP4, которые соответствуют Р8, Р4 и Рб серотипам в классификации Estes, Choen [191,407]. AU-1 аллель гена VP4, соответствующая Р9 серотипу РВ, обозначена как Р4 [351,407], уникальная аллель шт.69М, соответствующая Р10 серотипу — как Р5 аллель [445], асимптоматическая аллель, соответствующая Р11 РВ быка — как Рб [176,212].

Анализ взаимоотношений G и Р серотипов у РВ человека показал, что Wa-аллель (Р1) симптоматических РВ связана с Gl, G3, G4 и G9- DS-1-аллель (Р2) ассоциирует с G2 и G12- М37-аллель (РЗ) бессимптомных РВ — G1−4- 69М-аллель (Р5) — с G8 и Рбс G10 (Табл.1). Распространенность Р серотипов РВ человека на территориях разных стран находится в стадии изучения. Сообщено, что в США предоминируют штаммы P1G1 антигенного типа (71%), P1G3 составляют 20%, P1G4 и P2G2 — по 2%, бессимптомные аллели P3G1 и P3G2 определены в 1% случаев, смешанные типы — в 3%, 2% штаммов с РЗ генотипом (P3G1 и P3G2) ассоциированы у детей с тяжелой дегидратирующей диареей [466].

Вопрос взаимосвязи между генетическими и антигенными характеристиками штаммов ротавируса и особенностями клинических проявлений РВГЭ к настоящему времени остается открытым. Результаты изучения основных клинических симптомов при РВГЭ, вызванных РВ разных С-серотипов неоднозначны, а их взаимоотношения с Р-серо-типовой специфичностью штаммов — немногочисленны и не позволяют сделать окончательные выводы.

Особенности циркуляции ротавирусов группы А.

Предоминирование ротавирусов С1 серотипа и меньший процент выявления вариантов в2 серотипа с «коротким» ЭФ-типом РНК является нормой во всем мире. В то же время, наблюдения за циркуляцией природных штаммов РВ человека основных С1−4 серотипов, проведенные на территориях разных стран, показали, что их распределение в разных географических зонах может колебаться в широких пределах [122,130,414,432,466,516] и меняться во времени. Так, например, в Буэнос-Айресе (Аргентина) в сезон 1983;84 гг. наиболее часто выявлялись и СЗ серотипы вируса, а в 1985;86 гг.- они уже не определялись [224]. В Ямагате (Япония) в 1986 г. доминировал серотип (45,6%), доля которого к.

1989 г. снизилась до 1,6%, а доминирующее положение заняли штаммы С1 специфичности [410]. В Палермо (Италия) и других европейских странах в период 1985;89 гг. штаммы СЗ практически отсутствовали, а штаммы С2 серотипа циркулировали нерегулярно [108,216]. Эти и другие подобные исследования свидетельствуют о временном перераспределении серотипов ротавируса в популяциях и существовании межсезонной смены их доминирования. В связи с этим, стратегия вакцинации против РВГЭ, кроме формирования надежного иммунитета ко всем 4-м серотипам вируса, должна учитывать и их относительное перераспределение во времени [129].

Закономерности циркуляции РВ разных С-серотипов вируса до конца не изучены, так как их установление возможно только при длительных наблюдениях, которых проведено еще недостаточно. Сообщено о 6-ти летнем изучении циркуляции генетических и антигенных типов ротавируса в Индии, 9-ти летнем в Англии, 10-летнем в Америке и 15-ти летнем наблюдении в Австралии [102,122,130,390]. Дифференциация штаммов РВ на одной территории в течение нескольких эпидпериодов выявила некоторые особенности длительности доминирования РВ разных С-серотипов. Так, штаммы С1 серотипа предоминировали 4 года в Мехико, 3 года в Хьюстоне, а в Центральной Америке — каждый год в течение 10 сезонов наблюдения [432,431,390]. В то же время, РВ серотипа могли обнаруживаться постоянно в течение 4 сезонов с частотой 3,5−11% [410], а могли выявляться нерегулярно [108]. Однако следует отметить, что немногочисленные данные еще не позволяют составить представление о закономерностях циркуляции генетических вариантов РВ разных С-серотипов, для чего необходимы дальнейшие наблюдения в течение как можно более продолжительного периода времени и на разных территориях.

Иммунитет при ротавирусной инфекции.

Иммунитет к РВ может быть активным или пассивным, гуморальным или клеточным, протективным или непротективным, гомотипи-ческим или гетеротипическим, мукозным или системным, или быть их комбинацией. Иммунный ответ при первичной РВИ развивается по классическому типу с образованием сывороточных 1 дМ, 1дв, 1дА и интестинальных, слюнных и молозивных 1дА-АТ. Инфекция РВ также индуцирует формирование вирусспецифических цитотоксических лимфоцитов в селезенке, Пейеровых бляшках, лимфатических узлах брызжейки [192,403,424,428].

1дМ-АТ появляются в сыворотке крови с 3-го дня болезни, персистируя до 5-й недели- 1дС-АТ обнаруживаются после 10-го дня и сохраняются в течение нескольких лет- 1дА-АТ имеют одинаковую кинетику при любой локализации, при этом кишечные 1дА могут превышать базисные титры более, чем в 10 раз и через 270−365 дней после инфекции [124,403]. Кинетика и интенсивность класс-специфического АТ-ответа различна для четырех структурных белков ротавириона [452].

Системный иммунный ответ отражает контакт с вирусом, но вероятно имеет малое значение в защите от заболевания, определяющую роль в которой играет местный иммунитет кишечника. Более высокая невосприимчивость к инфекции, возникающая ко-второму году жизни, в основном создается секреторными 1дА-АТ. При этом способностью индуцировать ротавирусспецифические нейтрализующие АТ обладают как Л?7, так и /Р4 [110,192,403,424,426].

При инфекции, вызванной одним из серотипов РВ может наблюдаться образование как гомологичных, так и гетерологичных АТ, причем гомотипическая защита более продолжительна, чем гетеро-типическая. Известны случаи повторного инфицирования болевших РВГЭ ротавирусом другого серотипа. На распространенность симптоматической реинфекции, как правило, влияет природа циркулирующих штаммов РВ и для достижения 100% 1дА-конверсии должно произойти 3 реинфекции ротавирусом [106,174,403,424].

Разработка вакцины.

Значимость РВГЭ в кишечной инфекционной патологии детей раннего возраста определила необходимость принятия усилий, направленных на разработку вакцины против ротавируса. На первых этапах таких разработок были предприняты попытки создания живых аттенуированных оральных вакцин.

На основе гетерологичных РВ (животных), адаптированных к тканевым культурам, были созданы вакцины И1Т4237, №СЗ (РВ КРС Сб серотипа) и (РВ резусов). Испытание вакцин И1Т4237 и №С3 в различных развитых и развивающихся странах показало их недостаточную иммуногенность и эффективность, в связи с чем они были изъяты изготовителем [73,125,522]. В то же время, иммунизация реассортантным штаммом № 179−9 С1 серотипа, созданным на основе РВ №СЗ, влияла на частоту возникновения РВГЭ, продолжительность диареи, лихорадки и других проявлений, связанных с заболеванием. Введенный перорально, штамм не вызывал побочных явлений и индуцировал образование нейтрализующих АТ к серотипам С1−6 [167,168]. Вакцина из РВ резусов 1ШУ-1 при испытаниях обладала разной эффективностью в развитых и развивающихся странах. В Швеции при первом испытании вакцина обеспечивала 48% защиты от РВ диарей и 100% защиты от тяжелых случаев, в Вене-суэлле — 64% и 90%, соответственно, в США — 0%. При этом, в ряде случаев отмечалось наличие высоких температурных реакций после вакцинации. [73,323,438,439,441].

Вакцина М13, созданная на основе бессимптомного человеческого РВ серотипа, отличающегося от вирулентных штаммов модификацией УР4, имела низкую иммуногенность и не вызывала хорошего ответа в виде гетерологичных антител [73]. Позднее был предложен другой потенциальный кандидат в вакцинные штаммы — РВ, выделенный от ребенка с бессимптомной формой инфекции, родственный СЮ серотипу РВ крупного рогатого скота [326].

Недостаточная эффективность вакцин на основе РВ животных и бессимптомных штаммов РВ человека, а также существование 4-х основных для РВ человека серотипов, определили необходимость проведения дальнейших исследований. Наиболее перспективным признана стратегия вакцинации «Дженерия», суть которой заключается в создании тетравалентной вакцины на основе рекомбинантных РВ резусов (ИИУ) и резусов-человека с применением широкого антигенного спектра. Четырехвалентная вакцина построена из РВ обезьян резусов (шт.ММи 18 006) в антигенном отношении идентичного РВ человека СЗ серотипа, и трех реассортантов шт. ИКУ (10 генов) и РВ человека С1, в2 и серотипов (1 ген).

364,439]. Испытание такой тетравалентной вакцины в Венесуэлле показало эффективность ее применения — 73−79% вакцинированных детей имели нейтрализующие антитела к С1−4 после введения любой дозы вакцины [438,439]. Эффективность применения комплексной вакцины на основе 4-х серотипов РВ может быть повышена путем ревакцинации с использованием ИИУ — ММ1И8006, способного вызывать формирование гетеротипических антител, и РВ С2 серотипа [163]. В этом плане интересными представляются исследования новых методик презентации АГ ротавируса в кишечнике — например посредством капсул, липосом и т. д. Показано, что комбинация ал-гината натрия и гидрохлорида спермина или хондроитинсульфата натрия и гидрохлорида спермина способны образовывать капсулы, фиксирующие инфекционный РВ и способствующие его персистенции в лимфоидной ткани кишечника после оральной инокуляции, что оказалось значительно более эффективно по сравнению с введением одного вируса [424,429]. Проводятся испытания иммуногенности и реактогенности тетравалентной вакцины в комбинации с оральной и инактивированной полиовирусной вакцинами. Показана перспективность дальнейших исследований с целью оценки возможности приема RRV-вакцины в наивысшей дозировке в рамках РПИ [73,353]. В настоящее время стратегия вакцинации на основе RRV-вакцины развивается в направлении включения в нее не только VP7, но и VP4, который также индуцирует образование нейтрализующих антител. Предполагается использовать холодоадаптированные реассортантные штаммы РВ человека или реассортантные штаммы, в которых отдельные гены VP4 РВ человека замещены генами РВ животных [364].

Предпринимаются попытки реализации альтернативных подходов к разработке противоротавирусной вакцины. Сообщено о возможности иммунизации синтетическими VP-пептидами, и VP4, экспрессиро-ванными в бакуловирусе и вызывающими образование вируснейтрали-зующих АТ [105,387,483]. В то же время, применение в качестве субъединичной вакцины пустых капсидов, содержащих VP7, не приводило к индукции значительного количества нейтрализующих АТ [150]. Однако, при использовании техники рекомбинации получена экспрессия вирусом осповакцины модифицированной формы VP7, имеющей домен гемагглютинина вируса гриппа, что приводило к «зая-кориванию» белка на поверхности чувствительной клетки. При заражении мышей и кроликов рекомбинантным вирусом осповакцины у них продуцировались ротавирусспецифические АТ в титрах, 100-кратно превышающих уровень АТ, продуцируемый при заражении диким типом РВ [104].

Лечение ротавирусного гастроэнтерита.

Известно, что применение антибактериальных препаратов, особенно антибиотиков, при ротавирусных гастроэнтеритах показало не только их полную неэффективность, но и вредность, так как способствовало углублению явлений дисбактериоза. Долгое время терапия РВГЭ являлась патогенетической, основной целью которой была борьба с дегидратацией, токсикозом и связанными с ними, наиболее часто встречающимися при РВГЭ, нарушениями функций жизненноважных органов [13,40,66,82]. На фоне проведения базовой терапии, основанной на компенсации водно-солевых потерь и диете, хорошо себя зарекомендовало применение биопрепаратов. Использование коммерческих препаратов бифидобактерий оказывало положительное влияние на длительность дисфункции кишечника, сроки возврата массы тела к первоначальному уровню и приводило к снижению длительности выделения вируса [66]. На базе московской детской инфекционной больницы N5 успешные испытания при лечении ОКИ у детей прошел новый препарат «аципол», представляющий собой смесь четырех штаммов ацидофильных бактерий и биомассы кефирных грибов. Полный клинический эффект при лечении аци-полом был достигнут в 91,2%, его прменение приводило к двукратному уменьшению сроков диареи [49]. В основе положительного влияния на течение РВГЭ биопрепаратов лежит эффект нормализации микрофлоры кишечника. В то же время, представлены данные, свидетельствующие, что некоторые штаммы нормальной микрофлоры кишечника способны оказывать при РВГЭ специфический эффект. Например, штаммы E. coli М37 и 33/29 вызывают деструктивную адсорбцию ротавирионов на клеточной поверхности [101], а применение молока, ферментированного лактобактериями шт. LGG приводит к усилению секреции IgA и сокращению сроков диареи до 1 суток [356].

Положительным эффектом при РВГЭ обладают ряд сорбентов. Так, энтеральный сорбент Энтеросгель (гидрогель метилкремние-вой кислоты) способен эффективно адсорбировать ротавирусы человека и животных в условиях in vitro. Полученные авторами данные могут служить экспериментальной базой для клинического испытания Энтеросгеля при лечении ротавирусных диарей [4]. Проведено сравнительное изучение эффективности нового отечественного угольного энтеросорбента микросорба-П у детей с ОКИ разной этиологии, в том числе и ротавирусной. Применение препарата приводит к уменьшению проявлений интоксикации и длительности основных симптомов ОКИ [25].

До недавнего времени этиотропные противоротавирусные препараты для лечения больных с РВГЭ отсутствовали. Были проведены исследования по использованию концентратов молока, полученного от коров, иммунизированных РВ четырех основных серотипов, показавшие, что применение таких препаратов защищает от возникновения РВИ, снижает продолжительность экскреции вируса, но не влияет на продолжительность диареи [154,177,186,340]. В то же время, описаны примеры успешного лечения РВ диареи с использованием коммерческих препаратов иммуноглобулинов. Дуоденальное введение специфичного в отношении РВ Ig предотвращало выделение вируса через 24 часа [333]. В нашей стране, в рамках программы государственных испытаний, проведено изучение эффективности эн-терального применения при лечении РВГЭ титрованного человеческого иммуноглобулина. Установлено значительное сокращение сроков исчезновения интоксикации и нормализации стула, которые колебались в пределах 1,8−2 дня и 2,8 — 3 дня, соответственно. Уровень вирусологической санации составил 63,0%. Проведенные испытания позволили разработчикам рекомендовать широкое внедрение противоротавирусного 1д человека для энтерального применения при лечении ротавирусной инфекции у детей [91].

Несомненной эффективностью и целесообразностью использования характеризуется применение при РВИ и смешанных вирусно-бак-териальных кишечных инфекциях у детей рекомбинантногоинтерферона. Ректальное и энтеральное использование реальдирона, ре-аферона или энтальферона дает положительные сдвиги на 2-е сутки лечения [64,92].

Таким образом, к настоящему времени получены достаточно полные, хотя и не исчерпывающие, сведения о значимости РВГЭ в инфекционной кишечной патологии особенно детей младшего возраста, клинических и эпидемиологических проявлениях ротавирусной инфекции, генетическом и антигенном разнообразии штаммов рота-вируса, циркулирующих в разных географических регионах земного шара. В то же время, природные штаммы ротавируса человека и особенности их циркуляции на территории Российской Федерации охарактеризованы недостаточно в силу отсутствия отечественных систем для их дифференциации. В связи с этим, настоящая работа посвящена изучению генетического и антигенного разнообразия ро-тавирусов человека, распространенных на территории европейской части Российской Федерации и комплексной характеристике РВИ с применением молекулярно-генетических методов исследования.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе исследовано 9 023 пробы стула больных ОКИНЭ детей в возрасте до 14 лет, поступавших из инфекционных стационаров г. Н.Новгорода и центров СЭН 14-ти городов, расположенных на европейской территории России, в период с 1984 по 1997 гг.

Проанализировано 564 истории болезни детей, выделявших ро-тавирусыисследовано 120 образцов смывов носа и глотки от больных РВГЭ, ОКИНЭ, ОРЗ и здоровых, а также 50 проб водных концентратов, предоставленных Нижегородским областным центром ГСЭН.

Электронная микроскопия.

Суспензию фекалий в растворе Хенкса (2 0%) осветляли центрифугированием при 2 тыс.об./мин. в течение 20 минут. Су-пернатант наносили на клистронные сетки, покрытые парлодиевой пленкой-подложкой, применяя метод флотации [54]. Препараты контрастировали 2% фосфорновольфрамовой кислотой (рН 4,0) или 1% водным раствором уранилацетата (рН 4,5). Сетки прос.

Автор выражает глубокую признательность: Домбровской Л. К., Душкину В. Н., Альтовой Е. Е., Животовскому М. В. (Нижний Новгород), Закировой С. Ф. (Екатеринбург), Васильеву Б. Я. (Санкт-Петербург), Козловской Г. А., Таранцевой Л. П. (Липецк), Луки-ной А.И. (Пермь), Боголицину Ю. Г., Чечуевой Л. И. (Архангельск), Сергееву Н. И., Васильевой И. В., Салимовой Х. И., Ушнурце-вой A.B. (Йошкар-Ола), Першеву В. В., Георгиевой В. П. (Чебоксары), Чудову И. А. (Саранск), Чупровой А. Б. (Дзержинск), предоставивших пробы стула детей с ОКИНЭ для исследования. матривали на электронном микроскопе ЗЕМ-100 СХ («JEOL», Япония) при ускоряющем напряжении 80 kV и инструментальном увеличении 53 ООО.

Выделение РНК ротавирусов из копроматериала.

Экстракцию РНК непосредственно из проб стула больных ОКИНЭ проводили с использованием предложенного нами методического подхода. Пробу фекалий (0,3−0,5 г) суспендировали в 3 мл экстрагирующего буфера, содержащего 0,03 М CH3COONa, 0,3 М NaCl, 4 мМ ЭДТА, 1% ДСН, рН 5,2, инкубировали 10 мин. в водяной бане при 60 0 С, периодически интенсивно встряхивая, добавляли NaCl до конечной концентрации 0,9−1,2 М. Пробы охлаждали при -4 °С в течение 30 мин. и осветляли центрифугированием при 5 тыс.об./мин. и 2 °C в течение 20 мин. Супернатант отбирали в центрифужную пробирку, добавляли 0,1 объема 3 М CH3COONa, 0,6 объема изопропилового спирта и центрифугировали при 5−10 тыс.об./мин. в течение 20−10 мин. при комнатной температуре. Осадки РНК высушивали при 37 °C в течение 10−30 мин. и растворяли в 100 мкл буфера (62 мМ трис-НС1, 1 мМ ЭДТА, 1% ДСН, 15% глицерина, 0,005% бромфенолового синего, рН 6,8). Для электрофореза использовали 10 мкл раствора РНК, который мог храниться при -20 °С в течение более 5 лет.

Для получения 32Р-РНК природных изолятов ротавируса и исследования РНК в реакции молекулярной гибридизации проводили очистку раствора РНК с использованием водонасыщенный фенол (рН 5,2): хлороформенной (1:1) депротеинизации согласно стандартным процедурам [61]. Применяли ЭДТА, ДСН и трис-HCl производства фирмы «Serva» (Германия).

Получение РНК культивируемых кишечных вирусов.

Использовали следующие культивируемые штаммы кишечных вирусов: ротавирус обезьян шт. SAH (S1,G3 антигенный тип), полученный в Институте ветеринарии ВАСХНИЛротавирус телят шт. Линкольн (SI, G6 антигенный тип), предоставленный Санкт-Петербургским НИИЭМ им. Пастераротавирус человека iiit. DS-1 р1020/2−84 (SI, G2 антигенный тип) любезно предоставленный К.-А. Петерсон (Национальная бактериологическая лаборатория Швеции) при содействии Л. А. Анисимовой (ИБФМ РАН, Пущино на Оке) через проф. Олу Сколд (Биохимический центр г. Уппсала, Швеция) — вакцинный штамм полиовируса Сэбин I, полученный в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМНвирус гепатита A hit. HAS-15, культивируемый в Нижегородском НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ РФ.

Ротавирусы обезьян и телят наращивали на клетках почки эмбриона свиньи (СПЭВ) с питательной средой N 199 на растворе Эрла, содержащей 1 мкг/мл трипсина («Serva», Германия). Перед заражением монослоя ротавирусы активировали трипсином в концентрации 30 мг/мл в течение 30 мин. при 37 °C. После достижения полного цитопатического эффекта (24−48 час.), вируссо-держащую культуральную жидкость трижды замораживали-оттаивали и использовали для получения днРНК [63].

Биомассу полиовируса наращивали на монослое перевиваемой культуры клеток Нер-2 на матрацах при 33−35 °С в течение 48 часов до достижения полного цитопатического эффекта. Культуральную жидкость трижды замораживали-оттаивали и использовали для получения РНК.

Культуральная жидкость, содержащая вирус гепатита А, была любезно предоставлена К. В. Блохиным (лаборатория вирусных гепатитов Нижегородского НИИЭМ).

Для целей электрофоретипирования и исследования в реакции молекулярной гибридизации РНК ротавируса, полиовируса и вируса гепатита, А выделяли непосредственно из культуральной жидкости после инкубации при 37 0 С в течение 15 мин. в присутствии 1% ДСН, с использованием фенол: хлороформенной депротеинизации. РНК преципитировали изопропиловым спиртом как описано выше и растворяли в 100 мкл буфера для электрофореза или 100 мкл ТЕ буфера (10 мМ трис-HCl, рн 8,0, 1 мМ ЭДТА).

С целью получения 32Р-РНК ротавируса SA11, выделение днРНК проводили из ротавирионов, концентрированных ПЭГ60оо («Serva», Германия) из 100 мл культуральной жидкости и очищенных в градиенте 30−60% глицерина при 80 тыс.об./мин. в течение 1 часа при 4 °C [361]. Отбирали опалесцирующую фракцию ротавирионов, диализовали против ТЕ буфера рН 8,0, содержащего 2 мМ СаС12 и использовали для экстракции РНК методом фенольной депротеинизации .

Электрофорез РНК в полиакриламидном геле (ПЛАТ).

Использовали набор реагентов для электрофореза в ПААГ фирмы «Reanal» (Венгрия).

Применяли систему буферных растворов Лэммли [374], состоящую из: электродного буфера (0,025 М трис-HCl, рН 8,4, 0,192 М глицин, 1% ДСН), буфера для нижнего геля (1,5 М трис-HCl, рН 8,8, 0,4% ДСН), буфера для верхнего геля (0,5 М трис-HCl, рН 6,8, 0,4 ДСН). Кроме того, использовали трис-боратный буферный раствор в концентрации 0,089 М, рН 8,3, для электродного буфера и 0,89 М, pH 8,3 — для приготовления ПААГ.

Электрофорез проводили в тонком слое 7,5%, 10%, 12,5% разделяющего и 3% концентрирующего ПААГ, при 10 мА и 50 мА в течение 18-ти и 3-х часов, соответственно.

После электрофореза гели окрашивали в водном растворе бромида этидия (5 мкг/мл) в течение 15 мин. и фотографировали в ультрафиолетовом свете на фотопленку РФ-3 или «Тасма» -64.

Окраску гелей нитратом серебра осуществляли по методу, описанному Svensson L. с соавт. [488], в нашей модификации: непосредственно после электрофореза гель помещали на 40 мин. в 0,19% раствор AgN03, промывали дистиллированной водой и помещали в восстанавливающий раствор (0,75 М NaOH, 0,3% формальдегид) до появления темных полос на желтом фоне. Развитие окраски останавливали, погружая гель в 5%-ный раствор уксусной кислоты .

Для хранения гели высушивали. С этой целью пластину ПААГ выдерживали в течение часа в растворе, содержащем 3 0 частей воды, 10 частей этилового спирта, 1 часть уксусной кислоты, 2 0% глицерина и помещали на стекло между двумя листами целлофана, смоченного тем же раствором.

РНК-РНК блот-гибридизация.

После электрофореза сегменты РНК ротавирусов переносили на нейлоновую мембрану «Zeta-probe» («Bio-Rad») с использованием щелочного нисходящего метода [377]. Последовательность операций включала экспозицию геля в растворе 0,025 н HCl в течение 10 мин., собственно перенос РНК на мембрану в течение 40−60 мин. с использованием 0,2 н NaOH, нейтрализацию мембраны в растворе х2.

SSC (1 M NaCl, 0,03 M цитрата Na) два раза по 15 мин. и вакуумную иммобилизацию РНК на фильтре при 80 °C в течение 2-х часов .

Включение радиоактивной метки на З7-ОН концы днРНК-зонда осуществляли как описано [69], используя 5/-[32Р]-цитидиндифос-фат (ПО «Изотоп», Ташкент) и Т4-РНК-лигазу (НПО «Фермент», Вильнюс). Реакционную смесь, содержащую 0,05 М HEPES, рН 7,5, 15 мМ MgClg, 3,3 мМ ДТТ, 10 мкг/мл БСА, 10% ДМБО, 10 мкг РНК, 1 мМ АТФ, 35 мкКи 5Х-[32Р]-ЦДФ и 5 е.а. Т4-РНК-лигазы выдерживали в течение ночи при 0 °C, после чего днРНК преципитировали спиртом и использовали в качестве РНК-зонда.

Гибридизационный анализ проводили с использованием стандартной процедуры, включающей предгибридизацию, гибридизацию иммобилизованной РНК с РНК «зонда» при 65 °C, отмывку несвязав-шегося «зонда», проводимую при температуре гибридизации, и радиоавтографию [61,377,378]. Использовали рентгеновскую пленку РМ-1, экспонирование проводили в кассетах с усиливающими экранами при -20 °С в течение суток.

Синтез кДНК, ее клонирование и анализ.

В качестве матрицы для синтеза кДНК использовали днРНК природных изолятов ротавируса человека, выделенную непосредственно иэ проб стула больных ротавирусным гастроэнтеритом методом фе-нольной депротеинизации.

Очистку днРНК от примесей ДНК проводили разработанным нами способом. Осадок днРНК растворяли в 1 мл буфера, содержащего 0,01 М трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ МдС12, 0,3 — 0,5 М NaCl, 5−20 мкг/мл панкреатической ДНК-азы («Serva», Германия) и инкубировали в течение 20−30 мин. при 25 °C. После реакции смесь деп-ротеинизировали фенолом, РНК из водной фазы преципитировали изопропанолом как описано выше. Качество очистки, сохранность днРНК ротавирусов и ее концентрацию контролировали методом электрофореза в ПААГ.

В качестве матрицы для синтеза кДНК, который проводили несколькими способами, использовали как тотальную днРНК, так и отдельные сегменты ротавирусного генома.

1. Осуществляли схему синтеза, предложенную МсСгае М.А., МсСогдиос1а1е а.С. [396], в совместной работе с к.б.н. Л. А. Кулаковым .

Применяли: поли-А-полимеразу, терминальную дезоксинуклеоти-дилтрансферазу (ДНТФазу), дезокситрифосфаты и оНдо-сат^ 218 производства НПО «Вектор», Новосибирскэндонуклеазы рестрикции РэЫ, ЕсоЯI, Я1гг<3111, Ва131, фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I, плазмидную ДНК риС9, 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-^-Б-галактозид (Х-да1), изопропил-Б-тиогалактопиранозид (1РТС) производства НПО «Фермент», Вильнюсобратную транскриптазу из вируса миелобластоза птиц (АМУ) и РНазин производства Омутнинского химического завода. днРНК (5−10 мкг) в 100 мкл Н20дист денатурировали при 100 °C в течение 5 мин. и охлаждали при 0 °C. Реакцию полиаде-нилирования З7-концов осуществляли при 37 0 С в буфере, содержащем 50 мМ трис-НС1, рН 7,9, 10 мМ МдС12, 2,5 мМ МпС12, 20 мМ ИаС1, 50 мкг/мл БСА, 0,1 мМ АТФ и 0,5 мкг поли-А-полимеразы в течение 10 мин. После реакции полиаденилирования смесь обрабатывали фенолом, РНК преципитировали спиртом, растворяли в ТЕ буфере, добавляли 5 мкг олиго-<1Т1 2 1 8, денатурировали при 100.

С в течение 3-х мин. и охлаждали во льду. Синтез кДНК проводили в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCl, рН 8,3, 50 мМ КС1, 10 мМ МдС12, 10 мМ ДТТ, 4 мМ пирофосфата натрия, по 5 мМ каждого dNTP в объеме реакционной смеси 100 мкл. Добавляли 25 е.a. AMV, 20 е.а. РНазина и инкубировали 2 часа при 42 °C. Цепи РНК удаляли щелочным гидролизом (0,25 М NaOH 20 мин. при 70 °С), ДНК осаждали спиртом и растворяли в 50 мкл ТЕ буфера. Для получения днДНК, препарат прогревали в течение 2-х мин. при 100 °C, добавляли NaCl до концентрации 0,2 М и отжигали комплементарные цепи ДНК 30 мин. при 65 °C, 60 мин. при 50 °C, 30 мин. при 40 0 С, днДНК осаждали спиртом. Двунитевую кДНК достраивали до тупых концов с помощью фрагмента Кленова по стандартной методике [61]. Реакцию достройки поли-С-коннекторов проводили при 37 0 С в течение 30 мин. в буфере следующего состава: 0,2 М какодилата Na, рН 7,9, 8 мМ МдС12, 1 мМ^{-меркаптоэтанола,} 2 мМ dCTP, 0,5 мкг кДНК и 20 е.а. ДНТФазы.

Клонирование кДНК осуществляли в векторной плазмиде pUC9 по Pstl-сайту. К линеализованной с использованием эндонуклеазы рестрикции PstI плазмиде достраивали поли-С-коннекторы, как указано выше (за исключением того, что вместо dCTP брали dGTP, а вместо МдС12 — СоС12). Плазмидную ДНК и кДНК смешивали в эк-вимолярных соотношениях в 20 мкл буфера, содержащего 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА, 0,1 М NaCl, инкубировали 5 мин. при 65 °C, затем 2 часа при 42 °C и охлаждали во льду. Полученным препаратом ДНК трансформировали компетентные клетки E. coli Z85, используя стандартный метод Са2±трансформации [61], которые высевали на агаризованную питательную среду, содержащую 100 мкг/мл ампициллина 0,004% X-gal и 40 мМ IPTG. Выросшие при.

37 0 С трансформанты белого цвета лизировали в щелочном растворе, состоящем из 50 мМ NaOH, 0,5% ДСН, 5 мМ ЭДТА при 68 °C в течение 60 мин. [Barness, 1977] и анализировали в геле 1% агарозы с низким эндоосмосом («Serva», Германия) с использованием трис-боратного буферного раствора, рН 8,3, при 100 V в течение 1,5 часа. Отбирали трансформанты, имеющие плазмидные ДНК большего размера, чем ДНК вектора, из которых выделяли рекомбинант-ные плазмиды с использованием известных методов [60,61].

Анализировали наличие восстановленных сайтов для PstI и размер вставок кДНК. С этой целью выделенные рекомбинантные плазмидные ДНК расщепляли PstI в буфере, содержащем 50 мМ NaCl, 10 мМ трис-НС1, рН 7,5, 10 мМ MgClg, 1 мМ ДТТ, 2 е.a. PstI на 1 мкг ДНК, при 37 °C в течение часа и анализировали в 1% ага-розном геле, используя в качестве маркеров размерности сегменты геномной днРНК ротавируса и ДНК фага лямбда, расщепленную эндо-нуклеазами рестрикции EcoRI и HindIII (НПО Фермент", Вильнюс). Отбирали плазмидные ДНК, имеющие вставки кДНК размером 0,5 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.) и больше.

Идентификацию кДНК с сегментами генома ротавируса проводили методом блот-гибридизации. С этой целью сегменты генома ротавируса разделяли электрофорезом в ПААГ и переносили на нейлоновую мембрану, как описано выше. Отдельно проводили разделение 7-го и 8-го сегментов РНК в пластине ПААГ высотой 40 см при 30 v на гель в течение 20 часов. Полученные блоты гибридизовали с отобранными плазмидными ДНК, меченными 32P-dATP в процессе ник-трансляции с использованием реагентов НПЦ «Биопол», Москва [35,61]. После гибридизации и радиоавтографии мембранные блоты отмывали 2 раза по 20 мин. в х0,1 SSC, содержащем 0,1% ДСН при.

95 °C и повторно гибридизовали с днРНК ротавируса шт. SAH, меченной в процессе Т4-РНК-лигазной реакции. Вставки кДНК с сегментами генома ротавируса идентифицировали путем совмещения двух радиоавтографов.

Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК, комплементарных 7-му и б-му сегментам РВ генома проводили в рамках совместной работы с Л. А. Кулаковым и В. Н. Ксензенко на базе Института физиологии и биохимии микроорганизмов РАН (ИБФМ), г. Пущино на Оке.

На основе полноразмерных ДНК-копий, клонированных в векторной плазмиде pUC9 по PstI сайту, получали производные фрагменты, укороченные с HindIII и ScoRI концов с использованием нуклеазы Bai31. Реакцию проводили в 20 мкл раствора, содержащего 20 мМ трис-НС1, pH 7,3, 0,6 М NaCl, 12,5 мМ МдС12, 12,5 мМ СаС12 при 30 °C в течение 10 мин. После реакции препараты подвергали электрофорезу в 0,9% агарозе, набор укороченных фрагментов вырезали и элюировали из геля с помощью электроэлю-ции. Полученные фрагменты кДНК клонировали в векторной плазмиде pUC9 по стандартным методикам [61].

На следующем этапе работы исходные рекомбинантные плазмид-ные ДНК, а также плазмиды с производными фрагментами кДНК, гид-ролизовали с использованием Hindlll или EcoRI, проводили концевое мечение ДНК [ <Л-3 2 Р ]dATP в реакции с фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I, выделение и очистку меченных фрагментов ДНК как описано [61]. Нуклеотидную последовательность меченых фрагментов определяли по методу Максама-Гилберта [60].

2. Синтез ДНК, комплементарной гену VP6 РВ с «коротким» ЭФ-типом РНК, проводили на матрице РНК б-го гена, выделенного из ПААГ после электрофореза. С этой целью очищенную с использованием ДНКазы-I РНК РВ подвергали электрофорезу в 10% ПААГ, гель окрашивали бромидом этидия и под ультрафиолетовым светом вырезали б-й сегмент РНК. Кусочек геля измельчали, заливали буфером, содержащим 0,5 М ацетата аммония, рН 8,0, 0,1% ДСН и 1 мМ ЭДТА, выдерживали при 37 °C в течение ночи и проводили фе-нольную очистку днРНК гена. РНК преципитировали этанолом, высушивали, растворяли в ТЕ буфере и использовали для получения ДНК-копии с применением в качестве «затравок» статистических гексануклеотидов (НПО «Фермент», Вильнюс). Остальные процедуры — удаление цепей РНК, отжиг цепей ДНК, достройку ДНК до тупых концов осуществляли как описано для генома РВ с 3-м ЭФ-ти-пом РНК. Синтезированную кДНК клонировали в векторной плазмиде pGEM4Z («Promega», США) по тупым концам по SmaI сайту. С этой целью плазмидную ДНК рестрицировали эндонуклеазой Smal в 50 мкл буфера, содержащего 10 мМ трис-HCI, рН 8,0, 20 мМ KCI, 60 мМ i-меркаптоэтанола, в течение ночи при 30 °C. После фенольной депротеинизации и осаждения этанолом, ДНК вектора обрабатывали щелочной фосфатазой CIP («Serva», Германия) для дефосфорили-рования 5/-концов в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCI, рН 8,0, в течение 30 мин. при 37 °C. На следующем этапе ДНК вектора и кДНК смешивали в эквимолярных количествах и соосаждали 2,5 объемами этанола. Осадок растворяли в 3 0 мкл буфера, содержащего 10 мМ трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ МдС12, 10 мМ ДТТ, 0,0025 мМ АТФ и 10 е.а. ДНК-лигазы Т4 (НПО «Фермент», Вильнюс). Реакцию проводили в течение 2-х ч. при комнатной температуре. Трансформацию компетентных клеток E. coli TG1 и отбор рекомбинантных клонов осуществляли как описано выше. Вставки кДНК анализировали с использованием рестриктного анализа и идентифицировали методом молекулярной гибридизации.

3. Синтез ДНК, комплементарных гену VP7 РВ человека, и определение их нуклеотидных последовательностей проводили в рамках совместной работы с И. Н. Бессараб и А. М. Бородиным на базе Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН (ИБХ РАН).

Использовали: AMV и РНазин производства Омутнинского химического заводадезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP), термостабильную ДНК-полимеразу (Гад-полимеразу), эндонуклеазу рестрикции Smal фирмы «Fermentas» («ГосНИИГЕНЕТИКА», Москва) — щелочную фосфатазу (CIP) фирмы «Serva» (Германия) — плазмидную ДНК-вектор pGEM3Z, фаговые векторы М13 mplO и М13 mpll, сик-венс-праймеры и дидезоксинуклеозидтрифосфаты фирмы «Promega» (США).

Для синтеза кДНК и ее амплификации применяли праймеры 5/-ATGTATGGTATTGAATATAC-3/ и 5 7-GGTCACATCATACAATTCTA-З7, синтезированные на основе последовательности гена VP7 ротавируса обезьян iht. SAH и комплементарные консервативным участкам 48−68 п.о. и 1062−1043 п.о., соответственно [135]. Праймеры были синтезированы Грязновым С. М. (ИБХ РАН, Москва) и Черновым И. П. (ФИБХ РАН, Пущино на Оке).

Реакцию кДНК синтеза проводили при 42 °C в течение 60 мин. в 30 мкл смеси следующего состава: 50 мМ трис-HCl, рН 8,3- 0,04 М КС1- 1 мМ ДТТ- 7 мМ МдС12- 20 пмоль каждого праймера- 2,5 е.а. РНазина- 500 мкмоль dNTP- 15 е.a. AMV.

ПЦР (30 циклов) осуществляли в следующем режиме: денатурация при 95 °C в течение 30 сек.- отжиг при 55 °C в течение 1 мин., элонгация цепи при 70 °C в течение 9 мин. Реакционная смесь (50 мкл) содержала 70 мМ трис-НС1, рН 8,8, 16,6 мМ (ЫН4)2304, 6,7 мМ МдС12, 10 мМ^{з-меркаптоэтанола,} 6,7 мкМ ЭДТА, 500 мкмоль сШТР, 50 пмоль каждого праймера, 1−3 е.а. Тад-поли-меразы и 5 мкл продукта первой реакции.

Полноразмерные ДНК-копии, выделенные из 0,9% агарозного геля с использованием электроэлюции, клонировали в плазмидном векторе рСЕМЗг по Бта! сайту, применяя дефосфорилирование 5/-концов линеализованной ДНК вектора как описано выше. Из ре-комбинантной плазмидной ДНК выделяли кДНК обработкой ЕсоЯI и ВатН1 и переклонировали в двух ориентациях в фаговые векторы М13 шрЮ и М13 тр11, используя стандартные подходы [60,61]. Нуклеотидные последовательности нескольких независимых клонов определяли по методу Сэнгера с использованием модификаций, предложенных А. М. Бородиным [10].

Определение аминокислотной последовательности белков на основе анализа первичной структуры генов, их сравнительный анализ с известными аминокислотными последовательностями Л?7 рота-вирусов, а также сравнение нуклеотидных последовательностей синтезированных кДНК, проводили с использованием программы «М1сгоСеп1е» («Вескшап», США).

Создание Б11- и а-ДНК-зондов для дифференциации штаммов РВ человека методом молекулярной гибридизации .

Осуществляли следующую стратегию разработки: — с использованием программы «Мп-СгоСегйе» проводили сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов /Р6 и УР7 РВ разной антигенной специфичности, выбирали наиболее вариабельные у разных штаммов участки последовательностей;

— в той же программе определяли расположение сайтов рестрикции и выбирали наиболее близкие к найденному фрагменту эндо-нуклеазы;

— искомый участок вырезали в реакции рестрикции соответствующими ферментами, проводили электрофорез в 0,9% агарозном геле, ДНК элюировали из геля и клонировали в векторной плазмиде рСЕМ4г по Бта! сайту, используя стандартные процедуры [61];

Применяли эндонуклеазы рестрикции Ш2 (Вэр-бО), ЕсоЯЧ, БтаI и буферные растворы производства НПЦ «Биопол» (Москва).

Определение взи 64- серотипа ротавируса с использованием ПЦР.

Осуществляли стратегию, предложенную воиуеа V. с соавт. [325]. Использовали следующие праймеры, синтезированные в Институте молекулярной биологии РАН:

1. 5 7-СГСАСАТСАТАСААТТСТ — епй9- 3х-концевой.

2. 5/-СИТСТССТСАССАСГТС — st4-специфичный.

3. 5/-ССТТТСААСГТССААСС — б!3-специфичный.

Реакцию обратной транскрипции проводили в 20 мкл смеси с использованием концевого праймера и ревертазы из вируса лейкемии мыши (М-МЬУ) фирмы «Рготеда» (США).

Амплификацию серотипспецифических участков гена УР7 осуществляли в подобранном нами режиме в присутствии 3 мМ МдС12: 94 °C 2 мин.- (94 °С 30 сек.- 55 °C 30 сек.-72 °С 1 мин.) х 35 циклов.

Продукты реакции анализировали в 1,5% агарозном геле относительно Pvu. II фрагментов ДНК фага Л, которые получали в лабораторных условиях.

Серотипспецифические участки кДНК гена VP7 использовали в качестве ДНК-зондов для определения серотиповой принадлежности природных штаммов ротавируса в реакции молекулярной гибридизации .

Молекулярная гибридизация с использованием ДНК-зондов, меченных дигоксигенином (ДИГ).

Препаративные количества специфичных кДНК dRV7-II, dRV6-II, dRV6-I, dRV9-l, используемых в качестве «зондов», получали рестрикцией полилинкера клонирования рекомбинантных плазмид с использованием любой пары рестриктаз, расположенных выше и ниже встроенного фрагмента. Плазмидные ДНК выделяли из биомассы трансформированных клеток E. coli стандартным методом [60,61]. Фрагменты КДНК, специфичные в отношении G3- и С4-серотипов нарабатывали в процессе ПЦР.

Для мечения кДНК и ее выявления применяли коммерческий набор «DNA-digoxigenin labbeling and detecting Kit» («Boehringer Manncheim», Германия), позволяющий вводить dUTP-DIG в состав синтезируемой цепи в процессе мультипраймтрансляции и выявлять меченую ДНК в иммунологической реакции с конъюгатом DIG-AT-р-галактозидаза. Все процедуры проводили согласно инструкции по применению.

РНК ротавирусов для исследования очищали фенольной депро-теинизацией и определяли концентрацию гена методом электрофореза в ПААГ путем визуального сопоставления с известным количеством коммерческой линейной ДНК pUC18.

Для повышения специфичности дифференциации РНК применяли количественный контроль гибридизации, суть которого заключается в титровании анализируемой РНК в последовательности — 1 нг 100 пг — 10 пг — 1 пг.

Реакцию молекулярной гибридизации проводили при 42 0 С либо 50 0 С без формамида, в зависимости от решаемых задач.

Элементы эпидемиологического анализа.

Определяли частоту обнаружения ротавирусов в возрастных группах детей до 14 лет, больных ОКИНЭ. Рассчитывали распределение генетических вариантов РВ по полу и ворасту.

При анализе сезонности РВИ в Н. Новгороде рассматривали не календарный, а эпидемический год — с 1 июля текущего по 30 июня следующего года. Среднемноголетнюю среднемесячную кривую заболеваемости РВИ в 1984;96 гг. рассчитывали в интенсивных показателях на 10 000 населения в возрасте до 3-х лет согласно рекомендаций. За уровень межсезонной заболеваемости принимали среднемесячный показатель [6,45,83]. Использовали данные городского центра СЭН о возрастной структуре населения в Н. Новгороде в 1984;97 гг.

Помесячную частоту выявления РВ рассчитывали в % к итогу эпидемического года. Анализировали и сопоставляли сезонную динамику помесячной выявляемости РВ с колебаниями среднемесячной температуры окружающей среды, показатели которой получали в ГИ-МЕТ БРИС г. Н.Новгорода.

Статистические методы анализа.

Статистическую обработку результатов проводили общепринятым методом расчета средней ошибки (ш) и показателя существенности и вероятности различия (р) по таблице Стьюдента.

Для обработки результатов также применяли методы вариационной статистики, расчет которых проводили с использованием программы для ЭВМ — «ТМЕХ1», входящей в пакет программ.

Медстат", разработанный в Нижегородском медицинском институте им. С. М. Кирова Н.Н.Мокичевым и Е. Д. Пятовой. Проводили проверку гипотезы независимости двух признаков с использованием X2-критерия Пирсона и точного метода Фишера.

Рассчитывали коэффициент корреляции рангов (Р), условием достоверности которого считали превышение коэффициентом своей утроенной ошибки (Р > 3 шр) [45].

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

VI. ВЫВОДЫ.

1. Унифицирован метод эяектрофоретипирования штаммов рота-вируса, включающий оптимизированный бесфенольный способ выделения РНК, стандартизацию условий постановки электрофореза РНК и разработанную классификационную схему электрофоретипов РНК ро-тавируса человека.

2. С использованием оптимизированного метода электрофореза РНК и метода электронной микроскопии подтверждена ротавирусная природа 2618 случаев ОКИ неясной этиологии, зарегистрированных на 14-ти территориях европейской части России в 1984 -1997 гг. Частота обнаружения ротавирусов среди детей с манифестной формой ОКИНЭ составила 29%.

3. Показано, что на фоне вариабельности сегментированного генома ротавируса, отражением которой явилось определение 61-го электрофоретипа РНК, существуют как характерные для отдельных регионов, так и общие для европейской территории России доминирующие генетические варианты.

4. Впервые для территории России показана возможность формирования эпидемического варианта ротавируса, характеризующегося широкой распространенностью, длительной циркуляцией, генетической стабильностью и повышенными вирулентными свойствами, вызвавшего в изучаемый период времени наибольший процент случаев РВГЭ (30,8%).

5. Впервые клонированы в бактериальных векторных системах гены эпидемически значимых для европейской территории России генетических вариантов ротавируса человека. На основе кДНК генов N335, /Р6 и ЧР7 создана и охарактеризована панель ДНК-зондов для выявления и подгрупповой и серотиповой дифференциации ротавирусов методом молекулярной гибридизации.

6. На основании сравнительного анализа нуклеотидной последовательности гена УР7 и соответствующей ей аминокислотной последовательности УР7, определен новый С-серотип ротавируса человека, генетически родственный ротавирусу свиней.

7. По материалам электрофоретипирования РНК и выявления аллелей генов, определяющих подгрупповую и серотиповую специфичность, впервые рассчитано распределение на европейской территории России антигенных типов ротавируса, характеризующееся превалированием вариантов ЗНС1 (55,6%), второй значимостью 31С2 (18,5%) и третьей долей 31 104 (10,4%). Среди ротавирусов СЗ серотипа определены как 3103 (0,7%), так и БИСЗ (6,8%) антигенные варианты.

8. Проведено тринадцатилетнее наблюдение за циркуляцией природных штаммов ротавируса с различными электрофоретипами РНК. Впервые показано существование внутрисезонной смены доминирования, связанной с биологическими свойствами конкретного генетического варианта ротавируса и определяющей особенности сезонных проявлений ротавирусной инфекции.

9. Получены новые данные об особенностях циркуляции рота-вирусов разных антигенных типов, заключающихся в доле вариантов, продолжительности периодов и длительности циклов доминирования. Установлено, что межсезонная смена доминирования антигенного типа ротавируса сопровождается ростом заболеваемости РВГЭ.

10. Охарактеризованы клинические проявления гастроэнтерита, вызванного различными генетическими и антигенными вариантами ротавируса. Получены результаты, подтверждающие возможность связи электрофоретипа РНК со специфической клинической картиной РВГЭ и более высокой вирулентностью вируса. Установлено, что генетические варианты ротавируса 31Ю1 антигенного типа в период доминирования более вирулентны, чем 31Ю4. Впервые отмечено, что при инфицировании ротавирусом 01 серотипа ведущим в определении тяжести заболевания является сидром токсикоза, при 04 эксикоза.

11. В назофаренгиальных секретах больных РВГЭ методом молекулярной гибридизации обнаружена РНК ротавируса, что свидетельствует о его способности инфицировать клетки слизистых оболочек носоглотки и подтверждает ротавирусную природу катаральных явлений при ротавирусной инфекции. Гастроэнтериты, вызванные ротавирусом 31Ю1 антигенного типа характеризовались более интенсивными проявлениями симптомов ОРЗ, при этом у больных в 36,9% случаев наблюдались сопутствующие заболевания органов дыхания.

12. Впервые показано, что распространенность ротавируса группы С на территориях городов европейской части России носит ограниченный характер (1,2% случаев РВГЭ). В то же время, Архангельская область является регионом их более активной циркуляции (34,1% случаев РВГЭ). Ротавирусы группы С по морфологии не отличаются от типичных ротавирусов группы А, характеризуются вариабельностью генома, отсутсвием генетических взаимосвязей с ротавирусами группы А, вызывают острую кишечную инфекцию, клинические проявления которой сходны с типичным РВГЭ.

V.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Настоящая работа посвящена основанной на анализе геномной РНК характеристике генетических и антигенных вариантов ротавируса человека, циркулирующих на территории европейской части Российской Федерации, а также изучению эпидемиологических и клинических особенностей проявления инфекции, вызванной различными вариантами ротавируса. В связи с тем, что в отечественной практике отсутствуют коммерческие тест-системы для дифференциации штаммов ротавируса, существенная часть работы направлена на оптимизацию известных методов РНК-типирования природных штаммов ротавируса и создание собственных ДНК-зондов для их выявления и подгрупповой и серотиповой дифференциации.

В первом разделе исследования представлены результаты электрофоретипирования и изучения генетических взаимосвязей природных штаммов ротавируса человека, циркулирующих на территориях 14-ти городов европейской части России. В 1984;91 гг. и 1995;96 гг. работа проводилась совместно с Н. В. Епифановой.

С целью проведения массовых исследований подобраны оптимальные условия электрофоретипирования РНК ротавирусов. Предложен бесфенольный метод выделения РНК непосредственно из проб стула, основанный на способности ДСН осаждать белковые компоненты смеси в условиях высокой ионной силы раствора при пониженной температуре. Применение такого методического приема сократило сроки проведения исследования и не влияло на конечный выход РНК и ее чистоту в сравнении с фенол-хлороформенной деп-ротеинизацией. Оценка диагностической эффективности оптимизированного метода обнаружения геномной РНК РВ показала 97,6% совпадения с методом ЭМ и в 3% случаев РНК РВ определена в пробах, где идентифицируемые ротавирионы отсутствовали.

Оптимизация метода электрофореза РНК с целью ее типирова-ния включала стандартизацию условий постановки электрофореза концентрации геля, параметров тока, продолжительности электрофореза. Необходимость стандартизации показана по результатам изучения влияния смены условий постановки электрофореза на картину распределения сегментов РНК в ПААГ. Установлено, что сочетание смены буферного раствора и параметров тока существенно меняет относительную электрофоретическую подвижность сегментов внутри классов генов, затрагивая, как правило, 2−3-й и 7−8-й сегменты, но не влияет на электрофоретическую подвижность 10−11-го сегментов. Оптимальными для ЭФ-типирования РНК определены система буферных растворов Лэммли, 10% разделяющий ПААГ и 10 мА/гель в течение 18−20 часов.

Метод электрофореза РНК применен в сочетании с ЭМ в качестве диагностического теста и при изучении ЭФ-типов РНК РВ человека, распространенных на территории европейской части Российской Федерации. При исследовании 9023 проб стула детей с ОКИНЭ, РВ природа заболевания установлена в 29,0% случаев, что позволило сократить число этиологически нерасшифрованных случаев ОКИ.

Получены электрофореграммы РНК 2203 изолятов РВ, определен 61 ЭФ-тип РНК, что еще раз подтвердило широкую вариабельность сегментированного генома РВ. Среди охарактеризованных ЭФ-типов РНК 58 имели профили с распределением сегментов на классы 4−2-3−2 (98,8%), типичным для РВ антигенной группы А. Вариантов распределения, свойственных РВ группы В, не выявлено. Три.

ЭФ-типа РНК характеризовались распределением 4−3-2−2, которое является отличительным признаком РВ группы С (1,2%). Установленная преимущественная циркуляция на европейской территории нашей страны РВ группы, А и низкая выявляемость параротавирусов согласуется с характеристикой популяций РВ, распространенных на территориях других европейских стран.

По относительной электрофоретической подвижности 10−11-го сегментов, 61 ЭФ-тип РНК распределен на 5 электрофорегрупп -" длинные" (78,8%), «короткие» (18,5%), «промежуточные» (0,8%), «широкие» (0,7%) и «сверхдлинные» (1,2%). Установленное нами соотношение популяций РВ с «длинными» и «короткими» ЭФ-типами РНК, равное ориентировочно 4:1, характерно для всех регионов мира. Дифференциация ЭФ-типов РНК на электрофо-регруппы легла в основу составленной классификационной схемы, которая отражает возможное многообразие генетических вариантов РВ человека, циркулирующих на территории европейской части Российской Федерации.

Анализ частоты выявления РВ с различными ЭФ-типами РНК показал, что на фоне многообразия природных штаммов ротавируса существуют доминирующие генетические варианты. Определено 10 превалирующих ЭФ-типов РНК ротавируса, один из которых выявлен в наибольшем числе случаев — 30,8% (3-й ЭФ-тип РНК, согласно классификационной схеме, р < 0,001). По материалам электрофо-ретипирования РНК изучены особенности циркуляции доминирующих генетических вариантов РВ на территориях 14-ти городов европейской части России. Установлено, что на отдельных территориях распространены как характерные только для данного региона, так и общие для многих территорий, варианты вируса. Выявлено 4 широко распространенных на европейской территории России генетических варианта РВ человека — с 1-м, 3-м, 39-м и 35-м ЭФ-типами РНК. При этом популяции РВ, характеризующиеся 3-м ЭФ-типом РНК, выявлялись повсеместно на протяжении всего периода наблюдения и постоянно занимали доминирующее положение. Совместный электрофорез РНК изолятов РВ, собранных на разных территориях, показал стабильность электрофоретических свойств сегментов РНК 3-го ЭФ-типа, что не наблюдалось в случаях РНК с другими картинами распределения сегментов и свидетельствовало о генетической стабильности этого варианта ротавируса. На основании изучения генетических взаимоотношений природных штаммов РВ с одинаковыми ЭФ-типами РНК, доминирующих на территориях разных городов, установлена их однородность в отношении подгрупповой и серотипо-вой принадлежности.

Таким образом, по материалам дифференциации природных штаммов РВ с применением оптимизированного метода электрофореза РНК охарактеризованы популяции ротавируса человека, распространенные на территории европейской части Российской Федерации. Показано разнообразие циркулирующих штаммов, определены общие для европейской территории России генетические варианты ротавируса, один из которых, характеризующийся 3-м ЭФ-типом РНК, в изучаемый период времени вызвал наибольшее число случаев РВГЭ и явился сформировавшимся генетически стабильным эпидемическим вариантом ротавируса человека. Методические разработки, касающиеся оптимизации электрофоретипирования РНК РВ, легли в основу информационно-методических материалов по применению метода электрофореза нуклеиновых кислот (ЭФАНК) в диагностике РВГЭ и дифференциации штаммов РВ.

Следующий раздел работы посвящен клонированию и анализу генома эпидемически значимых вариантов ротавируса человека.

Для целей молекулярного клонирования генома природных штаммов РВ человека был разработан способ очистки РНК от конта-минирующих дезоксирибонуклеиновых кислот с использованием коммерческих препаратов ДНКазы-I в условиях высокой ионной силы раствора. На способ получения очищенной РНК РВ непосредственно из проб стула больных РВГЭ получено авторское свидетельство N 1 448 448, приоритет от 24.02.87 г.

На матрице тотальной РНК 3-го ЭФ-типа РВ человека (изолят 4097) с использованием известного подхода синтезирована кДНК, фрагменты которой клонированы в векторной плазмиде pUC9 и клетках E. coli Z85. В реакции РНК-ДНК блот-гибридизации кДНК идентифицированы с 1-м, б-м и сегментами Ш-го класса генов. В совместной работе с Л. А. Кулаковым и В. Н. Ксензенко на базе ИБФМ РАН проведено определение полной нуклеотидной последовательности синтезированных кДНК.

Анализ полной нуклеотидной последовательности кДНК, имеющей размер 1059 п.н. и гибридизующейся с РНК РВ в области Ш-го класса генов, показал ее гомологию с последовательностью, кодирующей неструктурный белок NS35. С использованием РНК-ДНК блот-гибридизации установлено, что у РВ человека (изолят 4097) этот белок кодируется геномным сегментом 7. кДНК 7-го гена РВ человека с «длинным» ЭФ-типом РНК, названая dRV7-II, была испытана в реакции молекулярной гибридизации с использованием изотопной и дигоксигениновой меток в качестве ДНК-зонда. Установлено, что dRV7-II фрагмент выявляет РНК РВ человека «длинного» и «короткого» ЭФ-типов, РНК РВ обезъян шт. SA11) и РНК РВ телят (шт.Линкольн) и не дает гибридиза-ционного сигнала с РНК вируса гепатита, А и полиовируса, что свидетельствует о специфичности dRV7-II фрагмента в отношении ротавирусного генома. Чувствительность фрагмента кДНК при выявлении гомологичных и гетерологичных штаммов РВ была различной и колебалась в пределах 1−10 пг для РНК «длинного» ЭФ-типа и 10−100 пг для РНК «короткого» ЭФ-типа. Использование дигоксиге-ниновой системы мечения и выявления ДНК позволило достичь чувствительности детекции РНК, сопоставимой с радиоизотопной меткой. Сравнительный анализ метода молекулярной гибридизации с использованием dRV7-II фрагмента, меченного дигоксигенином, с методами ЭМ и ЭФАНК показал большую чувствительность метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот (МГНК) при выявлении РВ в клиническом материале. При этом получены результаты, свидетельствующие о перспективности использования dRV7-II фрагмента для выявления РНК РВ в водных концентратах.

Таким образом, в результате генно-инженерных работ создан штамм E. coli N ВКМ CR317D, несущий рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую dRV7-II фрагмент — универсальный ДНК-зонд для выявления РНК различных ЭФ-типов РВ человека и животных методом молекулярной гибридизации. Приоритетность создания ДНК-зонда подтверждена авторским свидетельством N 17 414 111, приоритет от 26.12. 1989 г.

Кроме dRV7-II фрагмента, в процессе клонирования генома РВ с 3-м ЭФ-типом РНК, была получена полноразмерная копия гена VP6, имеющая размер 1365 п.н. Сравнение первичной структуры кДНК с известными последовательностями 6-го гена РВ разных серологических подгрупп — SI (шт. SA11, шт. 1076), Sil (uiT.Wa), ни SI ни Sil (шт.Н-2) и SI/SII (iiiT.FI-14), показало наличие 98,7% гомологии с последовательностью гена VP6 шт-Wa, определяющей специфичность второй сероподгруппы. В областях нуклео-тидной последовательности, кодирующих антигенные детерминанты, наблюдалось 100% гомологии, что позволило сделать заключение о принадлежности РВ человека изолята 4097 ко второй (Sil) антигенной подгруппе, а фрагмент кДНК назвать dRV6-II. Штамм Е. coli, несущий рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую фрагмент dRV6-II, депонирован в ВКМ ИБФМ РАН под N CR-316D.

Изучение способности полноразмерного dRV6-II фрагмента гибридизоваться с РНК различных ЭФ-типов выявило его неэффективность в качестве диагностического «зонда», так как фрагмент не выявлял РНК «короткого» ЭФ-типа, и недостаточную специфичность в качестве дифференцирующего «зонда» — dRV6-II фрагмент давал гибридизационный сигнал с РНК «длинного» ЭФ-типа ротави-руса обезьян шт. SA11 (SI подгруппа). В связи с этим на следующем этапе работы с использованием программы «MicroGene» («Beckman», США) был проведен выбор наиболее вариабельного у РВ разных сероподгрупп участка последовательности гена VPб. Определен участок 3/-концевой области последовательности, находящийся между 753−1035 нуклеотидами и включающий регион D и часть региона Е, участвующих в определении подгрупповой специфичности штамма РВ. Такой фрагмент кДНК, выделенный с использованием эндонуклеазы рестрикции FNU2, уже в условиях низкой жесткости постановки реакции молекулярной гибридизации, не давал неспецифических реакций с гетерологичными РНК. Фрагмент кДНК, названный dRV6-lIz, был субклонирован в плазмиде pGEM4Z и клетках Е. col i TGI и депонирован в ВКМ ИБФМ РАН под N ВКМ CR-354D. Приоритетность создания ДНК-зонда для специфического выявления РВ Sil сероподгруппы подтверждена патентом Российской Федерации N 2 031 949, приоритет от 11.12. 1991 г.

На матрице б-го сегмента РНК генома РВ с «коротким» ЭФ-ти-пом РНК (изолят 2175) с использованием статистических &bdquo-затравок" синтезирована кДНК, которую клонировали в клетках E. coli TGI с использованием векторной плазмиды pGEM4Z. Испытания такого фрагмента кДНК в реакции молекулярной гибридизации с РНК «короткого» ЭФ-типа природного РВ человека, РНК культивируемого РВ человека SI сероподгруппы (шт-DS-l) и РНК «длинных» ЭФ-типов показали специфичность фрагмента в отношении последовательностей, определяющих SI подгруппу ротавируса. Штамм бактерий E. coli TGI, несущий рекомбинантную плазмидную ДНК pVR6-I депонирован в ВКМ ИБФМ РАН под N ВКМ CR-367D. Приоритетность создания ДНК-зонда для выявления РНК РВ SI сероподгруппы подтверждена патентом Российской Федерации N 2 064 502, приоритет от 01.09. 1992 г.

Эпидемическая значимость РВ с 3-м ЭФ-типом РНК послужила основанием выбора изолята 3718 для анализа гена VP7, определяющего G-серотиповую специфичность штамма. Также проведен анализ гена VP7 изолята РВ 1565, характеризующегося 9-м «широким» ЭФ-типом РНК и выделенного от новорожденного ребенка с бессимптомной формой инфекции. Синтез кДНК, ее амплификация и определение полной нуклеотидной последовательности были проведены в процессе совместной работы с И. Н. Бессараб и А. М. Бородиным на базе ИБХ РАН.

Сравнительный анализ определенных нуклеотидной и соответствующей ей аминокислотной последовательностей VP7 исследуемых изолятов РВ с известными последовательностями VP7 14-ти G-cepo-типов показал значительное сходство РВ изолята 3718 со шт-Wa -93,2% гомологии нуклеотидной и 95,4% гомологии аминокислотной последовательностей. При этом, регионы А, В и С, участвующие в образовании нейтрализующих эпитопов, имели только по одной аминокислотной замене в сравнении с последовательностями, определяющими специфичность Gl-серотипа, что позволило сделать вывод о принадлежности природного штамма РВ человека с 3-м ЭФ-типом РНК к Gl-серотипу вируса. Анализ регионов А, В и С аминокислотной последовательности VP7 изолята РВ с 9-м «широким» ЭФ-типом РНК выявил полное совпадение региона В и наличие двух аминокислотных замен в регионе С в сравнении с аналогичными последовательностями гена VP7 РВ свиней шт. УМ и наличие одной аминокислотной замены в регионе В в сравнении с РВ свиней iht. OSU, что свидетельствует о возможном родстве РВ изолята 1565, выделенного от новорожденного с бессимптомной формой РВИ, с РВ свиней. Однако, последовательность аминокислот в регионе A VP7 изолята 1565 отличалась от региона, А РВ свиней на 7 аминокислотных остатков, что не позволило отнести их к одному G-серотипу вируса. Среди проанализированных последовательностей VP7 известных G-серотипов РВ мы не обнаружили гомологичной региону, А последовательности VP7 РВ 1565, на основании чего сделан вывод о существовании нового G-серотипа ротавируса.

ДНК-копии гена VP7 изолятов РВ 3718 и 1565 были сохранены в составе векторной плазмиды pGEM3Z и клетках E. coli TG1 и названы dRV9−1 и dRV9−15, соответственно. dRV9-l фрагмент был испытан в качестве ДНК-зонда для специфического выявления РНК-последовательности, определяющей G1 серотип РВ. Полноразмерный dRV9-l фрагмент, меченный дигоксиге-нином, эффективно гибридизовался с РНК 3-го ЭФ-типа и давал неспецифическую следовую гибридизацию с РНК «короткого» и «широкого» ЭФ-типов. В связи с этим были проведены работы по повышению специфичности G1-ДНК-зонда. На основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей гена VP7 РВ разных G-ce-ротипов и установления сайтов рестрикции для эндонуклеаз в программе «MicroGene» был определен и выделен фрагмент кДНК, наиболее вариабельный у штаммов разной G-серотиповой специфичности, включающий регионы, кодирующие аминокислотные последовательности районов, А и В VP7. Данный субфрагмент кДНК в условиях постановки реакции молекулярной гибридизации при 50 0 С без фор-мамида не давал фоновых реакций с гетерологичными РНК, что свидетельствовало о его специфичности в отношении нуклеотидной последовательности, определяющей G1 серотип ротавируса. Субфрагмент кДНК размером 503 п.н. сохранен в составе векторной плазмиды pGEM4Z и клетках E. coli TG1 и назван dRV9-lz. Аналогичная работа проведена и в отношении последовательности гена VP7 изолята РВ 1565, субфрагмент которой назван dRV9−15z.

С целью определения принадлежности природных штаммов РВ человека к G3 и G4 серотипам на матрице генома РВ обезьян hit. SAII (G3 серотип) с использованием праймера, специфичного в отношении последовательности, определяющей G3 серотип РВ, подобраны оптимальные условия типирования РНК в процессе полиме-разной цепной реакции. ПЦР была использована для типирования природных штаммов РВ в сочетании с наработкой серотипспецифи-ческих фрагментов кДНК. Фрагмент кДНК размером 374 п.н., специфичный в отношении последовательности, определяющей G3 серотип, получен на матрице РНК РВ шт. SA11. Фрагмент кДНК размером 583 п.н., специфичный в отношении последовательности, определяющей G4 серотип РВ, получен на матрице РНК 42-го ЭФ-типа природного РВ человека. Испытание фрагментов кДНК, комплементарных последовательностям, определяющим Gl, G3 и G4 серотип РВ, в реакции молекулярной гибридизации с гетерологичными кДНК и РНК РВ показало отсутствие перекрестных реакций, что обосновало применимость синтезированных последовательностей в качестве серотипс-пецифичных ДНК-зондов.

Таким образом, в результате проведенного анализа нуклеотидной и аминокислотной последовательностей VP7 природных штаммов РВ человека установлено, что эпидемически значимый для территории европейской части России генетический вариант РВ с 3-м ЭФ-типом РНК относится к Sil подгруппе и Gl-серотипу вируса. Выявлен вариант РВ человека, генетические характеристики которого позволяют говорить о новом G-серотипе ротавируса, имеющем генетическое родство с РВ свиней. Генноинженерные разработки завершились созданием панели ДНК-зондов для выявления РВ с различными ЭФ-типами РНК в клиническом материале и объектах внешней среды и подгрупповой и серотиповой дифференциации ротавиру-сов методом молекулярной гибридизации, что расширяет методическую базу эпиднадзора за РВИ и дает возможность более углубленного изучения антигенной вариабельности РВ.

Созданные ДНК-зонды для специфического выявления РВ SI, Sil, Gl, G3 и G4 серологических типов были применены для дифференциации природных штаммов РВ с различными ЭФ-типами РНК, циркулировавших на территориях европейской части России в разные периоды времени. Изучение гибридизационных свойств РНК 170 изолятов РВ показало наличие определенных корреляций между ЭФ-ти-пом РНК и наличием аллелей генов, определяющих антигенные свойства вируса. Так, все исследованные РНК с «длинным» профилем миграции сегментов доминирующих генетических вариантов РВ содержали аллели гена VP6 Sil сероподгруппы, а с «коротким» ЭФ-типом РНК — SI. РНК «длинных» и «широких» минорных ЭФ-типов, 5−6-й сегменты которых имеют широкий разбег в ПААГ, что характерно для РВ животных, не гибридизовалась с Sil-ДНК-зондом, но давала гибридизационный сигнал с «зондами» SI и G3. Установлено также, что РНК «длинных», как доминирующих, так и минорных ЭФ-типов, характеризующаяся низкомигрирующим 9-м геном, дает выраженный гибридизационный сигнал с Gl-ДНК-зондом, что позволяет отнести штаммы с такими профилями миграции сегментов к Gl-серотипу вируса. Сообщений о существовании корреляции между относительной электрофоретической подвижностью 9-го сегмента РНК и серотипом РВ в зарубежной литературе мы не встретили. Можно предположить, что наличие такой взаимосвязи является отличительным признаком генетических вариантов РВ, циркулирующих на европейской территории России. РНК «длинных» ЭФ-типов, имеющая компактную миграцию сегментов HI-го класса не давала гиб-ридизационного сигнала с dRV9-lz фрагментом, но проявляла избирательные свойства по отношению к G3 и G4 ДНК-зондам. Установлено, что РНК 39-го доминирующего ЭФ-типа эффективно гибридизовалась с G3 «зондом», а 42-го и 51-го — с «зондом» G4. Кроме того, РНК 42-го и 51-го ЭФ-типов в процессе ПЦР с серотипспеци-фическими праймерами давала фрагмент кДНК размером 583 п.н., что еще раз подтвердило принадлежность генетических вариантов с такими профилями миграции сегментов к G4 серотипу РВ. При анализе гибридизационных свойств РНК различных ЭФ-типов нами проанализировано от 1-го до 25-ти изолятов с одинаковыми ЭФ-типами РНК, собранных на разных территориях в разные периоды их циркуляции. При этом не обнаружено случаев различий в гибридизационных свойствах с подгрупповыми и серотиповыми ДНК-зондами у РНК с одинаковыми профилями миграции сегментов.

На основе результатов электрофоретипирования природных штаммов РВ и изучения их подгрупповой и серотиповой принадлежности, проведенной на основе анализа генов /Р6 и УР7, рассчитано распределение антигенных типов РВ, распространенных на территории европейской части Российской Федерации. При этом, долю популяций 02 серотипа рассчитывали по количеству изолятов РВ с «короткими» ЭФ-типами РНК, основываясь на опыте изучения природных штаммов РВ в мире. Установлено, что генетические варианты РВ группы А, относящиеся к БЫ подгруппе, имели «длинный» ЭФ-тип РНК и составили 72,5%, Б1 подгруппы — 19,5%. Среди популяций РВ, характеризующихся наличием аллелей гена УРб, определяющих специфичность подгруппы, 18,5% генетических вариантов РВ имели «короткий» ЭФ-тип РНК, 1% - «длинные» и «широкие» профили миграции сегментов. Популяции РВ С1 серотипа определены в 55,6% случаев, в2 — 18,5%, 03 — 7,5%, — 10,4%. При этом, среди РВ вЗ серотипа обнаружены как 31 (0,7%), так и 311 (6,8%) варианты. Распределение антигенных типов, свидетельствующее о преимущественной циркуляции на европейской территории России генетических вариантов РВ с 31 101 антигенными свойствами, характерно для всех регионов мира. В то же время, в нашем случае на третьем месте по значимости находятся варианты РВ, имеющие аллели гена УР7, определяющие специфичность С4 серотипа, что соответствует распределению антигенных вариантов РВ на территориях стран центральной Европы и отличается от ряда территорий США, Австралии и Индии, где на третьем месте по значимости находятся варианты СЗ серотипа. Полученные результаты могут быть полезны при разработке стратегии вакцинопрофилактики РВГЭ на территории европейской части России.

Третий раздел настоящего исследования посвящен изучению эпидемиологических и клинических проявлений ротавирусной инфекции, вызванной различными генетическими и антигенными вариантами РВ.

По материалам г. Н.Новгорода изучены особенности многолетней циркуляции ротавируса, вызывающего манифестные формы РВГЭ. Наблюдения за РВИ в Н. Новгороде проводили в течение 13-ти эпид-периодов в 1984;97 гг. При исследовании 6412 проб стула детей в возрасте до 14 лет ротавирусы обнаружены в 26,8+0,6% случаев (15,3 — 40,5% в разные эпидпериоды). Болели преимущественно дети в возрасте 0−2 года (93,7%), мальчики болели в 1,6 раза чаще, чем девочки. При этом, связи между полом и возрастом болевших и генетиским вариантом РВ нами не выявлено. Обнаружены лишь тенденции к преимущественному инфицированию детей разного возраста тем или иным генетическим вариантом РВ, которые, однако, наблюдались на разных этапах циркуляции РВ с различными ЭФ-типами РНК, относящихся к одному серотипу вируса, и, по всей вероятности, связаны с общими закономерностями развития эпидп-роцесса РВИ, определяемыми инфекционно-иммунологическими отношениями популяций вируса и восприимчивого хозяина.

На следующем этапе работы впервые по материалам тринадцатилетних наблюдений с применением методов молекулярной генетики проведен анализ особенностей циркуляции ротавирусов с различными ЭФ-типами РНК. С целью изучения сезонных особенностей циркуляции ротавирусов и установления возможной роли отдельных генетических вариантов в развитии эпидпроцесса РВИ рассчитана сред-недвенадцатилетняя среднемесячная кривая годовой динамики заболеваемости РВГЭ, позволившая говорить о зимне-весенней сезонности инфекции в г. Н.Новгороде. Предполагается, что активизация эпидпроцесса РВИ в осенние месяцы связана со снижением температуры воздуха и суммарной солнечной радиации, которое, способствуя длительному сохранению инфекционности ротавирионов в окружающей среде и накоплению их критической массы, выступает как фактор, определяющий активизацию механизмов передачи возбудителя. Сопоставление 13-ти ежегодных кривых помесячной частоты обнаружения РВ выявило различия в сезонности РВИ в отдельные эпидпериоды. Установлено существование трех типов динамики помесячной частоты выявления РВ — зимне-весенней, зимней и весенней. Изучение взаимосвязи помесячной частоты выявления РВ с колебаниями среднемесячной температуры окружающей среды и анализ численности популяции восприимчивых лиц позволил предположить, что весенняя сезонность РВИ в г. Н.Новгороде может быть связана с совокупным влиянием как природных факторов, определяющих выживаемость вируса во внешней среде, так и со снижением численности популяции восприимчивых лиц. В то же время, существование зимне-весенней динамики помесячной выявляемости РВ, характеризующейся двумя пиками положительной детекции возбудителя, требовало другого объяснения. Электрофоретипирование штаммов РВ и изучение генетических взаимоотношений доминирующих типов вируса показали, что в эпидпериоды, характеризующиеся зимне-весенней динамикой помесячной частоты обнаружения возбудителя, наблюдалась внутрисезонная смена превалирующего генетического варианта, которая, по всей вероятности, использовалась вирусом в качестве механизма поддержки его активной циркуляции. Такая смена доминирования не всегда отражала смену антигенного варианта РВ, но всегда приводила к доминированию РВ с 3-м ЭФ-типом РНК. Предположено, что особенности циркуляции РВ третьего электрофо-ретического типа могут быть связаны с биологическими свойствами этого генетического варианта, такими как устойчивость к воздействию факторов внешней среды, иммуногенность и вирулентность. Последнее было подтверждено тем, что генетический вариант РВ с 3-м ЭФ-типом РНК определял более интенсивный симптомо-комплекс РВГЭ и наиболее часто вызывал тяжелое течение заболевания. Существование внутрисезонной смены доминирующего генетического варианта ротавируса, связанной с его биологическими свойствами и определяющей особенности сезонных проявлений РВ инфекции показано нами впервые.

Охарактеризованы особенности межсезонной смены доминирующего генетического варианта, не отражающей смены антигенного типа ротавируса. Смена генетических вариантов вируса, относящихся к одному антигенному типу, происходила постоянно, при этом длительность непрерывного доминирования РВ с одинаковым ЭФ-типом РНК не превышала 2-х лет, после чего наблюдалась их широкая коциркуляция. Установлено, становление генетически стабильного варианта ротавируса, от начала его появления до периода доминирования, может происходить постепенно в течение 5-ти сезонов циркуляции. Длительность непрерывной циркуляции одного генетического варианта РВ в условиях кодоминирования может составить 8 эпидпериодов, что показано для варианта РВ с 3-м ЭФ-типом РНК, который исчез из популяций только через 12 лет наблюдения. Получены новые данные, расширяющие представления об особенностях циркуляции РВ разных серологических типов, различающихся формой циркуляции, долей вариантов, продолжительностью периодов доминирования и длительностью циклов доминирования. Установлено, что РВ С1 серотипа характеризуются постоянной циркуляцией с долей вариантов, достигающей 90%, имеют продолжительность периода домирования, равную 3−4 эпидсезонам с периодичностью в 5−7 эпидемических лет, что соответствует средним циклам подъемов вызываемой заболеваемости. РВ в2 с «короткими» ЭФ-типами РНК также характеризуются постоянной циркуляцией, но имеют низкую долю вариантов (0,5−39,2%), сверхкороткий период доминирования (0,5 эпидсезона) с малыми циклами активной циркуляции (1−3 года). РВ вЗ серотипа, выявляясь как минорные, имели эпизодическую форму активной циркуляции, характеризующуюся сверхкоротким периодом доминирования (0,5 эпидсезона). Единственный за 13-ти летний период наблюдения подъем заболеваемости РВИ, обусловленный РВ СЗ серотипа, позволяет предполагать длинный или сверхдлинный циклы доминирования, или нерегулярный характер активной циркуляции. РВ С4 серотипа имели период доминирования, равный 4-м эпидсезонам с уровнем, не превышающем 50%. Однако, для установления цикличности доминирования РВ С4 серотипа требуются дальнейшие наблюдения.

Прослежены последовательные сдвиги во времени от одного доминирующего варианта РВ к другому, отражающие одновременный антигенный сдвиг, в связи с многолетней динамикой заболеваемости РВИ. Показано существование межсезонной смены доминирования антигенного типа ротавируса, сопровождающейся ростом заболеваемости РВГЭ, которая происходила с периодичностью в 4−5 эпидемических лет. Установление факта влияния смены доминирующего антигенного типа РВ на интенсивность развития эпидпроцесса РВИ свидетельствует о практической значимости контроля за циркуляцией природных штаммов РВ.

Таким образом, анализ многолетней циркуляции ротавирусов с разными ЭФ-типами РНК, относящихся к разным О-серотипам, показал наличие превалирующих генетических вариантов РВ, возможность длительного доминирования некоторых из них, существование межсезонной смены превалирующего ЭФ-типа РНК, отражающей и не отражающей смену серотипа РВ и возможность внутрисезонной смены доминирования, связанной с биологическими свойствами конкретного генетического варианта РВ. Полученные новые знания об особенностях многолетней циркуляции конкретных генетических вариантов РВ разных С-серотипов расширяют представления о внутренних механизмах развития эпидпроцесса РВИ и свидетельствуют о практической значимости контроля за циркуляцией штаммов РВ с целью качественного прогнозирования тенденций к росту заболеваемости РВИ.

Проведено изучение клинических проявлений 317 случаев «чистых» РВГЭ среди детей 6 мес.-З года, вызванных 10-ю генетическими вариантами вируса четырех различных С-серотипов. Оценку проявлений основных клинических симптомов — диареи, рвоты и лихорадки проводили по двум позициям — максимальной выраженности и продолжительности. Анализировали частоту регистрации тяжелых, среднетяжелых и легких форм заболевания.

Диарейный синдром был ведущим при РВГЭ, вызванных различными генетическими вариантами РВ и не отличался ни частотой стула, ни его продолжительностью. Различия отмечены лишь в характере диареи — у детей, инфицированных штаммами 51-го и 42-го электрофоретических типов (ЗНС4 антигенный тип, характеризующийся относительно низкомигрирующим 4-м сегментом), чаще наблюдался водянистый обильный стул в первые 3 дня заболевания. Достоверные типоспецифические различия установлены в интенсивности и продолжительности рвоты. При РВГЭ, вызванных генетическими вариантами вируса, относящимися к ЗНС1 антигенному типу, интенсивная (5 раз и более) и продолжительная (более 3-х дней) рвота наблюдалась достоверно наиболее часто (р < 0,05). При этом, у наибольшего числа детей (50%) многократная рвота была ассоциирована с РВ 3-го электрофоретического типа (р < 0,001). В случаях инфицирования РВ с «короткими» ЭФ-типами РНК (Б1С2 антигенный тип) и 42-м, 51-м ЭФ-типами РНК (ЗНС4 антигенный тип) многократная рвота практически отсутствовала, либо была однократной. Выраженность лихорадки у детей, выделявших РВ с различными ЭФ-типами РНК, была относительно одинаковой. В то же время, при инфицировании штаммами РВ 3-го электрофоретического типа у достоверно большего числа детей установлена продолжительная лихорадка, которая могла держаться до 10 дней, что не наблюдалось при других генетических вариантах вируса (р < 0,05). Полученные результаты свидетельствуют, что выраженность клинических симптомов гастроэнтерита, вызванного разными генетическими вариантами ротавируса может значительно колебаться в пределах нозологической формы и подтверждают возможность связи ЭФ-типа РНК со специфической клинической картиной РВГЭ и более высокой вирулентностью вируса.

Анализ частоты регистрации различных форм РВГЭ у больных, выделявших РВ с доминирующими ЭФ-типами РНК показал, что тяжелое течение заболевания могло наблюдаться при инфицировании различными вариантами ротавируса. В то же время, наиболее часто среди других, тяжелые формы РВГЭ наблюдались у детей, выделявших РВ с 3-м ЭФ-типом РНК, когда случаев легкого течения заболевания не обнаружено (р < 0,001). Статистическая достоверность связи между частотой тяжелых форм РВГЭ и 3-м ЭФ-типом РНК была подтверждена путем проверки независимости двух признаков с использованием критерия X2-Пирсона и точного метода Фишера. Большая выраженность основных клинических симптомов гастроэнтерита и более частое возникновение тяжелых форм РВГЭ при инфицировании штаммами РВ с 3-м ЭФ-типом РНК могут свидетельствовать о повышенных вирулентных свойствах генетического варианта ротавируса, доминировавшего в изучаемый период времени на территории европейской части России.

Представляло интерес установление возможной связи между клиническими особенностями РВГЭ и антигенными свойствами рота-вирусов. Показано, что гастроэнтериты, вызванные генетическими вариантами РВ, имеющими аллели гена УР7 С4 серотипа, характеризовались меньшей выраженностью проявлений основных клинических симптомов и достоверно чаще протекали в легкой форме, что свидетельствует о меньшей вирулентности РВ серотипа. Отмечается, что тяжесть течения заболевания при инфицировании штаммами разных С-серотипов определялась разными факторами. У детей, выделявших РВ с 1-м, 3-м и 34-м ЭФ-типами РНК (С1-серотип) и с «короткими» профилями миграции сегментов (С2-серотип), ведущим в определении тяжести заболевания явился синдром токсикоза.

Кроме лихорадки наблюдались и другие его проявления — адинамия, слабость, головные боли. Явление обезвоживания наблюдалось редко — в 5,8% и 8,3% случаев, соответственно. В то же время, тяжелые и среднетяжелые формы гастроэнтерита при инфицировании РВ с 42-м и 51-м ЭФ-типами РНК (С4-серотип), наблюдаемые значительно реже, чем при других вариантах РВ, определялись явлениями эксикоза. Обезвоживание первой, реже второй степени, отмечено практически у всех больных с тяжелой и среднетяжелой формами заболевания. Складывалось впечатление, что различия в определяющих тяжесть течения заболевания факторах связаны с принадлежностью штаммов РВ к разным С-серотипам. Однако, наблюдения за РВИ в эпидпериод 1996;97 гг., когда доминирующее положение занял вариант РВ с 46-м ЭФ-типом РНК (С1-серотип), гастроэнтериты характеризовались наличием обильной диареи, нередко сопровождавшейся эксикозом I или 11-й степени. Генетические варианты РВ с 46-м и 42-м, 51-м ЭФ-типами РНК относятся к разным С-серотипам, но все характеризуются низкомигрирующим 4-м сегментом РНК. Эти наблюдения позволили предположить, что характер диареи и факторы, определяющие тяжесть течения заболевания могут быть связаны не с С-, а с Рсеротиповой специфичностью штамма РВ, определяемой 4-м сегментом РНК. Несомненно, для установления достоверной связи между основным синдромом ГЭ и Р-серотипом РВ требуются дальнейшие наблюдения.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлены различия в интенсивности проявлений основных клинических симптомов РВГЭ и частоте тяжелых форм заболевания при инфицировании генетическими вариантами РВ разных С-серотипов, свидетельствующие о различиях в их вирулентных свойствах. Однако, полученные результаты, по-всей вероятности, представляют лишь научный интерес и определение ЭФ-типа РНК или серотипа РВ не имеет клинического значения, так как отдаленных последствий для здоровья перенесенное заболевание не вызывает независимо от инфицировавшего варианта РВ и подходы к лечению РВГЭ являются патогенетическими .

Проведенный анализ историй болезни детей с подтвержденным диагнозом РВГЭ показал, что у 79,1% больных наблюдались симптомы ОРЗ, которые проявлялись в виде разной степени гиперемии дужек, миндалин, зернистости задней стенки глотки. У 14,6% больных кроме симптомов ОРЗ диагносцированы такие заболевания, как катаральный отит, бронхит, бронхопневмония и пневмония. При этом установлено, что при гастроэнтеритах, вызванных РВ с 1-м и 3-м ЭФ-типами РНК Gl серотипа, частота регистрации сопутствующих заболеваний органов дыхания составила 36,9%. У детей, выделявших РВ с 42-м и 51-м ЭФ-типами РНК симптомы ОРЗ наблюдались реже (р < 0,05) и проявлялись лишь в умеренной гиперемии дужек.

Высокий процент регистрации у больных РВГЭ симптомов поражения верхних дыхательных путей и отсутствие убедительных данных об их этиологической природе послужило основанием для проведения исследований по обнаружению РНК РВ в смывах носа и глотки методом молекулярной гибридизации с использованием 3 2 Р-РНК SAH. При исследовании 38 проб назофаренгиальных смывов от больных с подтвержденным диагнозом РВГЭ и 46 проб от больных с ОКИНЭ РНК РВ обнаружена в 76,3% и 34,7% случаев, соответственно. В контрольных группах здоровых детей, детей с ОРЗ и ОКИ, в фекалиях которых обнаружены аденовирусы и мелкие неидентифицированные вирусы, результаты были отрицательными. Анализ историй болезни лиц с положительной реакцией на РНК РВ в носоглоточных смывах в 100% случаев показал наличие катаральных явлений. Обнаружение РНК РВ в секретах носа и глотки и совпадение результатов обнаружения РНК с наличием симптомов поражения респираторного тракта свидетельствуют о возможности транскрипции генома РВ в клетках слизистых оболочек верхних дыхательных путей и подтверждают ротавирусную природу катаральных явлений при РВГЭ.

Проведен комплексный анализ случаев гастроэнтерита, вызванного атипичными ротавирусами группы С. Установлено, что по морфологии РВ группы С не отличаются от РВ группы А, характеризуются вариабельностью генома и отсутствием генетических взаимосвязей с типичными РВ группы А, могут вызывать как спорадические случаи заболевания, так и вспышки инфекции, клинические проявления которой сходны с типичными РВГЭ.

Распространенность РВ группы С, вызывающих манифестные формы РВГЭ, на территориях городов европейской части России в целом носит ограниченный характер, в то же время Архангельская область является регионом их более интенсивной циркуляции. Обнаружение на территории России региона активной циркуляции РВ группы С имеет принципиальное значение для выбора методов лабораторной диагностики РВГЭ и эпидемиологического контроля за инфекцией на данной территории.

Суммируя вышесказанное можно заключить, что в результате молекулярно-генетических исследований с использованием оптимизированного метода электрофоретипирования РНК и созданных ДНК-зондов для подгрупповой и серотиповой дифференциации штаммов ротавируса охарактеризованы генетические и антигенные варианты возбудителя РВГЭ, распространенные на территории европейской части России, рассчитано их распределение, получены новые данные об особенностях многолетней циркуляции и существовании внутрисезонной смены генетического и межсезонной смены антигенного вариантов ротавируса, определяющих особенности некоторых проявлений эпидпроцесса РВИ, показано наличие связи между специфической клинической картиной РВГЭ и генетическими и антигенными свойствами вируса, установлена низкая частота выявления и неравномерность распространенности на европейской территории России параротавирусов. Полученные результаты работы в целом расширяют существующие представления о возбудителе небактериальных гастроэнтеритов — ротавирусах и открывают новые возможности изучения механизмов распространения РВ инфекции на моле-кулярно-генетическом уровне.